CC BY
27
УДК 616.24-002.54:612.017:577.27 https://doi.org: 10.20538/1682-0363-2019-1-190-200
Иммунофенотип макрофагальной популяции при фиброзно-кавернозном туберкулезе легких
Голубинская Е.П., Филоненко Т.Г., Кубышкин А.В., Ермола Ю.А., Кальфа М.А., Геращенко А.В., Крамарь Т.В.
Медицинская академия имени С.И. Георгиевского, Крымский федеральный университет (КФУ) имени В.И. Вернадского
Россия, Республика Крым, 295051, г. Симферополь, бульвар Ленина, 5/7 РЕЗЮМЕ
Цель исследования: изучение иммунофенотипа макрофагальной популяции и механизмов их векторного перераспределения при фиброзно-кавернозном туберкулезе легких.
Материалы и методы. Материалом для исследования явились фрагменты стенки каверны и перикавернозной легочной ткани прооперированных по поводу фиброзно-кавернозного туберкулеза (ФКТ) легких (n = 163). Все пациенты были разделены на две основные группы (с активным бактериовыделением (МБТ+, n = 84) и клиническим абациллированием (МБТ-, n = 79)) для проведения иммуногистохимического исследования с панелью маркеров: макрофагов и гистиоцитов - CD68; сосудистого фактора роста А - VEGF-A; Т-хелперов CD4, цитотоксических Т-лимфоцитов CD8.
Результаты. При анализе экспрессии маркера CD68 установлена популяционная неоднородность макрофагов в зависимости от интенсивности цитоплазматической реакции функциональной активности с различными локализационными и количественными характеристиками: высокоактивные (тип 1), умеренно активные (тип 2) и слабоактивные (тип 3). На основании реакции с сосудистым фактором ростом A определено, что клетки VEGF+ соответствуют слабоактивным макрофагам CD68+ и локализуются на границе перехода специфической грануляционной ткани в фиброзный слой, перикавернозной зоне и интактной легочной ткани со статистически значимым преобладанием у пациентов с МБТ- (р < 0,05). Независимо от активности бактериовыделения число клеток VEGF+ в зоне лимфоидных фолликулов прямо коррелирует с количеством макрофагов CD68+ в перикавернозной зоне (R = 0,68) и обратно - с числом VEGF+ диффузно рассеянных клеток в фиброзной капсуле (R = макрофагов 0,75). При этом CD68+/VEGF+ визуализируются в зоне CD8+ Т-лимфоцитов, а CD68+/VEGF- - в зоне скоплений клеток CD4+. Такой характер корреляционной взаимосвязи свидетельствует о перераспределении макрофагов во второй тип, обладающих ремоделирующим действием на окружающие ткани при потенцирующем участии клеток лимфоидной популяции.
Ключевые слова: фиброзно-кавернозный туберкулез, макрофаги, иммунофенотип, иммунитет, им-муногистохимия.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии финансирования при проведении исследования.
Соответствие принципам этики. Исследование одобрено локальным этическим комитетом при Медицинской академии имени С.И. Георгиевского, КФУ имени В.И. Вернадского (протокол № 11 от 23.10.1017).
Н Голубинская Елена Петровна, e-mail: missive@mail.ru.
Для цитирования: Голубинская Е.П., Филоненко Т.Г., Кубышкин А.В., Ермола Ю.А., Кальфа М.А., Геращенко А.В., Крамарь Т.В. Иммунофенотип макрофагальной популяции при фиброзно-кавер-нозном туберкулезе легких. Бюллетень сибирской медицины. 2019; 18 (1): 190-200. https://doi.org: 10.20538/1682-0363-2019-1-190-200.
УДК 616.24-002.54:612.017:577.27 https://doi.org: 10.20538/1682-0363-2019-1-190-200
Immunophenotype of the macrophage population in fibrous, cavernous pulmonary tuberculosis
Golubinskaya E.P., Filonenko T.G., Kubyshkin A.V., Yermola Yu.A., Kalfa M.A., Gerashchenko A.V., Kramar T.V.
Medical Academy named after S.I. Georgievsky, Crimean Federal University (CFU) named after Vernadsky 5/7, Lenin Blv, Simferopol, 295051, Republic of Crimea, Russian Federation
ABSTRACT
Objective: to study the immunophenotype of the macrophage population and the mechanisms of their vectorial redistribution in fibrous cavernous pulmonary tuberculosis.
Materials and methods. The material for the study was fragments of the fibrous cavern wall and pericavernous lung tissue of the dead or surgical patients diagnosed with fibrous cavernous tuberculosis (n = 163). All patients were divided into 2 main groups: patients with active bacteria excretion (MTB+, n = 84) and patients with clinical abacillation (MTB-, n = 79) for immunohistochemistry with a panel of markers for: macrophages and histiocytes - CD68; vascular growth factor A - VEGF-A; T-helpers - CD4, and T-cytotoxic lymphocytes - CD8.
Results. Following the analysis of CD68 expression, the population heterogeneity of macrophages was revealed depending on the intensity of the cytoplasmic reaction, functional activity, localization and quantitative characteristics. Three groups were identified: highly active, moderately active and weakly active. Based on the reaction with vascular growth factor A, it was determined that VEGF+ cells correspond to weakly active CD68+ macrophages and are located on the border between the specific granulation tissue and fibrous layer as well as in the pericavernous zone and intact lung tissue with a statistically significant predominance in patients with MTB- (p < 0.05). Regardless of the scope of bacterial secretion, the number of VEGF+ cells in the lymphoid follicle zone directly correlates with that of CD68+ macrophages in the pericavernous zone (R = 0.68) and indirectly correlates with the number of diffusely scattered VEGF+ cells in the fibrous capsule (R = -0.75). In the meantime, CD68+/VEGF+ are visualized in the zone of CD8+ T-lymphocytes, and CD68+/VEGF - in the zone of CD4+ cell clusters. Such correlation indicates the redistribution of macrophages into type 2, which has a remodeling effect on the surrounding tissues with the potentiating participation of lymphoid cells.
