CC BY
38
Оценка морфологических изменений в органах белых мышей под действием экспериментальных препаратов Brucella abortus
Т.П. Старовойтова, С.А. Витязева, В.И. Дубровина ([email protected]), Л.М. Михайлов, Н.Л. Баранникова, Л.Е. Токарева, С.В. Балахонов, Т.Т. Шкаруба
ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
Резюме
Дана сравнительная оценка морфологических и гистологических изменений, вызванных введением инактивированной вакцины Brucella abortus 19 ВА и экспериментальных препаратов, полученных из B. abortus И-206, в L- и S-формах - термоэкстрактов (ТЭ) и корпускулярного антигена. Показано, что трехкратное интраперитонеальное введение экспериментальных препаратов не вызывает гибели белых мышей и не ухудшает их общего состояния. Корпускулярный антиген и ТЭ, полученные из B. abortus И-206 в L-форме, в отличие от ТЭ из B. abortus И-206 в S-форме, обладают способностью стимулировать иммунологическую перестройку в иммунокомпетентных органах, не вызывая побочных эффектов. Ключевые слова: S- и L-формы, бруцеллы, вакцина, морфология
Estimation of Morphological Alterations in White Mice organs under the Influence of Experimental Brucella Аbortus preparations
T.P. Starovojtova, S.A. Vltyazeva, V.I. Dubrovlnа ([email protected]), L.M. Mikhailov, N.L. Barannikova, L.E. Tokareva, S.V. Balakhonov, T.T. Shkaruba
Federal State Institution of Public Health «Irkutsk Antiplague Research Institute» of Federal Service on Customers' Rights Protection
and Human Well-Being Surveillance
Abstract
Comparative evaluation of the morphological and histologic alterations caused by introduction of Brucella abortus 19 ВА vaccine and experimental preparations from Brucella abortus I-206 in L- and S-forms: thermoextracts (IE) and a corpuscular antigen, is represented. It is shown that triple intraperitoneal injection of the experimental preparations neither cause death of the white mice nor worsen its general well-being. A corpuscular antigen and ТЕ from B. abortus I-206 in L-form unlike that from ТЕ B. abortus I-206 in S-form possess the ability to stimulate immunological reorganization in immunocompetent bodies without by-effects. Key words: S- and L-forms, Brucella, vaccine, morphology
Введение
Бруцеллез - зоонозное заболевание, при котором основным источником инфекции для людей являются больные сельскохозяйственные животные [1]. Заболеваемость людей бруцеллезом, регистрируемая в России, не имеет тенденции к снижению. Болезнь, как правило, принимает затяжное течение с поражением в первую очередь лимфоретикулярной системы с переходом в хроническую форму. Профилактика бруцеллеза главным образом заключается в выявлении и ликвидации носителей инфекции - больных животных, а также вакцинации декретированного контингента и животных [2, 3].
Иммунизация на территории Российской Федерации в течение длительного времени проводится живыми вакцинами, которые имеют ряд недостатков - сильное сенсибилизирующее действие, реак-тогенность и недостаточную эффективность, - что ограничивает их широкое применение [4]. Работа по конструированию новых вакцинных препаратов,
дающих более высокую защиту и не имеющих вышеперечисленных недостатков, особенно в отношении бруцелл в L-форме, ведется как у нас в стране, так и за рубежом [5].
Цель работы - сравнительный анализ морфологических и гистологических изменений в динамике при трехкратной иммунизации белых мышей экспериментальными препаратами, полученными из B. abortus И-206, в L- и S-формах, и инактивированной вакциной B. abortus 19 ВА.
Материалы и методы
Экспериментальной моделью в опытах служили 90 беспородных, но стандартных по условиям содержания и весу (18 - 20 г) белых мышей обоих полов. В качестве объектов исследования использовали инактивированную вакцину B. abortus 19 ВА и три экспериментальных препарата, полученные из B. abortus И-206: термоэкстракт (ТЭ) в L- и S-формах и корпускулярный антиген в L-форме.
