CC BY
7
Bulletin of Medical Internet Conferences (ISSN 2224-6150)
2022. Volume 12. Issue 3
ID: 2021-03-27-A-19627 Краткое сообщение
Владимирова A.A., Ломакина A.A., Кенжегулов O.A., Саркисьянц Д.А. Оценка окислительного стресса при воздействии наночастиц селена на эритроциты крови
ФГБОУ ВО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России, кафедра гистологии
Резюме
В данной работе исследована концентрационно-зависимая гемотоксичность наночастиц элементарного селена (HЧSe) в отношении эритроцитов крови белых беспородных крыс. Показано, что токсический эффект, проявляющийся в увеличении продукции супероксиддисмутазы и каталазы в ответ на повышение в эритроцитах уровня супероксидного анион-радикала и перекиси водорода, в значительной степени зависит от концентрации раствора HЧSe и их размера. В частности, исследуемые в данной работе HЧSe наименьшего размера демонстрировали большую способность вызывать окислительный стресс, чем те же наночастицы большего размера.
Ключевые слова: наночастицы, селен, окислительный стресс, эритроциты
Введение
Селен (Se) - важнейший микроэлемент, демонстрирующий фундаментальную значимость для здоровья человека. Являясь составной частью многих селенопротеинов, он выполняет ряд таких физиологических функций, как защита от окислительного стресса, участие в транспорте кальция в клетке и фолдинге белков, регулирование углеводного обмена и т.д. (1). Показано, что неоптимальный статус селена в организме может приводить к снижению иммунитета, повышению риска развития сердечнососудистых заболеваний (2), нарушениям развития нервной системы (3) и нейродегенеративным заболеваниям (4). Особый интерес во время пандемии COVID-19 представляет значение селена для устойчивости к РНК-вирусам и хроническим воспалительным состояниям (5).
Токсичный уровень селена отличается от необходимого всего на один порядок, что делает этот микроэлемент не похожим ни на один другой. Примечательно, что изучение биологических свойств селена в форме наночастиц показало заметно сниженные показатели токсичности, в отличие от иных форм селено-содержащих соединений (6). Именно по этой причине, в литературе широко обсуждаются перспективы использования таких наночастиц для различного рода биомедицинских применений.
Кровь - важнейшая жидкая составляющая внутренней среды организма, которая прямо или косвенно сталкивается с наночастицами при их попадании в организм. Несмотря на активные исследования H'Se, их гемотоксичность и гемосовместимость остаются в значительной степени неизвестными. Исходя из этого, крайне необходимо изучить нанотоксичность H'Se для крови, особенно для эритроцитов. В частности, недостаточно изучен вопрос риска развития окислительных реакций, приводящих к деструкции жизненно важных форменных элементов крови - эритроцитов, что подчеркивает значимость и актуальность данной работы.
Цель работы: определить уровень окислительного стресса в эритроцитах крови белых беспородных крыс при воздействии H'Se различной концентрации.
Задачи:
1. Получить препараты H'Se с конечными концентрациями 5, 10 и 20 мкг/мл.
2. С помощью методов динамического светорассеяния (ДРС) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) оценить морфологию, однородность и распределение по размерам полученных H'Se.
3. Определить биохимические показатели активности супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы в гемолизате эритроцитов крови белых беспородных крыс при воздействии H'Se различной концентрации.
