CC BY
8Ветеринарный врач. 2023. № 3. С. 10 - 16. The Veterinarian. 2023; (3): 10 - 16
Научная статья
УДК 636:619:614:648.6
DOI: 10.33632/1998-698Х_2023_3_10
Оценка мутагенной активности биопрепарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов in vivo
Ринат Салаватович Мухаммадиев, Ришат Салаватович Мухаммадиев, Ленар Рашитович Валиуллин, Рифкат Расимович Мусин, Анна Михайловна Тремасова
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», Казань, Россия Автор, ответственный за переписку: Ринат Салаватович Мухаммадиев, tanirtashir@mail.ru
Аннотация. Молочнокислые и пропионовокислые бактерии широко применяются в различных областях промышленности, ветеринарной медицине, пищевой и фармацевтической промышленности. Для получения качественного корма, необходимого для создания оптимальных условий развития нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных и птиц и, таким образом, для повышения поголовья скота, актуальным является разработка препаратов на основе комбинации данных бактерий для совершенствования технологии консервирования и силосования кормов. В то же время согласно Всемирной организации здравоохранения, Европейского агентства по безопасности продовольствия препараты на основе таких консорциумов должны быть не только эффективными, но и безопасными. Проведено определение мутагенного эффекта биологического препарата на основе штаммов Propionibacterium freudenreichii, Lactococcus lactis, Lactoplantibacillus plantarum, Lentilactobacillus bucheri, Ligilactobacillus salivarius в условиях in vivo. Мутагенная активность разрабатываемого нами препарата на основе штаммов молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов с применением метода учета аберраций хромосом в клетках костного мозга мышей не выявило статистически достоверного повышения числа клеток со структурными нарушениями хромосом по сравнению с группой отрицательного контроля. Микроядерный тест также показал отсутствие повышения количества микроядерных эритроцитов у мышей по сравнению с группой отрицательного контроля. Полученные данные методом учета аберраций хромосом в клетках костного мозга мышей подтверждаются результатами, полученными методом учета микроядер в клетках млекопитающих, и указывают на безопасность биопрепарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов, а также возможность его дальнейшего применения в сельском хозяйстве и ветеринарной медицине.
Ключевые слова: биопрепарат, молочнокислые, пропионовокислые бактерии, мутагенность,
in vivo
Assessment of mutagenic activity of a biological product based on lactic acid and propionic acid microorganisms in vivo
Шпа1 S. Mukhammadiev, Rishat S. Mukhammadiev, Lenar R. Valiullin, Rifkat R. Musin, Anna M. Tremasova
Federal State Budgetary Scientific Institution «Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological safety», Kazan, Russia
Corresponding author: Rinat Salavatovich Muhammadiev, tanirtashir@mail.ru
Аbstract. Lactic acid and propionic acid bacteria are widely used in various fields of industry, veterinary medicine, food and pharmaceutical industries. In order to obtain high-quality feed necessary to create optimal conditions for the development of normal microflora of the gastrointestinal tract of farm animals and birds and, thus, to increase the number of livestock, it is relevant to develop drugs based on a combination of these bacteria to improve the technology of canning and silage feed. At the same time, according to the World Health Organization, the European Food Safety Agency, drugs based on such consortia should not only
be effective, but also safe. The mutagenic activity of a biological product based on lactic acid and propionic acid microorganisms was evaluated in vivo. The mutagenic activity of the drug developed by us based on strains of lactic acid and propionic acid microorganisms using the method of accounting for chromosome aberrations in mouse bone marrow cells did not reveal a statistically significant increase in the number of cells with structural chromosome disorders compared to the negative control group. The micronucleus test also showed no increase in the number of micronuclear erythrocytes in mice compared with the negative control group. The data obtained by the method of accounting for chromosome aberrations in mouse bone marrow cells are confirmed by the results obtained by the method of counting micronuclei in mammalian cells and indicate the safety of a biological product based on lactic and propionic acid microorganisms, as well as the possibility of its further use in agriculture and veterinary medicine.
