CC BY
24
Действие экспериментальных препаратов Brucella abortus в L- и S-форме на субпопуляционный состав клеток крови и перитонеальной жидкости белых мышей (Сообщение 2)
С.А. Витязева, Т.П. Старовойтова, В.И. Дубровина (dubrovina-valya@mail.ru), Л.М. Михайлов, К.Ю. Ястремская, Л.Е. Токарева, Н.Л. Баранникова, С.В. Балахонов
ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора
Резюме
Дана сравнительная оценка воздействия инактивированной вакцины Brucella abortus 19 ВА, термоэкстрактов Brucella abortus И-206 в L- и S-форме и корпускулярного антигена Brucella abortus И-206 в L-форме на популяционный и субпопуляционный состав клеток крови и перитонеальной жидкости белых мышей.
Показано, что антигенные препараты Brucella abortus И-206 в L-форме, в отличие от инактивированной вакцины Brucella abortus 19 ВА, не вызывают эндогенной интоксикации организма экспериментальных животных. Ключевые слова: L- и S-формы, бруцеллез, вакцина, кровь, перитонеальная жидкость, интоксикация
The Action of inVestigational Drugs of Brucella abortus in the L- and S-forms on the Subpopulations of Blood cells and peritoneal Fluid of White Mice (communication 2)
S.A. Vltyazeva, T.P. Starovoitova, V.I. Dubrovina (dubrovlna-valya@mall.ru), L.M. Mikhailov, K.Yu. Yastremskaya, L.E.Tokareva, N.L. Barannikova, S.V. Balakhonov
Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and the Far East of IFederal Service on Customers' Rights Protection
and Human Well-Being Surveillance
Abstract
We have estimated the effects of the Brucella abortus 19 ВА inactivated vaccine, thermo extracts of Brucella abortus I-206 in the L- and S-forms and corpuscular antigen of Brucella abortus I-206 in L-form on the population and subpopulation structure of blood cells and peritoneal fluid of white mice.
It was showed that the antigen preparations of Brucella abortus I-206 in L-form didn't caused endogenous intoxication of the organism of experimental animals in distinction from the inactivated vaccine of Brucella abortus 19 BA. Key words: L- and S-forms, brucellosis, vaccine, blood, peritoneal fluid, intoxication
Введение
Для специфической профилактики бруцеллеза на территории Российской Федерации в течение длительного времени применяются живые вакцины, которые имеют ряд преимуществ перед химическими и инактивированными корпускулярными вакцинами в отношении напряженности и продолжительности поствакцинального иммунитета. Однако, обладая остаточной вирулентностью и реактогенностью, в некоторых случаях вакцинный штамм B. abortus 19 ВА может вызывать осложнения, такие как аллер-гизация макроорганизма, нарушение иммуногоме-остаза, и другие патологические изменения [1 - 5].
Поскольку использование в профилактике бруцеллеза конъюгированных и химических вакцин не получило широкого применения, работа в направлении конструирования новых препаратов, дающих защиту и не имеющих недостатков, остается актуальной. Для приготовления вакцин отбирают
штаммы с высокой иммуногенностью и сниженной вирулентностью, восстановление которой практически невозможно. В связи с этим большой интерес представляют изучение ответной реакции макроорганизма на введение слабовирулентных бру-целл в L-форме и возможность их использования для конструирования вакцинных препаратов [3, 6].
Цель работы - изучить субпопуляционный состав мононуклеарных клеток периферической крови и перитонеальной жидкости белых мышей, иммунизированных экспериментальными препаратами Brucella abortus И-206 в L- и S-форме и инактивированной вакциной B. abortus 19 ВА.
Материалы и методы
Исследование проводили на 90 беспородных белых мышах обоего пола массой от 18 до 20 г, стандартных по условиям содержания. В качестве объектов исследования использовали инактивиро-
ванную вакцину B. abortus 19 ВА и три экспериментальных препарата: термоэкстракты (ТЭ), полученные из B. abortus И-206 в L- и S-формах, и корпускулярный антиген (КА) в L-форме.