Материал и методы
Для получения препаратов H'Se использовали метод на основе восстановления селенистой кислоты в водной среде с образованием красно-оранжевого раствора наночастиц элементарного Se (9). Путем последовательного повышения концентрации используемых веществ, готовили растворы H'Se с конечными концентрациями 5, 10 и 20 мкг/мл. Методом динамического светорассеяния (ДРС) определяли распределение по размерам образованных в результате восстановления селенистой кислоты наноструктур. С помощью метода просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) определяли морфологию и степень однородности H'Se. Биохимические показатели активности супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы определяли в гемолизате эритроцитов крови белых беспородных крыс. Кровь собирали в пробирки с 1,8% раствором цитрата натрия и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин. Полученный осадок эритроцитов ресуспендировали в 10,0 мл охлажденного 0,9% раствора NaCl, далее образцы осаждали путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин. Плотный осадок эритроцитов трижды отмывали раствором 0,9% NaCl и использовали для получения гемолизата. 1% гемолизат эритроцитов получали путем лизирования дистиллированной водой в соотношении 1:100, активно встряхивали и инкубировали при + 40С в течение 30 минут. Активность СОД и каталазы определяли спектрофотометрическими методами (7, 8). Для непосредственной оценки уровня ферментов готовили инкубационную взвесь: к 1 мл гемолизата при постоянном перемешивании добавляли 1 мл раствора исследуемых H'Se в концентрациях 5, 10 и 20 мкг/мл. Полученные взвеси инкубировали при 37 °С при постоянном перемешивании (140 об./мин.). В качестве контроля готовили образцы гемолизата с добавлением эквивалентного объема физиологического раствора (ФР). Математическую обработку полученных результатов осуществляли, используя методы вариационной статистики, с помощью программ статистического анализа Microsoft Excel.
www.medconfer.com
© Bulletin of Medical Internet Conferences, 2022
Бюллетень медицинских Интернет-конференций (ISSN 2224-6150) 2022. Том 12. 7 3
Таблица 1. Активность СОД и каталазы! в эритроцитах крови при воздействии НЧ5е различной концентрации
Концентрация H4Se в растворе (мкг/мл) СОД, эритроциты (у.е./мг Hb) Каталаза, эритроциты (ммоль/мин/г Hb)
5 2,88±0,01 36,7±1,5
10 1,87±0,02 33,8±1,1
20 1,22±0,04 31,9±1,6
Контроль (эквивалентный объем ФР) 1,02±0,02 30,5±1,7
Примечание * - достоверность (р<0,05) различий с контролем
Результаты и обсуждение
Хорошо известно, что токсичность соединений селена снижается при переходе от его ионных форм к органическим соединениям и минимальна для элементарного селена в нулевой степени окисления. Также, считается, что вещества в наноразмерном диапозоне обладают способностью проникать через биологические барьеры организма, такие как стенка капилляров, клеточные мембраны и т.д. Выше сказанное определяет актуальность создания и изучения нанокомпозитов, имеющих в своем составе селен в степени окисления 0, например как исследуемые нами H4Se. В данной работе было проведено исследование гемотоксичности H'Se различной концентрации в отношении эритроцитов крови, выражающееся в виде возможного оксидативного стресса. Первоначально готовили препараты H'Se с конечными концентрациями 5, 10 и 20 мкг/мл. Метод ПЭМ показал, что H'Se, полученные в результате восстановления селенистой кислоты, имеют сферическую форму, достаточно однородные, без каких-либо признаков агрегации. На основании данных метода ДРС были выявлены средние диаметры H'Se в растворах с концентрациями 5, 10 и 20 мкг/мл, которые составили = 25-30, 47-50 и 100 нм, соответственно. Дзета-потенциал исследуемых H'Se варьировал в диапозоне -20,5 - -24,3 мВ, что говорит об их достаточной устойчивости к агрегации. В качестве маркеров окислительного стресса в эритроцитах были выбраны такие ферменты, как СОД и каталаза. Широко известно, что каталаза в эритроцитах находится в функциональном комплексе с СОД (10). Внутриклеточное антиоксидантное действие данных ферментов выражается в снижении высоких концентраций супероксидного анион-радикала и перекиси водорода, что обеспечивает организму человека защиту от окислительного стресса. Активность СОД и каталазы в эритроцитах зависела от концентрации раствора H'Se и их размера. При воздействии H'Se в концентрации 5 мкг/мл активность ферментов достигала высокого уровня, в то время как она была ниже при воздействии раствора частиц с концентрациями 10 и 20 мкг/мл. Очевидно, что наблюдаемый эффект связан с активизацией процессов образования активных форм кислорода в эритроцитах, что и приводит к увеличению продукции антиоксидантных ферментов. Эритроциты, обработанные раствором H'Se в концентрации 20 мкг/мл не демонстрировали значительного увеличения активности СОД и каталазы по сравнению с контролем, как представлено в Таблице 1. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что большую токсичность, проявляющуюся в увеличении продукции антиоксидантных ферментов эритроцитами, проявляют частицы меньшего размера, содержащиеся в растворе с конечной концентрацией 5 мкг/мл. Окислительный стресс, индуцированный H'Se меньшего размера, можно объяснить прямым взаимодействием частиц с эритроцитами, что приводит к нежелательным явлениям (11). В целом, результаты показывают, что размер и концентрация H'Se - критический фактор, влияющий на взаимодействие между частицами и форменными элементами крови, в частности эритроцитами.