Keywords: biological product, lactic acid, propionic acid bacteria, mutagenicity, in vivo
Введение. В последнее время из огромного числа исследуемых биологических объектов большое внимание стало уделяться молочнокислым и пропионовокислым бактериям. Интерес исследователей к этим микроорганизмам связан с тем, что они способны оказывать положительное влияние на биохимические, иммунные, физиологические и поведенческие реакции организма хозяина путем поддержания количественного и качественного состава кишечной микробиоты образованием антимикробных соединений, пептидов и белков [18]; конкуренции с патогенами и их токсинами за места прикрепления к стенкам кишечника, а также борьбы с ними за источники питания [16]; улучшения метаболизма и транспорта кишечника [4, 5, 7]; регуляции иммунного ответа, увеличения врождённого иммунитета и предотвращения воспалительных процессов, вызванных патогенными микроорганизмами [18, 16, 19].
В настоящее время молочнокислые и пропионовокислые микроорганизмы широко используются в различных сферах промышленности, включая ветеринарию, медицину, пищевую и фармацевтическую промышленность. В то же время молочнокислые и пропионовокислые бактерии перспективны для использования при силосовании и консервировании кормов [3, 10, 12, 15]. Разработка препарата на основе консорциума данных микроорганизмов для технологии консервирования и силосования необходима для получения качественного корма, который будет создавать благоприятные условия развития нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных и птиц и, таким образом, способствовать повышению поголовья скота. Однако согласно Всемирной организации здравоохранения, Европейского агентства по безопасности продовольствия препараты на основе таких консорциумов должны основываться не только на их эффективности, но и безопасности [8, 20].
Цель исследования - оценка мутагенного эффекта биологического препарата на основе штаммов Propionibacterium freudenreichii, Lactococcus lactis, Lactoplantibacillus plantarum, Lentilactobacillus bucheri, Ligilactobacillus salivarius в условиях in vivo.
Материалы и методы. Работа проводилась на базе сектора пробиотических препаратов и ферментов отделения биотехнологии ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Объектом исследования служил биопрепарат на основе штаммов Propionibacterium freudenreichii, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus bucheri, Lactobacillus salivarius.
Оценка мутагенной активности изучаемого биопрепарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов осуществлялась методами учета аберраций хромосом в клетках костного мозга и учета микроядер в клетках млекопитающих [10, 14]. Эксперименты по изучению мутагенного действия препарата проводилось на мышах линии BALB/c весом 20-22 г в возрасте 10-12 недель, полученных из вивария лабораторных животных ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».
Для определения мутагенного эффекта препарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов методом учета аберраций хромосом в клетках костного мозга in vivo осуществляли введение биопрепарата однократно внутрибрюшинно (как способ, обеспечивающий максимальную биодоступность препарата) и ежедневно на протяжении 4-5 суток перорально (как способ, имитирующий рекомендованный клинический путь введения). Перед введением препарата каждое животное взвешивалось и производилось расчет дозы с учетом индивидуальной массы тела животного. В работе нами изучен выход хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей после действия циклофосфамида согласно рекомендации Фармкомитета Российской Федерации [10,
14].
Препараты метафазных хромосом готовили на следующий день после последнего введения тестируемого препарата по общепринятой стандартной методике [1, 14, 17].
Для подавления образования веретена клеточного деления и накопления метафазных клеток животным за 3 часа до эвтаназии однократно внутрибрюшинно вводили 0,025 % раствор колхицина в объёме 0,1 мл на один грамм массы животного.
После проведения забоя методом дислокации шейных позвонков у животных выделяли костный мозг из бедренной кости, вымывая его в центрифужную пробирку, где содержался подогретый до 37 °С физиологический раствор (0,56 % раствора хлористого калия). Флаконы с полученной взвесью клеток костного мозга помещали в термостат с температурой 37 °С на 30 минут и центрифугировали в течение 5 минут при 1000 об/мин. Супернатант (надосадочную жидкость) удаляли, клеточный осадок ресуспендировали в физиологическом растворе в течение 15 минут. Полученную взвесь инкубировали 10 минут при 37 °С и осаждали центрифугированием при тех же условиях. Супернатант удаляли, после чего осадок клеток ресуспендировали и фиксировали путем добавления свежеприготовленной охлажденной смеси этилового спирта и уксусной кислоты в соотношении 3:1. Фиксация клеточного материала осуществляли трехкратно через 6 часов после последнего введения. После двух минут инкубирования смеси и смены фиксатора клетки выдерживали 30 минут в холодильнике. Затем осадок ресуспендировали и центрифугировали 3 раза, меняя фиксатор.
