CC BY
10УДК 616.24:-002.54:616.24-002.5-004:616.24-002.5-003.94
ОЦЕНКА ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕГОЧНОЙ ТКАНИ ПРИ ФИБРОЗНО-КАВЕРНОЗНОМ ТУБЕРКУЛЕЗЕ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИОВЫДЕЛЕНИЯ
Кальфа М. А.
Кафедра патологической анатомии с секционным курсом, Медицинская академия имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ имени В. И. Вернадского», 295051, бульвар Ленина, 5/7, Симферополь, Россия
Для корреспонденции: Кальфа Маргарита Алексеевна, кафедра Медицинской академии имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ имени В. И. Вернадского», г. Симферополь, Россия, e-mail: rita.kalfa@mail.ru
For correspondence: Margarita Kalfa, Assistant Professor of the Department of Pathological Anatomy with the sectional course, Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia, e-mail: rita.kalfa@mail.ru
Information about the author:
Kalfa M. A. http://orcid.org/0000-0002-7179-3402
РЕЗЮМЕ
В работе были изучены особенности экспрессии иммуногистохимического маркера пролиферации Ki-67 в ткани легких больных ФКТ в зависимости от активности бактериовыделения. Была выявлена неоднородность изменений митотически активных клеток, таких как фибробласты, лимфоциты и клеток макрофагальной природы, что может свидетельствовать о динамическом изменении пролиферативной активности стромальных клеточных элементов легочной ткани и соответственно повышении ее реактивности в условиях ФКТ в зависимости от активности бактериовыделения.
Ключевые слова: фиброзно-кавернозный туберкулез; бактериовыделение; иммуногистохимия.
ASSESSMENT OF THE PROLIFERATIVE ACTIVITY OF THE PULMONARY TISSUE AT FIBROUS-CAVERNOUS TUBERCULOSIS AS FUNCTION OF BACTERIAL ACTIVITY
Kalfa M.A.
Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia
SUMMARY
The features of expression of the immunohistochemical marker of Ki-67 proliferation in lung tissues of patients with FCT have been studied as function of the activity of bacterial excretion. Heterogeneity of changes in mitotically active cells, such as fibroblasts, lymphocytes and macrophage cells, has been revealed, which may indicate a dynamic change in the proliferative activity of stromal cell elements of lung tissue and, accordingly, an increase in its reactivity in FCT as function of the activity of bacterial excretion.
Key words: fibrous-cavernous tuberculosis; bacterial excretion; immunohistochemistry.
Туберкулез (ТБ) представляет собой одну из первостепенных проблем мирового сообщества [1]. Так, по данным отчета ВОЗ, около трети населения земного шара инфицированы Mycobacteria tuberculosis [1; 2]. Несмотря на интенсивные биомедицинские исследования последних двух десятилетий и совершенствование диагностических мероприятий, терапевтическая тактика туберкулезной инфекции не претерпевала значительных изменений последние 30 лет [3]. Результатом неэффективной терапии в комплексе с изменчивостью самой микобактерии явилось возникновение мультирезистентных форм заболевания и увеличение числа пациентов с деструктивными формами, в том числе фиброзно-кавернозно-го (ФКТ) ТБ [4; 5; 6]. Следствием негативного патоморфоза туберкулезного процесса, свя-
занного с неизбежным прогрессированием фиброзной трансформации легочной ткани, является неизбежное паллиативное хирургического вмешательство, приводящее к инвали-дизации и снижению качества жизни пациентов, но не купирующее само заболевание [7].
Одним из основных патогенетических факторов формирования фиброзного слоя каверны и пневмосклероза является проли-феративная активность и дифференциров-ка фибробластов с последующей интенсификацией их синтетической активности [8; 9]. При этом остаются неустановленными механизмы активации и повышения реактивности межклеточного матрикса, а также возможного потенцирующего этот процесс влияния клеток локальной иммунной системы.