Интактные белые мыши были разделены на четыре опытных (по 21 особи) и одну контрольную (6 особей) группы. Животных опытных групп иммунизировали интраперитонеально: корпускулярные антигены в дозе 5 х 109 м.к. в объеме 0,5 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР), ТЭ - 0,1 мкг в 0,5 мл ЗФР трехкратно с промежутком в 7 дней. Первой (I) опытной группе белых мышей вводили ТЭ B. abortus И-206 в L-форме, второй (II) - ТЭ B. abortus И-206 в S-форме, третьей (III) - корпускулярный антиген B. abortus И-206 в L-форме и четвертой (IV) - инактивированную вакцину B. abortus 19 ВА. В пятой (V) - контрольной - группе (интактные животные) вводили ЗФР с рН 7,2 в том же объеме.
Животных гуманным способом выводили из опыта (работу с экспериментальными животными проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» 2003 г., Приложением к Приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 775). Материал забирали через 1, 3 и 7 суток после первой иммунизации, на 3-и сутки после второй и на 1-е, 3-и и 7-е сутки - после третьей. При вскрытии проводили подробное описание макроизменений, вызванных вводимыми препаратами, в органах и тканях белых мышей. Анатомический материал фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине с последующей заливкой в целлоидин. Срезы толщиной не более 5 мкм красили гематоксилин-эозином, тионином и метиловым зеленым - пиронином по Браше [6].
В работе использовали методы обзорной микроскопии. При исследовании препаратов автоматический анализ изображения производили с помощью светового микроскопа Zeiss (Германия) с видеокамерой Moticam 2000 разрешением 1392 х 1040 пикселей, ок. 100, об. 10 и компьютерной программы Motic Images Plus (версия 2).
Результаты и обсуждение
После первой иммунизации при вскрытии у всех животных I группы выявлены изменения к 3-м суткам: селезенка слегка увеличена, полнокровна, с отчетливо выраженными фолликулами, печень дряблая. К 7-м суткам данные изменения имели место у 50% животных. При гистологическом исследовании на 3 - 7-е сутки в печени установлена умеренно выраженная зернистая дистрофия гепатоцитов, в селезенке и регионарном лимфатическом узле -небольшая гиперплазия фолликулов, инфильтрация красной пульпы, кортикальной и паракортикальной зон нейтрофилами и клетками моноцитарного ряда.
Макроскопически у белых мышей опытной группы на 1-е сутки выявлены незначительные изменения цвета и консистенции печени (дряблая с тонкими краями), у 25% животных селезенка увеличена, зернистого вида. На 3 - 7-е сутки исследования изменений в паренхиматозных органах не установлено. Во все сроки наблюдения кишеч-
ник не изменен, тем не менее к 7-м суткам пей-еровы бляшки отчетливо выражены. При микроскопическом исследовании на ранних сроках (1 -3-е сутки) в печени выявлены слабовыраженная зернистая дистрофия клеток паренхимы и небольшая гиперплазия купферовских клеток (звездчатых ретикулоэндотелиоцитов) (рис. 1). На 7-е сутки в синусах селезенки и лимфатического узла (брыжеечного) отмечены увеличение содержания лейкоцитов и полиморфно-ядерных нейтрофилов, гиперплазия фолликулов с хорошо выраженными герминативными центрами.
У животных I и II групп в месте введения препарата видимые изменения отсутствуют.
При введении белым мышам корпускулярного антигена, полученного из B. abortus И-206 в L-форме (III группа), на 1-е сутки исследования у 50% опытных животных выявлены дистрофические изменения в печени, инъекция сосудов подкожной клетчатки передней брюшной стенки в месте введения препарата, гиперплазия брыжеечного лимфатического узла. К 7-м суткам данные изменения нивелируются, но заметно увеличиваются пейеровы бляшки, селезенка приобретает зернистый вид и несколько увеличена в размере. Сравнительный анализ гистологических изменений в паренхиматозных органах белых мышей II и III опытных групп после однократной иммунизации различий не выявил.
У животных IV группы во все сроки наблюдения - печень глинистого цвета, зернистая, дряблая; селезенка увеличена, зернистого вида; гистологическая картина в паренхиматозных органах соответствует выраженному вакцинальному процессу; в селезенке - миелоидная метаплазия пульпы.