Животные были разделены на четыре опытные (по 21 особи) и одну контрольную (шесть особей) группы. Белых мышей опытных групп иммунизировали интраперитонеально трехкратно с промежутком в семь дней: корпускулярные антигены вводили в дозе 5 х 109 м.к. в объеме 0,5 мл забуферен-ного физиологического раствора (ЗФР), ТЭ - 0,1 мг в 0,5 мл ЗФР. Содержание белка в ТЭ B. abortus И-206 в L-форме составляло 92,4 мкг; ТЭ B. abortus И-206 в S-форме - 33,2 мкг. В I опытной группе белым мышам вводили ТЭ B. abortus И-206 в L-форме, во II - ТЭ B. abortus И-206 в S-форме, в III - корпускулярный антиген B. abortus И-206 в L-форме и в IV - инактивированную вакцину B. abortus 19 ВА. V - контрольная группа (интактные животные) - получала ЗФР рН 7,2 в том же объеме.
Кровь на исследование у животных забирали прижизненно из хвостовой вены через 4 часа, в 1-е, 3-и и 7-е сутки после первой иммунизации, через 4 часа и на 3-и сутки после второй и через 1, 3 и 7 суток после третьей ревакцинации. Забор перитонеальной жидкости осуществляли в те же сроки, кроме 4 часов. Животных выводили из опыта в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» 2003 года, (приложение к Приказу МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г.), вскрывали брюшную полость и из перитонеальной жидкости готовили мазки. Фиксированные препараты крови и перитонеальной жидкости окрашивали по стандартным методикам [7].
В работе использовали методы обзорной микроскопии. Процентное соотношение различных видов лейкоцитов в мазках определяли методом морфологического исследования форменных элементов крови и перитонеальной жидкости. Оценку степени аллергизации определяли в периферической крови по соотношению клеток гранулоцитарного ростка и рассчитывали индекс аллергизации (ИА) [8].
Степень интоксикации оценивали после третьей иммунизации на 7-е сутки, используя лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ), вычисляемый по формуле Кальф-Калифа [8, 9].
Автоматический анализ изображения производили с помощью светового микроскопа Zeiss (Германия) с видеокамерой Moticam 2000, разрешение 1392 х 1040 пикселей, ок. 100, об. 10 с использованием компьютерной программы Motic Images Plus (версия 2).
Достоверность результатов исследования оценивали математическими методами статистической обработки с применением сравнительного анализа по t-критерию Стьюдента и компьютерной программы «Statistica», версия 6 (©Stat Soft, Inc 19842001, ИПЧИ 31415926535897), и пакета программ Microsoft Office Excel (2003).
Результаты считали достоверными при р < 0,05 по отношению к контролю.
Результаты и обсуждение
Сравнительный анализ данных, полученных при обследовании экспериментальных животных после введения препаратов, показал достоверное увеличение количества эозинофилов в крови белых мышей на ранних сроках исследования (через 4 часа, 1-е сутки) относительно контроля при введении ТЭ B. abortus И-206 в L-форме в 7 раз (ИА -0,11 у.е.) (t = 8,45, df = 10, р < 0,001) и КА B. abortus И-206 в L-форме в 5 раз (ИА - 0,09 у.е.) (t = 7,07, df = 10, р < 0,001) с последующим снижением к 7 суткам до контрольных значений (1,0 ± 0,02). Также имеет место незначительная лимфо-пения за счет увеличения числа моноцитов в 2,2 -2,6 раза (t = 7,2, df = 10, р < 0,001 и t = 18,9, df = 10, р < 0,001 соответственно в I и III группах). Выявлено статистически достоверное повышение количества (в 3,5 раза) палочкоядерных нейтро-филов (t = 3,45, df = 10, р < 0,01; t = 5,06, df = 10, р < 0,001 соответственно в I и III группах) по сравнению с контролем. Такие изменения состава крови сохранялись до 3-х суток наблюдения с последующей тенденцией к снижению.