Цель: определить критерии пролифератив-ной активности в очаге специфического воспаления и окружающей легочной ткани при ФКТ в зависимости от активности бактериовыделения.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Материалом для морфологического исследования явились участки ткани легких, взятые у 83 пациентов, прооперированных по поводу ФКТ легких.
Все больные были разделены на 2 группы:
1 группа - 52 пациента с ФКТ и активным бактериовыделением (МБТ+).
2 группа - 31 больной с ФКТ без бактериовы-деления (МБТ-).
Контрольную группу составили 10 человек, умерших от патологии, не связанной с заболеванием легких.
В дополнение к стандартному гистологическому исследованию с использованием окраски гематоксилином и эозином проводилось иммуногистохимическое (ИГХ) исследование по стандартизованной методике с использованием маркера Ki-67 (DakoCytomation). Система визуализации EnVisionTM FLEX+, Mouse, High pH (Link), Code K8012 на автостейнере фирмы DAKO [10].
Просмотр и фотографирование осуществляли на микроскопе OLYMPUS CX-41.
Морфометрическое исследование включало подсчет позитивных клеток в 10 полях зрения при увеличении 200 с помощью программы ImageJ.
Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке для параметрических критериев с использованием программы STATISTICA 10.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При анализе пролиферативной активности стромальных клеток легочной ткани пациентов контрольной группы, умерших от патологии, не связанной с бронхо-легочным повреждением, были выявлены единичные позитивно окрашенные клетки с ядерной экспрессией, локализованные в бронхо-ассоции-рованной лимфоидной ткани (1,8±0,1), а также в фибробластах межальвеолярных перегородок - 0,6±0,08. Максимальная интенсивность реакции определялась в базальных клетках мерцательного эпителия крупных и мелких бронхов 6,7±0,4 и 5,8±0,8 соответственно.
Оценка экспрессии Ki-67 в условиях ФКТ независимо от активности бактериовыделения позволила выявить статистически значимое по отношению к контрольной группе (р<0,05) повышение пролиферативной активности клеток стромального и эпителиального про-
исхождения. При этом отмечалась неравномерность экспрессии по отношению к очагу кавернозной деструкции легочной паренхимы.
При рутинном гистологическом исследовании были выделены следующие зоны: стенка каверны (пиогенный, грануляционный и фиброзный слой), дренирующий бронх, пе-рикавернозная зона с участками дистелекта-за, ателектаза и панацинарной эмфиземы.
Пиогенный слой, представленный казеоз-ными массами во всех наблюдениях, характеризовался отсутствием пролиферативной активности каких-либо клеточных элементов. При этом единичные позитивно окрашенные клетки визуализировались в зоне перехода в специфическую грануляционную ткань, демонстрирующую максимальную интенсивность экспрессии Ю-67. При сопоставлении с данными стандартного морфологического исследования установлено, что клетки, находящиеся в активной фазе клеточного цикла, представляют собой клетки воспалительной инфильтрации - лимфоциты, макрофаги и фибробла-сты формирующейся соединительной ткани.
Грануляционная ткань представляла собой разрастания новообразованных сосудов капиллярного типа, расположенных в сети тонких новообразованных коллагеновых волокон с большим количеством Ю-67 позитивных фибро-бластов и лимфоцитов в группе с МБТ- (рис.1).
Следует отметить наличие позитивно экс-прессирующих Ю-67 высокоактивных макрофагов, расположенных в большом количестве на фоне значительного числа клеток лимфоидного происхождения и фибробластов в зоне перехода специфических грануляций в фиброзный слой у пациентов с активным бактериовыделением. При этом гигантские многоядерные клетки Пи-рогова-Лангханса не проявляли митотической активности ни в одном из наблюдений (рис. 2).
Количество всех клеток с ядерной экспрессией на 100 клеток в 10 полях зрения составило 43,2±2,4 в группе ФКТ с активным бактериовыделением и 35,5±3,2 - МБТ-.