Key words: fibrous cavernous pulmonary tuberculosis, macrophages, immunophenotype, immunity, immunohistochemistry.
Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.
Source of funding. The authors state that they received no funding for the study.
Compliance with the principles of ethics. The study was approved by the local ethics committee at the Medical Academy named after S.I. Georgievsky, CFU named after Vernadsky (Protocol No. 11 of 23.10.1017).
For citation: Golubinskaya E.P., Filonenko T.G., Kubyshkin A.V., Yermola Yu.A., Kalfa M.A., Gerashchenko A.V., Kramar T.V. Immunophenotype of the macrophage population in fibrous, cavernous pulmonary tuberculosis. Bulletin of Siberian Medicine. 2019; 18 (1): 190-200. https://doi.org: 10.20538/1682-03632019-1-190-200.
ВВЕДЕНИЕ
Неуклонный рост числа пациентов с различными формами туберкулезной инфекции, в том числе в ассоциации с ВИЧ-инфекцией, вызвал бум научных исследований в направлении иммунологии туберкулеза [1, 2]. Достоверно установлена взаимосвязь прогрессирования альтеративно-экс-судативных реакций и уровня иммунодефицита по мере уменьшения количества клеток CD4+ [3, 4]. Однако в условиях длительно протекающего туберкулезного процесса без коморбидной патологии отмечается формирование иммунопатологических состояний. Ряд зарубежных исследователей предполагают, что вторичная иммунологическая недостаточность при туберкулезе может быть детерминирована непосредственно Mycobacterium tuberculosis (МБТ) путем инициирующего воздействия на дендритные и другие антигенпрезентирующие клетки, в частности макрофаги, что запускает каскадный цикл выброса цитокинов, хемокинов и других активных веществ, изменяющих соотношение провоспалительных и противовоспалительных механизмов [5, 6].
В экспериментальных работах in vitro установлен факт популяционной функциональной неоднородности макрофагов и выделены два основных фенотипа. Считается, что макрофаги первого типа (М1) инициируют воспалительную реакцию, проявляя высокую цитотоксическую и бактерицидную активность и поддерживая ТЬ1-зависи-мый иммунный ответ. В то же время клетки М2 участвуют в реструктуризации межклеточного матрикса за счет активизации межклеточных взаимодействий с фибробластами и эндотелио-цитами, приводя к разрастанию соединительной ткани и неоангиогенезу в очаге поражения [7-9].
Наличие данных о полиморфизме популяции макрофагов позволяет предположить, что последующая цепь клеточных взаимодействий и их синтетической активности приводит к формированию гиперчувствительности замедленного типа и необратимому ремоделированию легочной паренхимы с развитием деструктивных изменений в виде формирования полости распада и массивной диссеминации патогена [10]. Именно изучение функциональных особенностей макрофагов, их координации с другими клеточными элементами системы местной защиты легких (потенцирующее либо блокирующее воздействие на процессы кол-лагенообразования, неоангиогенез, сурфактант-ная система) может позволить составить персональный макрофагальный профиль больного с возможностью оценки эффективности терапии либо прогрессирования заболевания. В связи с
чем целью нашего исследования явилось изучение иммунофенотипа макрофагальной популяции и механизмов их векторного перераспределения при фиброзно-кавернозном туберкулезе (ФКТ).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования явились фрагменты стенки каверны и перикавернозной легочной ткани прооперированных по поводу ФКТ легких (n = 163). Все пациенты были разделены на группы: группа 1 - ФКТ легких с активным бактериовыделением (МБТ+), n = 84; группа 2-ФКТ легких с клиническим абациллированием (МБТ-), n = 79. В качестве контрольной группы для сравнения морфологических показателей были использованы фрагменты легких 30 больных, умерших от патологии, не связанной с заболеваниями легких (инфаркт миокарда, острое нарушение мозгового кровообращения). Критерии включения пациентов в исследование: возраст 18-65 лет, отрицательные клинико-лабораторные данные наличия коморбидной патологии (вирусных гепатитов В, С и ВИЧ), обострения хронических заболеваний других органов и систем, информированное согласие.
Для стандартного гистологического исследования фрагменты стенки каверны, перикаверноз-ной зоны и макроскопически интактной легочной ткани фиксировались в 10%-м нейтральном формалине с последующей парафинизацией и изготовлением серийных срезов толщиной 4-5 мм. Визуализация патологических изменений осуществлялась путем окраски гематоксилином и эозином [11].
Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование проводили по стандартизованной методике с использованием серийных парафиновых срезов толщиной 3-5 мкм, помещенных на адгезивные стекла, покрытые полизином (Menzel-Glaser, Германия) и реактивов компании Dako (Дания). ИГХ панель включала в себя следующие антитела: маркер макрофагов и гистиоцитов, кластер диф-ференцировки 68, макросиалин - CD68 (клон KP1), маркер сосудистого фактора роста А VEGF-A (клон VG1), маркер кластера дифференцировки лимфоцитов Т-хелперов CD4 (клон 4В12), маркер кластера дифференцировки лифоцитов Т-цито-токсических CD8 (клон С8/144В). Система визуализации EnVisionTMFLEX на автостейнере фирмы Dako.