Для приготовления препаратов клеточные суспензии наносили на влажные охлажденные предметные стекла, высушивали в пламени горелки и окрашивали 0,5 %-ным раствором генцианвиолета в течение 30 минут. Полученные цитологические препараты просматривали под иммерсионной системой светового микроскопа. Оценке подвергали округлые метафазные пластинки без наложений хромосом с модальным числом 40. Анализ полученных результатов мутагенной пробы проводили сопоставлением долей клеток с хромосомными аберрациями в контрольной и опытных группах эксперимента. Для этого анализировали по 100 метафаз на каждое животное. По каждому животному учитывали число одиночных и парных фрагментов, ахроматических пробелов (гепов), количество клеток с множественными повреждениями и клеток с полной деструкцией хромосом для опытных и контрольных групп. Для предотвращения потери хромосом при приготовлении препаратов, анализируемые метафазы содержали число центромер в пределах (2 п ± 2).
В первой серии опытов для определения мутагенного эффекта методом учета микроядер в клетках млекопитающих мышам однократно вводили испытуемый препарат с дальнейшим взятием периферической крови через 6 и 48 часов после введения [13]. Во второй серии экспериментов тестируемый препарат вводили самцам и самкам ежедневно на протяжении 5 суток. Забор крови из хвостовой вены животных и приготовление мазков проводили через 6 часов после последнего введения исследуемого препарата. Для приготовления мазка наносили капли крови на предметные стекла и высушивали на воздухе в течение двух часов. Приготовленные мазки фиксировали трехкратно в растворе метилового спирта и ледяной уксусной кислоты соотношении 3:1 в течение 2-3 минут, затем высушивали на теплой плитке. Полученные препараты окрашивали раствором азур-эозинового красителя Романовского - Гимза, приготовленного на дистиллированной воде (1:5), в течение 20 минут. Окрашенные препараты промывали в дистиллированной воде, высушивали на воздухе, затем осветляли в ксилоле. Полученные образцы подвергали микроскопическому анализу, основанному на регистрации количества клеток, содержащих микроядра, по отношению к общему числу эритроцитов с микроядрами, с применением световой микроскопии, используя объектив с масляной иммерсией и с 90-кратным увеличением. Подсчет эритроцитов, содержащих микроядра, у каждого животного осуществляли в расчете на 2000 эритроцитов и выражали в промилле (%о). Негативным контролем являлась используемая лечебная основа препарата. В качестве позитивного контроля использовали индуктор образования микроядер - колхицин в концентрации 125 мкг/кг веса мыши, который вводили однократно.
Полученные в ходе исследования результаты обрабатывали методом вариационной статистики. Для каждой выборки устанавливали среднее арифметическое (Х), ошибку среднего арифметического (т). Проверку на нормальность распределения осуществляли с использованием критерия Шапиро -Уилка. Сравнение выборочных средних проводили по ^критерию Стьюдента в случае нормального распределения или по критерию Крускалла - Уоллиса для к-несвязанных выборок (к > 2) в случае распределения, отличающегося от нормального. Различия считали достоверными при р < 0,05.
Результаты исследований. Метафазный метод учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга лабораторных животных рекомендован во всем мире [17] для установления генетической безопасности лечебных препаратов и веществ различной природы. Данный метод был выбран как наиболее распространенный, доступный и информативный для оценки мутагенности препаратов. Сущность данного метода заключается в фиксации и регистрации в клетках костного мозга мышей аберраций хромосом, индуцируемых изучаемым препаратом, на стадии метафазы.
Экспериментальные животные были разделены на четыре равные группы:
1) контрольная группа - животные, которым вводили основу лечебного препарата (отрицательный контроль) (п = 5),
2) контрольная группа - животные, которым вводили циклофосфамид в дозе 20 мг/кг массы тела (положительный контроль) (п = 5),
3) опытная группа 1 - животные, которым вводили тестируемый препарат (1,4-1,6)-109 КОЕ/мл
(П = 5),
4) опытная группа 2 - животные, которым вводили тестируемый препарат (1,4-1,6)-1010 КОЕ/мл
(П = 5).