Стабилизация пролиферативной активности наблюдается в зоне фиброзной капсулы каверны. Преобладающей клеточной популяцией в группе МБТ- в указанной зоне являются негативно окрашенные маркером Ю-67 фиброциты, представляющие собой веретеновидные клетки с небольшим удлиненным ядром, лежащие среди обширных полей оптически плотных коллагено-вых волокон. В толще фиброзного слоя определяется диффузная слабо выраженная воспалительная инфильтрация (7,2±2,1), представленная в основном клетками лимфоидного происхождения, а также умеренно- и слабоактивными
Рис.1. МБТ-. ИГХ реакция с маркером Ю-67 в стенке фиброзной каверны. Негативная экспрессия в казеозном некрозе (КН). В грануляционной ткани лимфоциты и фибробласты с позитивным ядерным окрашиванием, интактные клетки Пирого-ва - Лангханса. Ув. 40х
Рис.2. МБТ+. ИГХ реакция с маркером Ю-67 в стенке фиброзной каверны. Негативная экспрессия в казеозном некрозе (КН). В грануляционной ткани лимфоциты, фибробласты и макрофаги с позитивным ядерным окрашиванием, интактные клетки Пирогова-Лангханса (ПЛ). Ув. 40х
макрофагами с ядерной экспрессией маркера пролиферативной активности. Количество позитивно окрашенных активных фибробластов минимально и варьирует в пределах 5,1±0,3.
Исследование биоптатов легких пациентов с активным бактериовыделением позволило установить статистически значимое в отношении группы ФКТ-МБТ- увеличение популяции позитивно экспрессирующих Ю-67 фибробла-стов и клеток воспалительной инфильтрации (26,8±1,9, р<0,05). При этом активность иммун-ноэкспрессии лимфоцитов и макрофагов нарастала пропорционально в зависимости от степе-
ни разволокнения и интенсификации некро-биотических процессов в фиброзной капсуле.
Зона дренирующего бронха, визуализирующаяся во всех случаях ФКТ, отличалась при морфологическом исследовании интенсификацией альтеративных и экссудативных процессов у пациентов с клинически зафиксированной экскрецией МЛиЬегси1о$1$. Анализ пролиферативной активности стромальных компонентов в стенке бронха показал, что количество позитивных Ю-67 клеток было сопоставимо с зоной специфических грануляций и составило 32,8±2,5.
При оценке пролиферативной активности клеточных элементов дренирующего бронха без бактериовыделения позитивно окрашенные клетки визуализировались преимущественно в эпителиальной выстилке и в фи-бробластах окружающей ткани (18,3± 1,9).
В перибронхиальной бронхо-ассоцииро-ванной лимфоидной ткани гистологически фиксировались лимфоидные фолликулы со светлыми герминативными центрами. При сопоставлении с ИГХ реакцией с Ю-67 установлено, что все они состоят из клеток с позитивной ядерной экспрессией и являются митотически активными. После пролиферации лимфоцитов в центральной зоне лимфоидного агрегата происходит их перераспределение в окружающие ткани, в связи с чем единичные позитивно окрашенные элементы определяются в периферической зоне фолликула и циркулярно располагаются в прилежащей легочной паренхиме.
В перибронхиальных пространствах и в целом в перикавернозной зоне определялись множественные очаги гранулематозно-го воспаления, состоящие как из активных, так и неактивных очаговых скоплений клеток макрофагального происхождения, количество и состав клеток экспрессирующих Ю-67 существенно отличалось в зависимости от наличия и обширности центрально расположенной зоны казеозного некроза.
Сравнительный анализ пролиферативной активности клеточных элементов гранулем позволил установить, что митотически активными клетками в активных гранулемах являлись лимфоциты с примесью единичных макрофагов, локализующиеся в виде демаркационного вала вокруг казеозных масс. Количество таких клеток составило 18,3±3,4.