Количественная оценка позитивных клеток проводилась с учетом зонального распределения (зона казеозного некроза, специфическая грануляционная ткань, фиброзный слой, перикаверно-
зная зона, дренирующий бронх, интактная легочная ткань) и характера взаимодействия с другими структурными элементами ткани легкого. Оценку количества клеток проводили в 10 полях зрениях при увеличении 200.
Интенсивность экспрессии макросиалина (CD68) оценивали полуколичественным методом на основании выраженности окраски и количества гранул в цитоплазме по следующей схеме: слабая (мембранная экспрессия со слабым диффузным окрашиванием цитоплазмы и рассеянным небольшим количеством зерен), умеренная (равномерно расположенные зерна в цитоплазме на фоне неравномерной мембранной реакции) и выраженная (интенсивная цитоплазматическая окраска с компактным расположением зерен).
Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли с помощью светового микроскопа Olympus CX-41, Olympus digital camera C5050 zoom. Морфометрическая обработка полученных данных проводилась с помощью лицензионного программного обеспечения ImageJ.
Статистическая обработка данных выполнена с использованием программного пакета Statistica for Microsoft Windows, version 10.0. (StatSoft Inc., США). Данные представлены в виде M ± SD, где SD - стандартное отклонение. Статистический анализ включал построение вариационных рядов количественных данных, определение нормальности распределения вариационных рядов с использованием критерия Колмогорова - Смирнова, вычисление среднего арифметического значения, среднеквадратического отклонения, ошибки средней величины, коэффициента вариации и величины отклонения показателя от контроля в
процентах. Статистическая значимость различий сравниваемых величин определялась при помощи однофакторного дисперсионного анализа, для сравнения двух независимых групп применяли двухвыборочный критерий Стъюдента. Для оценки статистической взаимосвязи рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В процессе рутинного гистологического исследования установлено, что макрофагальная популяция имеет структурные и количественные особенности в зависимости от приближенности к очагу деструкции. Выделено несколько микроскопически идентифицируемых видов макрофагов, имеющих различную локализацию и функциональную активность: альвеолярные и эпителиоидные макрофаги, пенистые клетки, гигантские многоядерные клетки Пирогова - Ланг-ханса. При анализе экспрессии маркера СЭ68 и в образцах УБОБ легких изучаемых групп зафиксировано наличие стойкого диффузного окрашивания в пиогенном слое.
При оценке клеточной экспрессии указанных маркеров установлено динамическое уменьшение количества СЭ68+ макрофагов по мере удаления от очага некроза с пиковыми показателями в грануляционной ткани - 143,45 ± 5,27 (ФКТ МБТ+) и 117,32 ± 3,03 (ФКТ МБТ-). В прилегающей зоне эмфиземы 9,16 ± 0,45. При этом в случаях ФКТ МБТ- регистрировалась аналогичная динамика со статистически значимыми количественными межгрупповыми отличиями как относительно контрольной группы, так и ФКТ МБТ+ (рис. 1).
ГП МБТ+ MBT+
I—I МБТ-— MBT-
Рис. 1. Распределение макрофагов CD68+ во фрагментах легочной ткани при фиброзно-кавернозном туберкулезе
в зависимости от активности бактериовыделения Fig. 1. Distribution of CD68+ macrophages in the fragments of the lung tissue under fibrous cavernous tuberculosis
depending on the scope of bacterial excretion
В зоне перехода пиогенного слоя в зону специфических грануляций фиксировалось абсолютное превалирование высоко- и умеренно активных СЭ68+ клеток независимо от активности бакте-риовыделения. В то же время в обеих группах слабоактивные клетки, как правило, располагались на границе перехода грануляционной ткани в фиброзный слой и соответствовали, в том чис-
ле, верифицированным гистологически пенистым клеткам и малым эпителиоидным клеткам.
Данная клеточная популяция с нечеткой мембранной экспрессией, слабым диффузным окрашиванием цитоплазмы и немногочисленными рассеянными зернами составляла одну четверть всех позитивных макрофагов в группе ФКТ МБТ+ (табл. 1).
Т а б л и ц а 1 Т a b l e 1
Количественные характеристики популяции макрофагов в зависимости от интенсивности реакции с маркером CD68, M ± SD Quantitative characteristics of the macrophage population depending on the intensity of the cytoplasmic reaction with CD68, M ± SD
Зона Zone Mycobacterium tuberculosis + Mycobacterium tuberculosis - Контроль Control
С W У M В H Всего Total С W У M В H Всего Total Всего Total
Пиогенный слой Pyogenic layer +++ +/- 23.7 ± 0.03
Грануляционная ткань Granulation tissue 33,50 ± 2,18 42,82 ± 3,04* 67,13 ± 1,93* 143,45 ± 7,01* 48,65 ± 1,13* 28,22 ± 0,97# 40,22 ± 1,08*# 117,09 ± 7,07*# 23,7 ± 0,03
Фиброзный слой Fibrous layer 37,48 ± 2,03* 30,51 ±1,63 54,12 ± 2,01* 122,11 ± 5,79* 29,99 ± 0,41# 12,89 ± 0,08*# 32,71 ± 0,71# 75,59 ± 4,16*# 23,7 ± 0,03
Дренирующий бронх Draining bronchus 22,04 ± 1,01 21,36 ± 0,08 59,64 ± 2,21* 103,04 ± 4,69* 35,68 ± 3,22*# 30,08 ± 2,21# 18,68 ± 0,04*# 84,44 ± 4,74*# 23,7 ± 0,03
Дис-/ателектаз Dis-/atelectasis 19,08 ± 0,05 29,32 ± 1,01 38,34 ± 2,02* 86,74 ± 3,18* 24,21 ± 0,33 22,35 ± 0,12# 18,36 ± 0,11*# 64,92 ± 2,71*# 23,7 ± 0,03
Эмфизема Emphysema 3,91 ± 0,03* 1,98 ± 0,01* 3,27 ± 0,01* 9,16 ± 0,49* 3,95 ± 0,24* 2,04 ± 0,13* 3,11 ± 0,11* 9,10 ± 0,74* 23,7 ± 0,03
Активная гранулема Active granuloma 5,42 ± 0,03* 8,05 ± 0,23* 45,09 ± 1,43* 58,56 ± 2,72* 3,49 ± 0,32* 7,72 ± 0,09* 37,51 ± 1,16* 48,72 ± 2,31* 23,7 ± 0,03
Неактивная гранулема Inactive granuloma 13,16 ± 0,03* 4,01 ± 0,04* 10,09 ± 0,76* 27,26 ± 1,10* 9,27 ± 0,34* 2,11 ± 0,02* 6,94 ± 0,26*# 18,32 ± 0,02*# 23,7 ± 0,03
Интактная легочная ткань Intact lung tissue 21,78 ± 0,03 17,23 ± 0,36* 12,24 ± 0,21* 51,23 ± 2,63* 10,89 ± 1,11*# 10,28 ± 0,56*# 9,02 ± 0,12* 30,19 ± 1,29*# 23,7 ± 0,03
Примечание. C — слабоактивные макрофаги, У — умеренно активные макрофаги, В — высокоактивные макрофаги; +++— выраженная реакция, +/--слабая реакция.