Заключение
Таким образом, в данной работе успешно исследована концентрационно-зависимая гемотоксичность H'Se в отношении эритроцитов крови белых беспородных крыс. Воздействие H'Se в концентрации 5 мкг/мл приводит к увеличению в эритроцитах содержания супероксидного анион-радикала и перекиси водорода, что неизбежно ведет к повышению уровня ферментов СОД и каталазы, стремящихся нивелировать вызываемый окислительный стресс. Полученные в данной работе результаты позволяют сделать вывод, что размер и концентрация частиц являются одними из критических факторов, влияющих на взаимодействие между H'Se и эритроцитами крови.
Литература
1. Rayman M. P. The importance of selenium to human health // The lancet. 2000. V. 356. N. 9225. P. 233-241.
2. Selenium status in the body and cardiovascular disease: a systematic review and meta-analysis / Kuria A. [et al.] // Critical reviews in food science and nutrition. 2020. P. 1-10.
3. Impact of maternal selenium status on infant outcome during the first 6 months of life / Varsi K. [et al.] // Nutrients. 2017. V. 9. N. 5. P. 486.
4. Treatment strategies in Alzheimer's disease: a review with focus on selenium supplementation / Aaseth J. [et al.] // Biometals. 2016. V. 29. N. 5. P. 827-839.
5. Early nutritional interventions with zinc, selenium and vitamin D for raising anti-viral resistance against progressive COVID-19 / Alexander J. [et al.] // Nutrients. 2020. V. 12. N. 8. P. 2358.
6. Wang H., Zhang J., Yu H. Elemental selenium at nano size possesses lower toxicity without compromising the fundamental effect on selenoenzymes: comparison with selenomethionine in mice // Free Radical Biology and Medicine. 2007. V. 42. N. 10. P. 1524-1533.
7. Сирота Т.В. Hовый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и его использование для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопросы медицинской химии. 1999. 7 3. С. 263-272.
8. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. 1988. 7 1. С. 16-19.
9. Валуева С.В., Суханова Т.Е., Боровикова Л.К, Вылегжанина М.Э., Матвеева H.A., Гельфонд М.Л. Самоорганизация и структура селенсодержащих биологически активных наносистем // Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». 2011. 7 10. С. 3-11.
10. Карбышев М.С., Абдуллаев Ш.П. Биохимия оксидативного стресса: учебно-методическое пособие. ФГБОУ ВО РHИМУ имени КИ. Пирогова Минздрава России, М.: Издательство ХХ, 2018. 60 с.
11. Материалы, производимые по нанотехнологиям: потенциальный риск при получении и использовании / Андреев Г.Б. [и др.] // Российский химический журнал. 2008. Т. 52. 7. 5. С. 32-38.
© Бюллетень медицинских Интернет-конференций, 2022
www.medconfer.com