Неактивные гранулемы характеризовались резким уменьшением количества клеток воспалительной инфильтрации и имели два типа морфологических проявлений. Первый вид характеризовался центрально расположенными клетками Пирогова - Лангханса (одной или несколькими), окруженными эпителиоидными клетками
с пенистой цитоплазмой и рассеянными среди них лимфоцитами. В таких гранулемах позитивная ядерная экспрессия определялась в лимфо-идных клетках и расположенных по периферии единичных активных фибробластах (рис.3).
Следует отметить, что такие гранулемы, как правило, имели тенденцию к конгломерации и именно они встречались статистически чаще при МБТ+.
Второй тип неактивных гранулем характеризовался зачастую тотальным отсутствием клеток макрофагального происхождения либо единичными центрально расположенными гигантскими многоядерными клетками Пирогова-Лангханса. Важно отметить, что данные гранулемы характеризовались низкими показателями пролиферативной активности клеток воспалительного ряда и абсолютным превалированием позитивно окрашенных активных фибробла-стов. Прилежащие ткани инфильтрированы позитивно окрашенными лимфоцитами (рис.4).
Состояние перикавернозной зоны в условиях ФКТ вне очагов специфического воспаления характеризовалось чередованием участков коллабирования альвеол и их эмфизематозного расширения и неравномерностью экспрессии маркера Ki-67, интенсивность которой прямо коррелировала с выраженностью экссудативных реакций, представленных очагами серозной и/или казеозной пневмонии.
В случаях МБТ- определялось статистически значимое уменьшение числа клеток с митотической активностью вследствие стабилизации склеротических процессов и превалирования неактивных фиброцитов в полях сформированной фиброзной ткани.
Минимальное количество Ki-67 клеток фиксировалось в эмфизематозно расширенных участках независимо от активности бак-териовыделения. При этом единичные позитивные клетки представляли собой альвеолярные макрофаги, свободно лежащие в просвете расширенных альвеол. Кроме того, определялись немногочисленные позитивные альвеолоциты, фиксированные в альвеолярных нишах и активные фибробласты в истонченных межальвеолярных перегородках.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
ВЫВОДЫ
1. Анализ ИГХ реакций с маркером Ki-67 свидетельствует о динамическом изменении пролиферативной активности клеток легочной ткани и соответственно повыше-
Рис. 3. МБТ+. ИГХ реакция с Ю-67 в неактивных гранулемах. Ядерная экспрессия в лимфоцитах и периферических локализованных фибробластах. Негативно окрашенные клетки Пирогова-Лангханса (ПЛ). Ув. 40х
Рис. 4. МБТ-. ИГХ реакция с Ю-67 в рубцующейся гранулеме. Ядерная экспрессия в периферически расположенных фибробластах. Окружающая ткань легкого инфильтрирована лимфоцитами с позитивной ядерной экспрессией. Ув. 40х
нии ее реактивности в условиях ФКТ в зависимости от активности бактериовыделения.
2.Минимальные показатели митотиче-ской активности регистрируются при отсутствии бактериовыделения и проявляются в основном в клетках лимфоидного происхождения и активных фибробластах.