'■различие по отношению к группе контроля; # различие по отношению к группе с активным бактериовыделением (р < 0,05).
Note. C-weakly active macrophages, M — moderately active marcophages, H — highly active macrophages; +++--pronounced
reaction, +/--weak reaction.
'statistically significant difference as opposed to the control group; # statistically significant difference as opposed to the group with intense bacterial excretion (р < 0.05).
При анализе экспрессии СБ68 у пациентов с клиническим абациллированием данные клеточные соотношения варьировались в зависимости от наличия либо отсутствия пиогенного слоя. Так, у пациентов с повышенной реактивностью (неравномерные наложения казеозных масс на внутренней стенке каверны) третью часть всех макрофагов
составляли слабоактивные. Однако у пациентов с двухслойной каверной количество высоко- и слабо активированных клеток в большинстве случаев выравнивалось (соотношение 1 : 1) за счет стабилизации экссудативно-альтеративных процессов.
В результате анализа ИГХ реакции с маркером УБОБ-Л в стенке каверны установлена
стойкая диффузная окраска казеозного некроза. зультате чего нами было определено два имму-Цитоплазматическая экспрессия зафиксирована нофенотипа макрофагов: тип 1 (CD68+/VEGF-) и в клетках гистиоцитарного происхождения, в ре- тип 2 (CD68+/VEGF+) (табл. 2).
Т а б л и ц а 2 Т a b l e 2
Количественные характеристики иммунопозитивных VEGF-A и макрофагов CD68 по отношению к очагу специфического
воспаления, M ± SD
Quantitative characteristics of immunopositive VEGF-A and CD68 macrophages with relation to the focus of specific
inflammation, M ± SD
Зона Zone Mycobacterium tuberculosis + Mycobacterium tuberculosis - Контроль Control
VEGF-A CD68 VEGF-A CD68 VEGF-A CD68
Пиогенный слой Pyogenic layer +++ +++ +/- +/- 10,02 i 0,19 23,67 i 1,30
Грануляционная ткань Granulation tissue 33,50 i 1,03* 143,45 i 7,01* 43,12 i 1,12* 117,31 i 7,08*# 10,02 i 0,19 23,67 i 1,30
Фиброзный слой Fibrous layer 38,01 i 1,15* 122,11 i 5,79* 29,41 i 0,83* 75,71 i 4,17*# 10,02 i 0,19 23,67 i 1,30
Дренирующий бронх Draining bronchus 35,54 i 1,87* 103,05 i 4,69* 84,69 i 3,51*# 84,69 i 4,75*# 10,02 i 0,19 23,67 i 1,30
Дис-/ателектаз Dis-/atelectasis 42,12 i 1,01 86,74 i 3,19* 47,24 i 1,82* 64,92 i 2,71*# 10,02 i 0,19 23,67 i 1,30
Эмфизема Emphysema 8,01 i 0,82 9,16 i 0,45* 7,30 i 0,38 9,10 i 0,74* 10,02 i 0,19 23,67 i 1,30
Интактная легочная ткань Intact lung tissue 42,51 i 1,49* 51,24 i 2,63* 29,75 i 1,01*# 30,19 i 1,30# 10,02 i 0,19 23,67 i 1,30
* различие по отношению к группе контроля (р < 0,05); # различие по отношению к группе с активным бактериовыделением (р < 0,05).
''statistically significant difference as opposed to the control group (р < 0.05); # statistically significant difference as opposed to the group with intense bacterial excretion (р < 0.05).
Клетки С068+/УЕОР локализовались преимущественно в зоне специфической грануляционной ткани на границе с пиогенным слоем и верифицировались как высоко или умеренно активированные. Слабоактивные С068+/УБОР+ фиксировались на границе перехода грануляций в фиброзный слой.
На границе фиброзного слоя и окружающей перикавернозной зоны в обеих группах микроскопически определялась выраженная лимфо-идная инфильтрация с формированием лимфо-идных фолликулов как с активными светлыми герминативными центрами, так и относительно мономорфными по своей структуре. Во всех наблюдениях установлено, что из общего числа позитивно окрашенных макрофагов в фиброзном слое 70% локализованы в непосредственной близости от лимфоидных формирований.