После вторичного введения экспериментальных препаратов макроскопические и микроскопические изменения на 3-и сутки соответствуют таковым на 7-е сутки после первой иммунизации, в то время как у животных, иммунизированных инактивированной бруцеллезной вакциной, они имеют выраженный характер (в печени - зернистая дистрофия с мелкоочаговой пролиферацией звездчатых клеток; в селезенке - повышенное содержание эозинофилов).
Рисунок 1.
Печень белой мыши на 3-и сутки после первой иммунизации ТЭ В. abortus И-206 в S-форме. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение 10 х 40
Установлено, что значительные изменения имеют место после третьей иммунизации. При введении инактивированной вакцины B. abortus 19 ВА на 1 - 7-е сутки у всех животных выявлены резкое увеличение размера селезенки - в 2 - 2,5 раза по сравнению с интактными животными (спленоме-галия), инъекция сосудов подкожной клетчатки и кишечника, небольшое кровоизлияние в верхнее брыжеечное сплетение. Брыжеечный лимфатический узел не изменен. Печень глинистого цвета, дряблая, зернистая. У 30% животных на 7-е сутки в почках выявлены признаки дистрофии - дряблость, неотчетливость слоев, изменение цвета. При просмотре гистологических препаратов в печени экспериментальных животных отмечаются: зернистая дистрофия, что к 7-м суткам сочетается с умеренно выраженным полнокровием вен и си-нусоидов; диффузное кровоизлияние; небольшой периваскулярный отек поддольковой вены и вены триады; диапедез (рис. 2); пролиферация купфе-ровских клеток, лейкоцитов и эозинофилов. Выявлены признаки развития специфического грануле-матозного процесса, размер гранулем составляет в среднем 5309,3 ± 879,9 мкм2 (рис. 3).
В селезенке помимо гиперплазии белой пульпы имеют место полнокровие и кровоизлияние преимущественно вокруг фолликулов, инфильтрация пульпы миелоидными элементами (мегакариоци-
Рисунок 2.
Печень белой мыши на 7-е сутки после третьей иммунизации вакциной В. abortus 19 ВА. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение 10 x 40
Рисунок 3.
Печень белой мыши на 7-е сутки после третьей иммунизации вакциной В. abortus 19 ВА. Признаки развития специфического гранулематозного процесса Окраска гематоксилином и эозином, увеличение 10 x 40
ты, миелоциты) и эозинофилами, а также очаговая инфильтрация бластными формами клеток (плаз-мобласты, лимфобласты и др.) около сосудов и тра-бекул. В почках - расширение сосудов, просветы канальцев сужены, цитоплазма зернистого вида, что указывает на зернистую дистрофию эпителия почечных канальцев. В регионарном лимфатическом узле на 7-е сутки выявлена инфильтрация мя-котных тяжей плазмобластами и плазматическими клетками.
При трехкратном введении экспериментальным животным ТЭ B. abortus И-206 в S-форме (II опытная группа) наиболее выраженные патоморфоло-гические изменения установлены только на 3-и сутки исследования. У 30% белых мышей они соответствуют макро- и микроизменениям, выявленным у особей опытной группы, за исключением патологических особенностей в почках, а также выраженной плазмоцитарной реакции в иммуно-компетентных органах и эозинофилии.
У белых мышей I и III групп во все сроки наблюдения установлено: селезенка обычного размера, слегка зернистого вида, печень глинистого цвета с тонкими краями. При исследовании гистологических срезов на 1 - 3-и сутки у 20% животных, иммунизированных ТЭ B. abortus И-206 в L-форме, и у 60% особей, получивших корпускулярный антиген B. abortus И-206 в L-форме, имела место зернистая дистрофия печени. В селезенке иммунизированных животных обеих групп выявлено увеличение доли белой пульпы (за счет пролиферации молодых форм клеток в реактивном центре фолликулов), что может быть расценено как иммунная перестройка макроорганизма (рис. 4, 5). На 7-е сутки изменений в органах не выявлено.
Таким образом, показано, что трехкратное ин-траперитонеальное введение экспериментальных препаратов не вызывает гибели белых мышей и не ухудшает их общего состояния.