У животных II и IV групп количество эозинофилов в крови соответствовало таковому в контроле.
При инокуляции инактивированной вакцины B. abortus 19 ВА в периферической крови животных через 4 часа и до 3-х суток регистрировалось статистически достоверное повышение количества палочкоядерных нейтрофилов в 8 раз (t = 14,4, df = 10, р < 0,001) по сравнению с контролем (0,50 ± 0,02%). К 7-м суткам выявлялись лимфопения и увеличение количества сегменто-ядерных нейтрофилов, что характерно при воспалительных процессах и интоксикациях.
У особей II опытной группы выраженных изменений к 3-м суткам наблюдения не выявлено.
К 7-м суткам после иммунизации в лейкограм-ме периферической крови животных всех опытных групп отмечались моноцитоз (рис. 1) и появление молодых форм клеток, что можно расценивать как активизацию гранулоцитарного ростка
Рисунок 1.
Кровь белой мыши. 7-е сутки после первой иммунизации.
В. abortus И-206 в L-форме. Моноцитоз. Окраска по Романовскому-Гимзе, увеличение 10 х 100
гемопоэза, а моноцитоз - как иммунологическую перестройку макроорганизма.
В перитонеальной жидкости интактных животных общее количество клеток составляло (4,3 ± 0,3) х 103 в 1 мкм3, при этом макрофаги преобладали - 68,5 ± 0,5% от общего числа клеток (на долю лимфоцитов приходилось 17,0 ± 0,5%, на клетки мезотелия и другие клеточные элементы -14,5 ± 0,5%).
При введении препаратов на 1 - 3-и сутки у животных всех опытных групп регистрировалось увеличение общего количества ядерных клеток в перитонеальной жидкости за счет притока ней-трофилов и лимфоцитов. К 7-м суткам количество ядерных клеток у белых мышей группы снижалось, приближаясь к значениям интактных животных (4,9 ± 0,6) х 103 в 1 мкм3), а у особей II, III и IV групп сохранялось на уровне 1 - 3-х суток 6,4 ± 0,7) х 103, (5,9 ± 0,2 )х 103 и (6,8 ± 0,6) х 103 в 1 мкм3 соответственно).
После первой иммунизации у животных всех опытных групп во все сроки наблюдения имело место снижение числа моноцитов в перитонеальной жидкости, увеличение сегментоядерных нейтрофи-лов и лимфоцитов, особенно это было выражено у животных, получивших ТЭ из B. abortus И-206 в S-форме и инактивированную вакцину B. abortus 19 ВА. К 7-м суткам только у белых мышей IV группы отмечалось наличие в экссудате двуядерных клеток и клеток раздражения, что может свидетельствовать о токсичности данного препарата.
Через 4 часа после вторичной иммунизации в периферической крови белых мышей, получивших инактивированную вакцину B. abortus 19 ВА, отмечалось увеличение числа эозинофилов, превышающее значение у интактных белых мышей в 9,4 раза (t = 20,1, df = 10, р < 0,001). Индекс аллергизации составил 0,27 ± 0,05 у.е., что превышает таковой в контроле в 8 раз. К 3-м суткам имели место нейтропения на фоне увеличения общего числа лейкоцитов и лимфоцитоз (в основном за счет малых лимфоцитов), выявлены клетки раздражения (рис. 2), фагоцитирующие клетки и сегментоядерные моноциты.
У экспериментальных мышей I, II и III групп во все сроки исследования после второй иммуниза-
ции сохранялся незначительный моноцитоз за счет уменьшения количества лимфоцитов.