Количество клеток УЕОБ+ в зоне лимфоидных фолликулов прямо коррелировало с количеством макрофагов СЭ68+ в перикавернозной зоне (Я = 0,68) и отмечалась отрицательная корреляционная
связь по отношению к количеству УЕОБ+ диф-фузно рассеянных клеток в фиброзной капсуле (Я = -0,75). Клетки С068+/УЕОР+ визуализировались в зоне СЭ8+ Т-лимфоцитов, а СЭ68+/УЕОР- -в зоне скоплений клеток СЭ4+ (рис. 2).
У всех пациентов группы ФКТ МБТ+ в дренирующем бронхе с типичным трехслойным строением максимальное количество высокоактивных макрофагов СЭ68 определялось в устье - (103,00 ± 1,2) позитивно окрашенных клетки. В окружающих участках серозной пневмонии регистрировался высокий уровень ИГХ экспрессии СЭ68 в виде очаговых скоплений высокоактивных (38,34 ± 1,1) и умеренно активных (29,32 ± 0,8) альвеолярных макрофагов и пенистых клеток, что свидетельствует об активизации гистиоцитарного пула в связи с прогрессией воспаления.
В участках частичного либо тотального спадения альвеол наблюдалась экспрессия высокоактивных альвеолярных макрофагов СЭ68+ в небольшом количестве, в основном фиксированных в альвеолярных нишах. В строме альвеолярных
перегородок зоны дистелектаза среди хронического лимфо-гистиоцитарного инфильтрата определялось около 22% тканевых макрофагов
Яг* fSjf-S,
a
СЭ68+ с низкой функциональной активностью (19,08 ± 0,7), которые соответствовали клеткам УЕОБ+ (рис. 3).
V . -
л V
>. ч - ■:
b
d
Рис. 2. Иммуногистохимическая реакция с маркерами VEGF-A: a - CD68, х200; b - CD4, х200; c - CD8, х400;
d - в фиброзном слое каверны в области лимфоидных агрегатов, х 400 Fig 2. Immunohistochemical reaction with markers of VEGF-A: a - CD68, х200; b - CD4, х200; c - CD8, х400; d - in the fibrous cavern layer in the area of lymphoid cell aggregates, х400
с
Л (U я з 5S s £ 0J
« .S3 т ti C5 С Л о н ti н at о "3 S с 3 J3 1 § и £ Зй ср ич б хо g ' £ ff SP 2 .5 5
и е s SS к Q а;
ан ср <
Д
ml
I I Слабоактивные CD68 Weakly active CD68
□ VEGF
Рис. 3. Распределение слабоактивных макрофагов CD68+ в сопоставлении с VEGF+ клетками при фиброзно-ка-
вернозном туберкулезе Mycobacterium tuberculosis + Fig. 3. Distribution of weakly active CD68+ macrophages compared with VEGF+ cells under fibrous cavernous pulmonary
tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis +
В очагах эмфизематозного вздутия определялось минимальное количество позитивно окрашенных макрофагов ((9,16 ± 0,4) при ФКТ МБТ+ и (9,11 ± 0,4) при ФКТ МБТ-) в сравнении со всеми вышеописанными зонами независимо от активности бактериовыделения. В основном это были альвеолярные макрофаги со слабой функ-
циональной активностью, фиксированные на альвеолярной поверхности - (8,01 ± 0,4) и (7,29 ± 0,4) клеток УЕОБ+ соответственно. В просвете расширенных альвеол с истонченными перегородками свободно лежащих позитивно экспрес-сирующих маркеров СЭ68 либо клеток УЕОБ не обнаружено.
ОБСУЖДЕНИЕ
В современной медицине имеется большое количество научных работ, посвященных изучению патоморфоза различных форм туберкулеза, часть из них имеет экспериментальный характер, и лишь немногочисленные исследования отображают патогенетические аспекты in vivo, что связано, в том числе, и со сложностью забора материала для исследования [12]. Многочисленные научные работы посвящены клиническим сопоставлениям показателей активности туберкулеза в периферической крови пациентов [13, 14]. Однако они не являются показательными с точки зрения специфичности процесса и его локализации, так как практически невозможно сформировать «чистую» группу пациентов без сопутствующей патологии и, соответственно, определить истинную причину прогрессирующей иммунологической недостаточности [5, 16]. С этой точки зрения иммуногистохимические и молекуляр-но-генетические исследования более перспективны, поскольку отражают состояние клеточного звена локального иммунитета, межклеточных взаимодействий и особенностей их регуляции в реальных условиях непосредственно в очаге поражения и в окружающей легочной паренхиме.
В нашем исследовании в результате проведенного комплексного морфологического анализа образцов легких пациентов с фиброзно-каверно-зным туберкулезом в зависимости от активности бактериовыделения установлена популяционная неоднородность клеток гистиоцитарного происхождения в зависимости от степени активации кластера дифференцировки 68 или макросиали-на, который является членом семейства скавэн-джер-рецепторов (ScR) и широко используется как маркер макрофагов. Макросиалин, локализуясь на цитоплазматических гранулах, содержащих лизосомально-эндосомально ассоциированный мембранный гликопротеин 1 (LAMP-1), является показателем активации макрофагов в ответ на различные воспалительные стимулы [17].
Нами выделено три типа активности клеток CD68 на основании интенсивности реакции в условиях туберкулезного процесса: высокий, умеренный и слабый. Высокоактивные клетки CD68+ с интенсивным мембранно-цитоплазмати-ческим окрашиванием, компактными и тесно расположенными зернами в цитоплазме свидетельствуют о гиперактивации макрофагов на фоне хронической стимуляции бактериальным липо-полисахаридом и неэффективности фагоцитоза M. tuberculosis и персистенции ее внутриклеточного паразитирования.