При сравнительном анализе полученных результатов установлено, что введение корпускулярного антигена и ТЭ, полученных из B. abortus И-206 в L-форме, необратимых изменений в организме экспериментальных животных не вызывает, все
Рисунок 4.
Селезенка белой мыши, привитой ТЭ В. abortus И-206 в L-форме, на 3-и сутки после третьей иммунизации. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение 10 x 10
Рисунок 5.
Селезенка белой мыши, привитой В. abortus И-206 в L-форме, на 3-и сутки после третьей иммунизации. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение 10 x 10
выявленные особенности носят продуктивный характер. У особей, получивших ТЭ B. abortus И-206 в S-форме, установленные на 3-и сутки после трехкратной иммунизации дистрофические изменения в печени и увеличение селезенки нивелируются
к 7-м суткам. В отличие от белых мышей, получивших экспериментальные препараты, у животных, вакцинированных инактивированной B. abortus 19 ВА, выявленные патоморфологические изменения (спленомегалия, дистрофические изменения в печени и почках, воспалительные поражения сосудов (васкулит) и формирование гранулем в печени), возможно, связаны с реактогенностью вакцины.
Выводы
1. Корпускулярный антиген и ТЭ, полученные из B. abortus И-206, в L-форме обладают способностью активизировать иммунологическую перестройку в иммунокомпетентных органах, не вызывая побочных эффектов, в отличие от ТЭ B. abortus И-206 в S-форме.
2. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейшего изучения и накопления новых данных о воздействии этих препаратов на организм экспериментальных животных.
Литература
1. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: Практическое руководство. 2-е изд. Москва: Шико; 2013.
2. Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я. Лекции по инфекционным болезням. 3-е изд., перераб. и доп. Москва: Медицина; 2007.
3. Братцев А.Ю., Гордиенко Л.Н. Степень патогенности бруцелл в зависимости от их происхождения и форм существования. Актуальные проблемы ветеринарной медицины: Сб. науч. тр. Омск; 2005: 68 - 71.
4. Козловский В.Н. Живые туляремийная и бруцеллезная вакцины как индукторы иммунологических реакций: Автореф. дис. ... д-ра. мед. наук. Ростов-на-Дону; 1997.
5. Булдыгин Д.В., Гордиенко Л.Н., Шестаков В.А., Братцев А.Ю. Степень выраженности реакции организма лабораторных животных в зависимости от введенной дозы L-культуры бруцелл. Материалы Всероссийской научной конференции по проблемам хронических инфекций (бруцеллез, туберкулез): Сб. науч. тр. Омск; 2001: 86 - 89.
6. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. Ленинград: Медицина; 1969.
References
1. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V. Laboratory diagnostics of dangerous infectious diseases. Prakt. rukovodstvo. 2 edition. Мoscow: Shiko; 2013 (in Russian).
2. Yushchuk N.D., Vengerov Yu.Ya. Lectures on Infectious Diseases. Мoscow: Medicina; 2007 (in Russian).
3. Bratsev АЛЬ., Gordienko L.N. Degree of Brucella pathogenicity depending on its origin and existence forms. Aktualnye problemy veterinarnoi mediciny: Collected scientific papers, Omsk; 2005: 68 - 71 (in Russian).
4. Kozlovsky V.N. Live tularemia and brucellosis vaccines as inductors of immunological reactions: Doctor of med. sci. diss. Rostov-on-Don; 1997 (in Russian).
5. Buldygin D.V., Gordienko L.N., Shestakov V.A., Bratsev A.Yu. Expressiveness degree of the laboratory animal reactions depending on the dose of Brucella L-culture. Materials of the All-Russia Scientific Conference on Problems of Chronic infections (brucellosis, tuberculosis): Collected scientific papers, Omsk; 2001: 86 - 89 (in Russian).
6. Merkulov G.A. A course of pathohistological technology. Leningrad: Medicine; 1969 (in Russian).
Специалисты СПЭБ-2 Иркутского противочумного института - участники санитарно-противоэпидемических (профилактических) работ в зоне чрезвычайной ситуации, связанной с подтоплением в Хабаровском крае и Еврейской автономной области (2013 г.)