В результате после однократного или пятикратного введения биопрепарата не отмечено статистически достоверного повышения числа клеток со структурными нарушениями хромосом в клетках костного мозга мышей по сравнению с группой отрицательного контроля (таблица 1).
Таблица 1 - Результаты оценки цитогенетической активности препарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов при однократном и пятикратном введении мышам линии BALB/c
Вариант/срок и условие исследования На 100 исследованных клеток Количество
Количество клеток Гепы Одиночные фрагменты Парные фрагменты Обмены Клетки с МП клеток с хромосомными повреждениями
Контрольная группа (основа препарата)* 500
24 ч 5 сут 1 3 8 7 0 0 0 0 0 0 9 10
Количество клеток с хромосомными повреждениями через 24 ч / 5 сут (%), М ± s (1,8 ± 0,4) / (2,0 ± 0,2)
Контрольная группа (циклофосфамид) 500
24 ч 5 сут 2 6 41 94 1 3 0 4 1 6 45 113
Количество клеток с хромосомными повреждениями через 24 ч / 5 сут (%), М ± s (9,0 ± 1,2) / (22,6 ± 2,4)
Опытная группа 1* ((1,4-1,6)-109 КОЕ/мл) 500
24 ч 5 сут 1 1 8 6 0 0 0 0 0 0 9 7
Количество клеток с хромосомными повреждениями через 24 ч / 5 сут (%), М ± s (1,8 ± 0,4) / (1,4 ± 0,4)
Опытная группа 2* ((1,4-1,6)-1010 КОЕ/мл) 500
24 ч 5 сут 2 1 4 8 0 0 0 0 0 0 6 9
Количество клеток с хромосомными повреждениями через 24 ч / 5 сут (%), М ± s (1,2 ± 0,2) / (1,8 ± 0,4)
Примечания 1 - * - Различия между вариантами статистически не значимы, р > 0,05. 2 - МП - Клетки с множественными аберрациями. 3 - М ± s - Выборочное среднее и стандартное отклонение.
Доля поврежденных клеток при различных экспозициях препарата у животных всех опытных групп не превышала 2 %. Анализ полученных результатов не показал статистически значимых различий между частотой образования аберрантных метафаз в контрольных и опытных группах при всех сроках экспозиции препарата. Не отмечено также статистически достоверных различий в характере повреждения хромосом в группах опыта и отрицательного контроля. В большинстве случаев хромосомные аберрации были представлены одиночными фрагментами, доля которых при различных сроках экспозиции препарата составляла (0,8-1,6 ± 0,2) %. Одиночные аберрации были представлены концевыми делециями. Клетки с парными фрагментами и множественными аберрациями не выявлены. В группе положительного контроля доля поврежденных клеток при экспозициях 6 и 24 часов составляла (1,8 ± 0,4) % и (2,0 ± 0,2) %, что в 5 и 11,3 раза превышало значение данного показателя в группе отрицательного контроля. Сравнение данных результатов с полученными контрольными значениями показало статистически достоверное различие между частотой образования аберрантных метафаз при всех экспозициях препарата (р > 0,05). Во многих случаях аномалии хромосомного материала были представлены одиночными фрагментами от 8,2 % до 18,8 %. Кроме того, было выявлено появление метафазных пластинок с множественными аберрациями и парных фрагментов от 0,2 % до 1,2 % и от 0,2 % до 0,6 % соответственно.
Одним из наиболее распространенных методов исследования генотоксического потенциала лечебных препаратов или веществ in vivo является учет микроядер в клетках млекопитающих [8, 9]. Микроядерный тест in vivo является быстрым и эффективным методом оценки численных или структурных хромосомных нарушений. Сущность данного теста заключается в обнаружении и количественном определении потенциальной цитогенетической активности изучаемого препарата или вещества на эритроцитах периферической крови млекопитающих. Поэтому следующим этапом исследования была оценка мутагенной активности биопрепарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов в экспериментах in vivo с применением метода учета микроядер в клетках крови мышей.