В клеточном составе перитонеальной жидкости на 1 - 3-и сутки после повторной иммунизации у животных II и III групп изменения были однотипны: увеличение количества лимфоцитов в 1,6 (t = 13,7, df = 10, р < 0,001) и в 1,7 раза (t = 23,5, df = 10, р < 0,001), сегментоядерных нейтрофилов в 1,6 (t = 6,6, df = 10, р < 0,001) и в 1,4 раза (t = 5,8, df = 10, р < 0,001) соответственно. У белых мышей I группы данные показатели соответствовали контрольным значениям (18,2 ± 0,9%; 5,3 ± 0,3%). Существенные изменения регистрировались только у животных IV опытной группы: увеличение числа молодых форм клеток в 3 раза (t = 7,03, df = 10, р < 0,001), тканевых базофилов - в 2,4 раза (t = 3,97, df = 10, р < 0,01) по сравнению с контролем и наличие клеток раздражения. Многие тканевые базофилы находились в состоянии дегрануляции (рис. 3), также были выявлены двуядерные и плазматические клетки (рис. 4).
После третьей иммунизации через сутки у белых мышей I, II и III опытных групп в лейкограмме периферической крови существенных изменений не выявлено. Показатель ЛИИ - в пределах нормы (0,30 - 1,00 у.е.): 0,60 ± 0,08; 1,00 ± 0,09 и 0,90 ± 0,03 у.е. соответственно. ИА соответство-
Рисунок 3.
Перитонеальная жидкость белой мыши. 3-и сутки после второй иммунизации В. abortus 19 ВА. Дегрануляция тканевых базофилов. Окраска по Романовскому-Гимзе, увеличение 10 х 100
Рисунок 2.
Кровь белой мыши. 3-и сутки после второй иммунизации В. abortus 19 ВА. Клетка раздражения. Окраска по Романовскому-Гимзе, увеличение 10 х 100
Рисунок 4.
Перитонеальная жидкость белой мыши. 3-и сутки после второй иммунизации В. abortus 19. Двуядерные и плазматические клетки. Окраска по Романовскому-Гимзе, увеличение 10 х 100
Рисунок 5.
Кровь белой мыши. 3-ти сутки после третьей иммунизации В. abortus 19 ВА. Митоз, эозинофилия. Окраска по Романовскому-Гимзе, увеличение 10х100
вал значениям в контроле (0,03 ± 0,01 у.е.). У животных IV группы в крови выявлено повышение общего числа лейкоцитов, лимфоцитов и эозино-филов на фоне нейтропении ЛИИ была выше предельной нормы в 1,5 раза - 1,50 ± 0,08 у.е. ИА в 3 раза превосходил показатели в контроле - 0,09 ± 0,02 у.е., что может свидетельствовать об аллергической реакции организма на введение препарата. Через трое суток исследования в лейкограмме опытных белых мышей первых трех групп отмечался нейтрофилез за счет снижения количества лимфоцитов. У мышей IV опытной группы на фоне незначительной нейтропении регистрировалось небольшое увеличение лимфоцитов, эозинофилов. Также в крови животных II и IV группы имелись клетки раздражения, отмечался митоз.
На 7-е сутки после третьей иммунизации у животных всех опытных групп имело место повышение общего числа лейкоцитов: у белых мышей I и III опытных групп за счет больших широкоплазменных лимфоцитов и овально-ядерных моноцитов, у животных II и IV групп - лимфоцитов. Имелись единичные плазматические клетки. ЛИИ у животных I и III групп соответствовал значениям в контроле (0,80 ± 0,04, 0,95 ± 0,05 у.е.), у белых мышей II и IV групп - увеличен в 1,4 и 1,8 раза соответственно. В крови животных этих групп регистрировались увеличение молодых форм клеток, наличие лимфоцитов в состоянии раздражения, двуядерных клеток, что свидетельствует о развитии интоксикации, вызванной введением экспериментальных препаратов.
В перитонеальной жидкости опытных животных всех групп на 1 - 3-е сутки после третьей иммунизации регистрировалось увеличение количества сегментоядерных и палочкоядерных нейтрофилов (рис. 5), лимфоцитов, что можно рассматривать
как воспалительную реакцию на введение препаратов. Подобные изменения наиболее выражены у животных II и IV групп.