Слабоактивные макрофаги CD68 с нечеткой мембранной экспрессией и слабым диффузным окрашиванием цитоплазмы, единичными рассеянными зернами либо готовятся к фагоцитозу ми-кобактерий, либо находятся в состоянии покоя.
Уменьшение количества высокоактивных на основании интенсивности окраски клеток CD68+ и параллельное нарастание пула слабоактивных макрофагов по мере отдаления от очага кавернозной деструкции позволило предположить наличие различных функциональных обязательств данных клеток не только в отношении фагоцитоза и презентации антигена иммунокомпетентными клетками, но и возможного противовоспалительного действия и ремоделирования окружающей легочной паренхимы.
Данное заключение базируется и на основании известного факта полиморфизма популяции макрофагов в условиях in vitro и in vivo у экспериментальных животных. Идентифицированы два фенотипа макрофагов: M1 (макрофаги 1-го типа, классически активированные) и M2 (макрофаги 2-го типа, альтернативно активированные) [18].
M1 - провоспалительные или цитотоксиче-ские, продуцируют интерлейкин (ИЛ) 12, индуци-бельный оксид азота (iNOS), миелоид-зависимый протеин (MRP) 8/14 и фактор некроза опухоли (TNF) а, металлопротеиназу (MMP) 9, интерферон (ИФН) у и потенцируют развитие клеток Th0 в Th1 [19]. M2 - противовоспалительные, продуцируют ИЛ-4, ИЛ-10, сосудистый фактор роста (VEGF), экспрессируют на поверхности маркера активации макрофагов CD163 и др. Это тип клеток интегрирован в ^2-ответ [20].
В нашем исследовании фрагменты легких пациентов с фиброзно-кавернозным туберкулезом клетки CD68+/VEGF- локализовались преимущественно в зоне специфической грануляционной ткани на границе с пиогенным слоем, в устье дренирующего бронха, очагах серозной пневмонии и верифицировались как высоко- или умеренно активные. Зафиксированное статистически значимое превалирование таких клеток у пациентов с активным бактериовыделением в сравнении с группой ФКТ MБT- обусловлено интенсификацией цитотоксических механизмов в связи с прогрессией альтеративно-экссудативных реакций, массивной бактериальной инсеминацией и необходимостью активизации фагоцитоза.
Клетки VEGF+ - слабоактивные макрофаги CD68+ - фиксируются на границе перехода грануляций в фиброзный слой, перикавернозной зоне и интактной легочной ткани со статистически значимым преобладанием у пациентов с MБT- (рис. 4).
100 90
so
70 60 50 40 30 20 10
il
HIè
so
S ÖD
£5 .S S3
<
VEGF
s В
Д
I I Слабоактивные CD68 I I
Weakly active CD68
Рис. 4. Распределение слабоактивных макрофагов CD68+ в сопоставлении с клетками VEGF+ при фи-брозно-кавернозном туберкулезе Mycobacterium tuberculosis-
Fig. 4. Distribution of weakly active CD68+ macrophages compared with VEGF+ cells under fibrous cavernous pulmonary tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis-
Независимо от активности бактериовыделения клетки VEGF+ в зоне лимфоидных фолликулов прямо коррелируют с количеством макрофагов CD68+ в перикавернозной зоне (R = 0,68) и обратно - с числом VEGF+ диффузно рассеянных клеток в фиброзной капсуле (R = -0,75). При этом CD68+/ VEGF+ визуализируются в зоне CD8+ Т-лимфоци-тов, а CD68+/VEGF- - в зоне скоплений клеток CD4+. Такой характер корреляционной взаимосвязи свидетельствует о перераспределении макрофагов во 2-й тип, обладающих ремоделирующим действием на окружающие ткани при потенцирующем участии клеток лимфоидной популяции.
По мере удаления от очага специфического воспаления происходит инверсия макрофагальной активности от провоспалительной к противовоспалительной. Такое функциональное перераспределение связано со снижением бактериальной инсеминации тканей и, возможно, является следствием индуктивной перестройки самих макрофагов микобактериями, направленной на одновременную маскировку от цитотоксического клеточного ответа и ремоделирование легочной ткани с целью создания комфортного микроокружения и достаточной аэрации в очаге специфического воспаления. Такая многозадачность реализуется с помощью механизма «ареста созревания фаголизосом», блокировки рецептора MHCI, активизации рецептора MHCII, что приводит к последующей дифференцировке клеток
Th0 в Th2 и перепрограммированию макрофагов в М2 с противовоспалительной функциональной направленностью. Как показано в наших предыдущих исследованиях процессов васкуляризации в условиях кавернозного туберкулеза, именно макрофаги VEGF+ путем гиперпродукции сосудистого фактора роста А приводят к разрастанию неполноценных в функциональном отношении сосудов с несформированной базальной мембраной и повышенным индексом проницаемости непосредственно в очагах специфического воспаления [21, 22]. В то же время векторное попу-ляционное перераспределение макрофагов во 2-й тип в интактной легочной ткани также приводит к неэффективной гемодинамической микроциркуляции за счет нарушения сосудистой проницаемости и нарастания тканевой гипоксии. Далее происходит формирование альвеоло-капилляр-ного блока и прогрессирующего пневмофиброза, замыкая «порочный круг» клинической прогрессии бронхолегочной недостаточности.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В условиях туберкулеза макрофаги представляют ключевую клеточную популяцию, определяющую не только первичное взаимодействие с M. tuberculosis, но и дальнейший каскад патологических реакций, приводящих ко вторичной иммунологической недостаточности, а также неконтролируемой деструкции легочной паренхимы и диссеминации процесса.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. World Health Organization. Global Tuberculosis report. 2017.