Экспериментальные животные были разделены на четыре равные группы:
1) контрольная группа - животные, которым вводили основу лечебного препарата (отрицательный контроль) (n = 5),
2) контрольная группа - животные, которым вводили колхицин в дозе в дозе 0,125 мг/кг массы тела (положительный контроль) (n = 5),
3) опытная группа 1 - животные, которым вводили препарат (1,4-1,6)-109 КОЕ/мл (n = 5),
4) опытная группа 2 - животные, которым вводили препарат (1,4-1,6)-1010 КОЕ/мл (n = 5).
В результате после однократного или пятикратного внутрибрюшинного введения биопрепарата не отмечали статистически достоверного повышения количества микроядерных эритроцитов у мышей по сравнению с группой отрицательного контроля. В группе негативного контроля частота клеток с аберрациями на пятые сутки составляла 1,41 %о, в группах, получавших препарат, от 1,23 %о до 1,44 %о (таблица 2).
Таблица 2 - Результаты оценки мутагенной активности биопрепарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов при однократном и пятикратном введении мышам линии BALB/c
Вариант/срок и условие исследования Количество эритроцитов с микроядрами в периферической крови (%о)
Контрольная группа (основа препарата)* 48 ч 5 сут 1,24 ± 0,19 1,41 ± 0,14
Контрольная группа (колхицин) 48 ч 5 сут 3,96 ± 0,27 4,22 ± 0,34
Опытная группа 1 ((2,1-4,6)-109 КОЕ/мл))* 48 ч 5 сут 1,39 ± 0,25 1,23 ± 0,17
Опытная группа 2 ((2,1-4,6)-1010 КОЕ/мл)* 48 ч 5 сут 1,20 ± 0,12 1,44 ± 0,22
Примечание - * - Различия между вариантами статистически не значимы, р > 0,05.
Анализ полученных результатов (таблица 2) не показал статистически значимых различий между частотой встречаемости полихромных эритроцитов в контрольных и опытных образцах при всех сроках экспозиции.
Полученные результаты методами учета хромосомных аберраций костного мозга и микроядер в клетках млекопитающих свидетельствуют об отсутствии мутагенной активности биопрепарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов. Необходимо отметить, что анализ данных литературы указывает на отсутствие канцерогенных свойств у препаратов и веществ не являющимися мутагенами. В связи с этим, наличие у разрабатываемого нами препарата канцерогенных свойств, связанных с генотоксичностью, маловероятно.
Заключение. Таким образом, методами учета аберраций хромосом в клетках костного мозга и учета микроядер в клетках млекопитающих, а также согласно общим принципам экстраполяции результатов, принятых в сфере генетической токсикологии [2, 11], установлено, что пробиотический препарат на основе штаммов Propionibacterium freudenreichii, Lactococcus lactis, Lactoplantibacillus plantarum, Lentilactobacillus bucheri, Ligilactobacillus salivarius не представляет мутагенной опасности.
Литература
1. Абилев, С. К. Ускоренные методы прогнозирования мутагенных и бластомогенных свойств химических соединений / С. К. Абилев, Г. Г. Порошенко // Итоги науки и техники. Серия Токсикология. - Москва : ВИНИТИ, 1986. - Т. 14. - 171 с.
2. Арефьев, В. А. Англо-русский толковый словарь генетических терминов / В. А. Арефьев, Л. А. Лисовенко. - Москва : ВНИРО, 1995. - 407 с.
3. Арифуллина, Л. Р. Консорциум бактерий как основа создания пробиотических добавок для животноводства / Л. Р. Арифуллина, Г. С. Волкова // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2018. -№ 1. - С. 4-45.
4. Влияние пробиотического препарата на основе Bacillus subtilis на микробное сообщество кишечника крыс / Е. В. Скворцов, Р. С. Мухаммадиев, Р. С. Мухаммадиев [и др.] // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю. А. Овчинникова. - 2019. - Т. 15, № 1. - С. 3035.