На 7-е сутки после третьей иммунизации в перитонеальной жидкости животных I и III опытных групп отмечалось незначительное увеличение лимфоцитов. Тканевые базофилы в состоянии де-грануляции отсутствовали. У белых мышей II и IV групп регистрировалось увеличение количества лимфоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, клеток мезотелия.
Таким образом, изучение морфологического состава периферической крови экспериментальных белых мышей показало, что наиболее выраженные изменения наблюдаются при введении инактивированной вакцины B. abortus 19 ВА - эозинофилия, нейтропения и лимфоцитоз периферической крови, а также увеличение количества дегранулированных тучных клеток в перитонеальной жидкости экспериментальных животных. Применение данного препарата приводило к увеличению числа сегментоядерных моноцитов, малых лимфоцитов в периферической крови и молодых форм клеток, лимфоцитов в перитонеальной жидкости, что можно расценивать как осложненное течение вакцинального процесса. Подобные, но менее выраженные изменения выявлялись и у животных, иммунизированных ТЭ B. abortus И-206 в S-форме.
Полученные данные указывают на эндогенную интоксикацию, вызванную введением КА B. abortus 19 ВА и ТЭ B. abortus И-206 в S-форме. Менее выраженные изменения на протяжении всего опыта регистрировались у белых мышей, иммунизированных КА B. abortus И-206 в L-форме и ТЭ B. abortus И-206 в L-форме.
Выводы
1. Применение корпускулярного антигена B. abortus 19 ВА приводит к изменениям клеточного состава периферической крови и перитонеальной жидкости, которые можно оценивать как осложненное течение вакцинального процесса (нарушение иммуногомеостаза, аллергизация макроорганизма).
2. Показано, что применение ТЭ B. abortus И-206 в L-форме не вызывает патологических изменений в макроорганизме.
3. Анализ полученных результатов свидетельствует о перспективности дальнейшего исследования иммуногенных свойств ТЭ B. abortus И-206 в L- и S-форме. ш
Литература
1. Желудков М.М. Бруцеллез в России: современная эпидемиология и лабораторная диагностика: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Москва; 2009.
2. Козловский В.Н. Живые туляремийная и бруцеллезная вакцины как индукторы иммунологических реакций: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Ростов-на-Дону; 1997.
3. Божко А.В., Гордиенко Л.Н., Ощепков В.Г. Опыт иммунизации морских свинок L-формой штамма Brucella abortus 19. Материалы Всероссийской научной конференции по проблемам хронических инфекций (бруцеллез, туберкулез): Сб. науч. тр. Омск, 2001: 93 - 96.
4. Михайлов Л.М., Калиновский А.И., Баранникова Н.Л., Чеснокова М.В., Вишняков В.А., Балахонов С.В. и др. Расследование осложненных поствакцинальных реакций на бруцеллез у людей в Республике Бурятия. Инфекционные болезни. 2012; 10 (4): 76 - 81.
5. Братцев А.Ю., Гордиенко Л.Н. Степень патогенности бруцелл в зависимости от их происхождения и форм существования. Актуальные проблемы ветеринарной медицины: Сб. науч. тр. Омск; 2005: 68-71.
6. Булдыгин Д.В., Гордиенко Л.Н., Шестаков В.А., Братцев А.Ю. Степень выраженности реакции организма лабораторных животных в зависимости от введенной дозы L-культуры бруцелл. Материалы всероссийской научной конференции по проблемам хронических инфекций (бруцеллез, туберкулез): Сб. науч. тр. Омск; 2001: 86 - 89.
7. Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая РП. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник. Москва: Медицина; 1987.