2. Cliff J.M., Kaufmann S.H., McShane H., van Helden P., O'Garra A. The human immune response to tuberculosis and its treatment: a view from the blood. Immunol. Rev. 2015; 264 (1): 88-102.
3. Ziuzia Iu.R., Zimina V.N., Al'varesFigeroa M.V., Parkhomen-ko Iu.G., Dolgova E.A. The morphological characteristics of HIV-associated tuberculosis in relation to blood CD4+ lymphocyte counts. Arkh. Patol. 2014; Sept.-Oct.; 76 (5): 33-37.
4. Bhattacharya D., Danaviah S., Muema D.M., Akilimali N.A., Moodley P., Ndung'u T., Das G. Cellular аrchitecture of spinal granulomas and the immunological response in tuberculosis patients coinfected with HIV. Front. Immunol. 2017; 8: 1120. DOI: 10.3389/fimmu.2017.01120.
5. Huygen K. The immunodominant T-cell epitopes of the mycolyl-transferases of the antigen 85 complex of M. tuberculosis. Front. Immunol. 2014; 5: 1-11.
6. Jasenosky L.D., Scriba T.J., Hanekom W.A., Goldfeld A.E. T cells and adaptive immunity to Mycobacterium tuberculosis in humans. Immunol. Rev. 2015; 264: 74-87. pmid: 25703553.
7. Martinez F.O., Gordon S. The Ml and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000 Prime Rep. 2014; 6: 13. Published 2014 Mar. 3. DOI: 10.12703/P6-13.
8. Italiani P., Boraschi D. From monocytes to M1/M2 macrophages: phenotypical vs. functional differentiation. Front. Immunol. 2014; 5: 514. DOI: 10.3389/fimmu.2014.00514.
9. Serena Y.S. Tan, Mark A. Developmental origin of lung macrophage diversity. Krasnow Development. 2016; 143: 1318-1327. DOI: 10.1242/dev.129122.
10. Dorhoi A., Kaufmann S.H. Pathology and immune reactivity: understanding multidimensionality in pulmonary tuberculosis. Semin. Immunopathol. 2016; Mar.; 38 (2): 153-166. Epub. 2015, Oct. 5.
11. Янин В.Л., Бондаренко О.М., Сазонова Н.А. Методы исследования в цитологии и гистологии: учебно-методическое пособие. Ханты-Мансийск: БУ «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия», 2015: 65. [Yanin V.L., Bondarenko O.M., Sazonova N.A. Methods of research in cytology and histology: teaching guide. Khanty-Mansiysk: BU "Khanty-Mansiysk State Medical Academy" Publ., 2015: 65 (in Russ.)].
12. Kim P.S., Makhene M., Sizemore C., Hafner R. Viewpoint: Challenges and opportunities in tuberculosis research. J. Infect. Dis. 2012; 205 Suppl. 2: 347-352.
13. Lyadova I.V., Panteleev A.V. Th1 and Th17 сells in tuberculosis: рrotection, рathology, and biomarkers. Mediators Inflamm. 2015; 2015: 8545-8507.
14. Aryanpur M., Mortaz E., Masjedi M.R., Tabarsi P., Garssen J., Adcock I.M., Mozafarian A. and Sharifi H. Reduced phagocytic capacity of blood monocyte/mac-rophages in tuberculosis patients is further reduced by smoking. Iranian Journal of Allergy, Asthma and Immunology. 2016; 15 (3): 174-182.
15. Yakar H.I., Gunen H., Pehlivan E., Aydogan S. The role of tuberculosis in COPD. Int. J. Chron. Obstruct. Pulmon. Dis. 2017; 12: 323-329. DOI: 10.2147/COPD.S116086.
16. Kim H.J., Baek S., Kim H.J. The impact of smoking on
airflow limitation in subjects with history of asthma and inactive tuberculosis. PLoS One. 2015; 10 (4). DOI: 10.137l/journal.pone.0125020.
17. Chistiakov D.A., Killingsworth M.C., Myasoedova V.A., Orekhov A.N., Bobryshev Y.V. CD68/macrosialin: not j'ust a histochemical marker. Laboratory Investigation. 2017; 97: 4-13.
18. Gordon S., Plbddemann A., Martinez Estrada F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunol. Rev. 2014; 262: 36-55.
19. Italiani P., Boraschi D. From мonocytes to M1/M2 мacrophages: рhenotypical vs functional differentiation. Front. Immunol. 2014; 5: 514. DOI: 10.3389/fim-mu.2014.00514.
20. Châvez-Galân L., Olleros M.L., Vesin D., Garcia I. Much мore than M1 and M2 мacrophages, there are also CD169(+) and TCR(+) macrophages. Front. Immunol. 2015; 6: 263. DOI: 10.3389/fimmu.2015.00263.
21. Голубинская Е.П., Филоненко Т.Г., Кальфа М.А., Ермола Ю.А. Морфологические особенности ангио-генеза при фиброзно-кавернозном туберкулезе. Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. 2018; 8 (1): 16-19. [Golubinskaya E.P., Filonenko T.G., Kalfa M.A., Ermola Yu. A. Morphological features of angiogenesis in fibrous cavernous pulmonary tuberculosis. Crimean Journal of Experimental and Clinical Medicine. 2018; 8 (1): 16-19 (in Russ.)].
22. Голубинская Е.П., Крамарь Т.В. Морфофункциональ-ное обоснование таргетной терапии блокаторами ангиогенеза при фиброзно-кавернозном туберкулезе. Материалы международного форума «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 2018, май 23-25; Москва, Россия: 400-402. [Golubinskaya E.P., Kramar T.V. Morphofunctional substantiation of targeted therapy with blockers of angiogenesis in fibrous cavernous pulmonary tuberculosis. Materials of the international forum "Biotechnology: state and prospects of development". 2018, May 23-25; Moscow, Russia: 400-402 (in Russ.)].