5. Иванов, Д. В. Современные технологии и технические средства приготовления силосованных кормов: учебное пособие / Д. В. Иванов. - Ставрополь : Ставропольский государственный аграрный университет, 2014. - 44 с.
6. Исследование цитотоксичности молочнокислых и пропионовокислых бактерий в тесте in vitro / Рин. С Мухаммадиев, Риш. С. Мухаммадиев, Е. В. Скворцов [и др.] // Ветеринарный врач. -2019. - № 4. - С. 17-20.
7. Пробиотики на основе живых культур микроорганизмов / В. В. Смирнов, Н. К. Коваленко,
B. C. Подгорский [и др.] // Микробиологический журнал. - 2002. - Т. 64, № 4. - С. 62-78.
8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под редакцией В. П. Фисенко, Е. В. Арзамасцева. - Москва : Ремедиум, 2000. - 398 с.
9. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. - Женева, 1989. - Вып. 51. - 212 с.
10. Современные бактериологические препараты: влияние на микробиоту кишечника и роль в лечении заболеваний / К. В. Раскина, Е. Ю. Мартынова, И. Р. Фатхутдинов [и др.] // Русский медицинский журнал - 2018. - Т. 26, № 5 (2). - С. 86-91.
11. Фонштейн, Л. М. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем / Л. М. Фонштейн, С. К. Абилев, Е. В. Бобринев. -Москва : Высшая школа, 1985. - 34 с.
12. Biodiversity, ecological determinants, and metabolic exploitation of sourdough microbiota / L. De Vuyst, G. Vrancken, F. Ravyts, T. Rimaux [et al.] // Food microbiology. - 2009. - Vol. 26 (7). - P. 666-675.
13. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella / microsome test: assay of 300 chemicals / J. McCann, E. Choi, E. Yamasaki [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1975. - Vol. 72.- P. 5135-5139.
14. Ford, C. E. Acolchicine, hypotonic citrate, squash sequence for mammalian chromosomes /
C. E. Ford, J. L. Hamerton // Stain Technol. - 1956. - Vol. 31. - Р. 247.
15. Giraffa, G. Importance of lactobacilli in food and feed biotechnology / G. Giraffa, N. Chanishvili, Y. Widyastuti // Research in microbiology. - 2010. - Vol. 161. - P. 480-487.
16. Oral administration of Lactobacillus plantarum strain AYA enhances IgA secretion and provides survival protection against influenza virus infection in mice / Y. Kikuchi, A. Kunitoh-Asari, K. Hayakawa [et al.] // Public Library of Science. - 2014. - Vol. 9 (1). - P. 1-9.
17. Preston, R. J. Mammalian in vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells / R. J. Preston // Mutation Research. - 1987. - Vol. 189. - P. 157-165.
18. Sarowska, J. Thetherapeutic effect of probiotic bacteria on gastrointestinal diseases / Sarowska,
I. Choroszy-Krol, B. Regulska-Ilow // Advances in Clinical and Experimental Medicine - 2013. - Vol. 22 (5).
- P.759-766.
19. Takeda, K. Effects of a fermented milk drink containing Lactobacillus casei strain Shirota on the human NK - cell activity / K. Takeda, K. Okumura // Journal of Nutrition. - 2007. - Vol. 137 (3). - P. 791-793.
20. Von Wright, A. Regulating the safety of probiotics the European approach / A. Von Wright // Current Pharmaceutical Design. - 2005. - Vol. 11. - P. 1 -23.
References
1. Abilev, S. K. Accelerated methods for predicting mutagenic and blastomogenic properties of chemical compounds. Itogi Nauki i Tekhniki. Series «Toxicology». - Moscow : VINITI, 1986. - Vol. 14. - P. 171.
2. Arefiev, V. A. English-Russian explanatory dictionary of genetic terms / V. A. Arefiev, L. A. Lisovenko. - Moscow : VNIRO, 1995. - 407 p.
3. Arifullina, L. R. Consortium of bacteria as a basis for the creation of probiotic supplements for animal husbandry / L. R. Arifullina, G. S. Volkova // Storage and processing of agricultural raw materials. -2018. - No 1. - P. 41-45.