3. В случаях активного бактериовыделения происходит интенсификации пролиферации макрофагов и лимфоцитов непосредственно в очагах кавернозной деструкции и дренирующего бронха, перифокальных участках се-розной/казеозной пневмонии. Параллельно с этим отмечается существенное нарастание популяции активно пролиферирующих фи-бробластов и эндотелиоцитов сосудов, что
является показателем активного ремоделиро-вания легочной ткани, в том числе в участках неспецифической воспалительной реакции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Giovanni Delogu, Michela Sali, Giovanni Fadda. The Biology of Mycobacterium Tuberculosis Infection. Mediterr J Hematol Infect Dis. 2013;5(1):e2013070. doi: 10.4084/MJHID.2013.070
2. World Health Organization. Global tuberculosis control WHO report - 2015. December 28, 2015. Available at: http://apps.who.int/iris/bitstream/ 10665/191102/1/9789241565059_eng.pdf?ua=1
3. Christelle Vluggen,1 Karine Soetaert, eds. Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis complex in Brussels, 2010-2013. PLoS One. 2017; 12(2): e0172554. doi: 10.1371/journal.pone.0172554
4. Li N, Liao X, Chen L, eds. Antibiotic susceptibility patterns of Mycobacterium tuberculosis isolates from Guizhou province of China against 13 antituberculosis drugs. Microb Drug Resist. 2015;21:292-6. http://dx.doi. org/10.1089/mdr.2014.0094
5. Catherine Vilcheze, Travis Hartman, eds. Mycobacterium tuberculosis is extraordinarily sensitive to killing by a vitamin C-induced Fenton reaction. Nat Commun. 2013;4:1881. doi: 10.1038/ncomms2898
6. Juan Carlos Palomino, Anandi Martin. Drug Resistance Mechanisms in Mycobacterium tuberculosis. Antibiotics. 2014;(3):317-340; doi:10.3390/ antibiotics3030317
7. Mireia Coscolla, Sebastien Gagneux. Consequences of genomic diversity in Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 2014;26(6):431-444 https://doi.org/10.1016/j.smim.2014.09.012
8. Anne-Laure Ban"uls, Adama Sanou, eds. Mycobacterium tuberculosis: ecology and evolution of a human bacterium. Journal of Medical Microbiology 2015;64:1261-1269. DOI 10.1099/jmm.0.000171
9. Robyn S. Leea, Nicolas Radomsk, eds. Population genomics of Mycobacterium tuberculosis in the Inuit. PNAS. 2015;112(44):13609-13614 https://doi. org/10.1073/pnas.1507071112
10. Dabbs D.G. Diagnostic immunohistochemistry. London: Churchill Livingstone; 2006.
REFERENSES
1. Giovanni Delogu, Michela Sali, Giovanni Fadda. The Biology of Mycobacterium Tuberculosis Infection. Mediterr J Hematol Infect Dis. 2013;5(1): e2013070. doi: 10.4084/MJHID.2013.070
2. World Health Organization. Global tuberculosis control WHO report - 2015. December 28, 2015. Available at: http://apps.who.int/iris/bitstre am/10665/191102/1/9789241565059_eng.pdf?ua=1
3. Christelle Vluggen,1 Karine Soetaert, eds. Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis complex in Brussels, 2010-2013. PLoS One. 2017;12(2): e0172554. doi: 10.1371/journal.pone.0172554
4. Li N, Liao X, Chen L, eds. Antibiotic susceptibility patterns of Mycobacterium tuberculosis isolates from Guizhou province of China against 13 antituberculosis drugs. Microb Drug Resist. 2015;21:292-6. http://dx.doi. org/10.1089/mdr.2014.0094
5. Catherine Vilcheze, Travis Hartman, eds. Mycobacterium tuberculosis is extraordinarily sensitive to killing by a vitamin C-induced Fenton reaction. Nat Commun. 2013;(4): 1881. doi: 10.1038/ncomms2898
6. Juan Carlos Palomino, Anandi Martin. Drug Resistance Mechanisms in Mycobacterium tuberculosis. Antibiotics. 2014;(3):317-340; doi:10.3390/ antibiotics3030317
7. Mireia Coscolla, Sebastien Gagneux. Consequences of genomic diversity in Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 2014;26(6):431-444 https://doi.org/10.1016/j.smim.2014.09.012
8. Anne-Laure Ban"uls, Adama Sanou, eds. Mycobacterium tuberculosis: ecology and evolution of a human bacterium. Journal of Medical Microbiology 2015;64:1261-1269. DOI 10.1099/jmm.0.000171
9. Robyn S. Leea, Nicolas Radomsk, eds. Population genomics of Mycobacterium tuberculosis in the Inuit. PNAS. 2015;112(44):13609-13614 https://doi. org/10.1073/pnas.1507071112
10. Dabbs D.G. Diagnostic immunohistochemistry. London: Churchill Livingstone; 2006.