Вклад авторов
Голубинская Е.П. - разработка концепции и дизайна исследования, анализ и интерпретация результатов исследования, написание рукописи статьи. Филоненко Т.Г. -проверка критически важного интеллектуального содержания, окончательное утверждение рукописи статьи. Кубышкин А.В. - окончательное утверждение рукописи статьи для публикации, общее руководство. Ермола Ю.А. -анализ и интерпретация результатов исследования, редактирование рукописи статьи. Кальфа М.А. - статистическая обработка результатов и их интерпретация, забор биоматериала, написание рукописи статьи. Геращенко А.В. - забор биоматериала, проведение морфометри-ческого исследования, анализ и интерпретация полученных результатов. Крамарь Т.В. - проведение морфоме-трического исследования, оформление рукописи статьи.
Authors contribution
Golubinskaya E.P. - conception and design of the research, analysis and interpretation of the research results, drafting of the manuscript. Filonenko T.G. - critical revision of the manuscript for important intellectual content, final approval of the manuscript. Kubyshkin A.V. - final approval of the manuscript for publication, general guidance. Yermola Yu.A. - analysis and interpretation of the research results, editing of the manuscript. Kalfa M.A. - statistical processing of the results and their interpretation, sampling of biomaterial, drafting of the manuscript. Gerashchenko A.V. -sampling of biomaterial, carrying out of morphometric research, analysis and interpretation of the obtained results. Kramar T.V. - carrying out of the morphometric research, design and drafting of the manuscript.
Сведения об авторах
Голубинская Елена Петровна, канд. мед. наук, доцент, кафедра патологической анатомии с секционным курсом, Медицинская академия имени С.И. Георгиевского, КФУ имени В.И. Вернадского, г. Симферополь. ORCID iD 0000-0003-3917-924X.
Филоненко Татьяна Григорьевна, канд. мед. наук, доцент, кафедра патологической анатомии с секционным курсом, Медицинская академия имени С.И. Георгиевского, КФУ имени В.И. Вернадского, г. Симферополь. ORCID iD 0000-0002-4674-7391.
Кубышкин Анатолий Владимирович, д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой общей и клинической патофизиологии, Медицинская академия имени С.И. Георгиевского, КФУ имени В.И. Вернадского, г. Симферополь. ORCID iD 0000-0002-1309-4005.
Ермола Юлианна Аркадьевна, канд. мед. наук, доцент, кафедра патологической анатомии с секционным курсом, Медицинская академия имени С.И. Георгиевского, КФУ имени В.И. Вернадского, г. Симферополь. ORCID iD 00000003-4474-3714.
Кальфа Маргарита Алексеевна, ассистент, кафедра патологической анатомии с секционным курсом, Медицинская академия имени С.И. Георгиевского, КФУ имени В.И. Вернадского, г. Симферополь. ORCID iD 0000-00027179-3402.
Геращенко Алина Витальевна, ассистент, кафедра патологической анатомии с секционным курсом, Медицинская академия имени С.И. Георгиевского, КФУ имени В.И. Вернадского, г. Симферополь. ORCID iD 0000-00015076-2570.
Крамарь Татьяна Вадимовна, студент, Медицинская академия имени С.И. Георгиевского, КФУ имени В.И. Вернадского, г. Симферополь. ORCID iD 0000-00032632-0451.
(*) Голубинская Елена Петровна, e-mail: missive@ mail.ru.
Поступила в редакцию 05.11.2018 Подписана в печать 17.12.2018
Authors information
Golubinskaya Elena P., PhD, Associate Professor, Department of Pathological Anatomy with Sectional Course, Medical Academy named after S.I. Georgievsky, СFU named after Vernadsky, Simferopol, the Republic of Crimea, Russian Federation. ORCID iD 0000-0003-3917-924X.
Filonenko Tatyana G., PhD, Associate Professor, Department of Pathological Anatomy with Sectional Course, Medical Academy named after S.I. Georgievsky, СFU named after Vernadsky, Simferopol, Republic of Crimea, Russian Federation. ORCID iD 0000-0002-4674-7391.
Kubyshkin Anatoly V., DM, Professor, Head of the General and Clinical Pathophysiology Department, Medical Academy named after S.I. Georgievsky, СFU named after Vernadsky, Simferopol, Republic of Crimea, Russian Federation. ORCID iD 0000-0002-1309-4005.
YermolaYulianna A., PhD, Associate Professor, Department of Pathological Anatomy with Sectional Course, Medical Academy named after S.I. Georgievsky, СFU named after Vernadsky, Simferopol, Republic of Crimea, Russian Federation. ORCID iD 0000-0003-4474-3714.
Kalfa Margarita A., Assistant, Department of Pathological Anatomy with Sectional Course, Medical Academy named after S.I. Georgievsky, СFU named after Vernadsky, Simferopol, Republic of Crimea, Russian Federation. ORCID iD 0000-0002-7179-3402.
Gerashenko Alina V., Assistant, Department of Pathological Anatomy with Sectional Course, Medical Academy named after S.I. Georgievsky, СFU named after Vernadsky, Simferopol, Republic of Crimea, Russian Federation. ORCID iD 0000-0001-5076-2570.
Kramar Tatyana V., Student, Medical Academy named after S.I. Georgievsky, СFU named after Vernadsky, Simferopol, Republic of Crimea, Russian Federation. ORCID iD 0000-0003-2632-0451.
(*) Golubinskaya Elena P., e-mail: missive@mail.ru.
Received 05.11.2018 Accepted 17.12.2018