4. Influence of a probiotic preparation based on Bacillus subtilis on the microbial community of the intestines of rats / E. V. Skvortsov, R. S. Muhammadiev, R. S. Mukhammadiev [et al.] // Bulletin of Biotechnology and Physico-Chemical Biology Yu. A. Ovchinnikova. - 2019. - Vol. 15 (1). - P. 30-35.
5. Ivanov, D. V. Modern technologies and technical means of preparing ensiled feed: a textbook / D. V. Ivanov- Stavropol : Stavropol State Agrarian University, AGRUS, 2014. - 44 p.
6. Study of the cytotoxicity of lactic acid and propionic acid bacteria in the in vitro test / Rin. S. Muhammadiev, Rish. S. Muhammadiev, E. V. Skvortsov [et al.] // The Veterinarian. - 2019. - No 4. - P. 1720.
7. Probiotics based on living cultures of microorganisms / V. V. Smirnov, N. K. Kovalenko, B. C. Podgorsky [et al.] // Microbiological journal. - 2002. - Vol. 64, No 4. - P. 62-78.
8. Guidelines for the experimental (preclinical) study of new pharmacological substances / edited by V. P. Fisenko, E. V. Arzamastsev, E. A. Babayan - Moscow : CJSC Remedium, 2000. - 398 p.
9. Guidelines for short-term tests for the detection of mutagenic and carcinogenic chemicals: Environmental health criteria. - Geneva : WHO, 1989. - No 51. - 212 p.
10. Modern bacteriological preparations: impact on the intestinal microbiota and the role in the treatment of diseases / K. V. Raskina, E. Yu. Martynova, I. R. Fatkhutdinov, Yu. E. Poteshkin // Russian medical journal - 2018. - Vol. 26, No 5 (2). - P. 81-91.
11. Fonshtein, L. M. Methods for the primary detection of the genetic activity of environmental pollutants using bacterial test systems / L. M. Fonshtein, S. K. Abilev, E. V. Bobrinev // Moscow : Higher School, 1985. - 34 p.
12. Biodiversity, ecological determinants, and metabolic exploitation of sourdough microbiota / L. De Vuyst, G. Vrancken, F. Ravyts, T. Rimaux [et al.] // Food microbiology. - 2009. - Vol. 26 (7). - P. 666675.
13. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella / microsome test: assay of 300 chemicals / J. McCann, E. Choi, E. Yamasaki [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1975. - Vol. 72.- P. 5135-5139.
14. Ford, C. E. Acolchicine, hypotonic citrate, squash sequence for mammalian chromosomes / C. E. Ford, J. L. Hamerton // Stain Technol. - 1956. - Vol. 31. - P. 247.
15. Giraffa, G. Importance of lactobacilli in food and feed biotechnology / G. Giraffa, N. Chanishvili, Y. Widyastuti // Research in microbiology. - 2010. - Vol. 161. - P. 480-487.
16. Oral administration of Lactobacillus plantarum strain AYA enhances IgA secretion and provides survival protection against influenza virus infection in mice / Y. Kikuchi, A. Kunitoh-Asari, K. Hayakawa [et al.] // Public Library of Science. - 2014. - Vol. 9 (1). - P. 1-9.
17. Preston, R. J. Mammalian in vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells / R. J. Preston // Mutation Research. - 1987. - Vol. 189. - P. 157-165.
18. Sarowska, J. Thetherapeutic effect of probiotic bacteria on gastrointestinal diseases / J. Sarowska, I. Choroszy-Krol, B. Regulska-Ilow // Advances in Clinical and Experimental Medicine. - 2013. - Vol. 22 (5).
- P.759-766.
19. Takeda, K. Effects of a fermented milk drink containing Lactobacillus casei strain Shirota on the human NK - cell activity / K. Takeda, K. Okumura // Journal of Nutrition. - 2007. - Vol. 137 (3). - P. 791-793.
20. Von Wright, A. Regulating the safety of probiotics the European approach / A. Von Wright // Current Pharmaceutical Design. - 2005. - Vol. 11. - P. 1-23.
© MyxaMMagueB phh. C., MyxaMMagueB Pum. C., BamynnHH H. P., MycHH P. P., TpeMacoBa A. M. 2023