8. Витязева С.А., Старовойтова Т.П., Дубровина В.И., С.А. Татарников, Т.Т. Шкаруба. Сравнительная характеристика гематологических изменений периферической крови морских свинок, зараженных различными подвидами возбудителя туляремии. Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2010; 1 (71): 63 - 66.
9. Кобец Т.В., Некрасов В.Н., Мотрич А.К. Роль лейкоцитарных индексов в оценке адаптационно-компенсаторных возможностей чукотских детей, больных рецидивирующим бронхитом, на этапе санаторно-курортного лечения. Вестник физиотерапии и курортологии. 2004; 9 (3): 47, 48.
References
1. Zheludkov M.M. Brucellosis in Russia: modern epidemiology and laboratory diagnosis: PhD of med. sci. diss. Moscow; 2009 (in Russian).
2. Kozlowskiy V.N. The live tularemia and brucellosis vaccine as inducers of the immune responses: PhD of med. sci. diss. Rostov-on-Don; 1997 (in Russian).
3. Bozhko A.V., Gordienko L.N., Oschepkov V.G. Experience immunization of the guinea pigs Brucella abortus 19 strain in L-form. Proceedings of the Scientific Conference on chronic infections (brucellosis, tuberculosis): Sb. nauch. tr. Omsk, 2001: 93 - 96 (in Russian).
4. Mikhaylov L.M., Kalinovskiy A.I., Barannikova N.L., Chesnokova M.V., Vishnyakov V.A., Balakhonov et al. Investigation of complicated post-vaccinal reactions on brucellosis in the population of the Buryat Republic. Infektsionnyye bolezni. 2012; 10 (4): 76 - 81(in Russian).
5. Brattsev A.YU., Gordiyenko L.N. The degree of Brucella pathogenicity depending on its origin and forms of the existence. Aktual'nyye problemy veterinarnoy meditsiny: Sb. nauch. tr. Omsk, 2005: 68 - 71 (in Russian).
6. Buldygin D.V., Gordiyenko L.N., Shestakov V.A., Brattsev A.Yu. Degree of manifestation of reaction in the organism of laboratory animals depending on the entered dose of Brucella L-culture. Proceedings of the Scientific Conference on chronic infections (brucellosis, tuberculosis): Sb. nauch. tr. Omsk, 2001: 86 -89 (in Russian).
7. Men'shikov V.V., Delektorskaya L.N., Zolotnitskaya R.P Laboratory Methods in clinic: Directory. Moscow: Medicina; 1987 (in Russian).
8. Vityazeva S.A., Starovoitova T.P., Dubrovina V.I., S.A. Tatarnykov, T.T. Shkaruba. Comparative characterization of hematological alterations in peripheral blood of guinea pigs infected with different Francisella tularensis strains. Bulletin of the East-Siberian Centre of Science of the Siberian Branch of the Russian Academy of Med. Sciences. 2010; 1 (71): 63 - 66 (in Russian).
9. Kobets T.V., Nekrasov V.N., Motrich A.K. The role of leukocyte indices in the evaluation of adaptive-compensatory abilities of the children of Chukotka with recurrent bronchitis on the stage of sanatorium treatment. Vestnik fizioterapii i kurortologii. 2004; 9 (3): 47, 48 (in Russian).
Рекомендации по вакцинации детей с сахарным диабетом
(Окончание. Начало на странице 101)
Считается, что у детей с СД 1-го типа, в отличие от взрослых, антительный ответ на столбнячный и дифтерийный анатоксин не снижен [5, 17, 25, 26]. Вакцинация против дифтерии и столбняка детей, с СД, проведенная как до развития заболевания, так и после него, приводит к формированию полноценного специфического иммунитета [5]. Через четыре-пять лет после завершения первичной вакцинации и ревакцинации у всех детей сохранялся защитный уровень антител к дифтерии и столбняку.
Некоторые исследования показывают, что уровень поствакцинальных антител снижается со стажем заболевания СД, при увеличении интервала после последней прививки, но не зависит от типа СД, в связи с тем, что гипергликемия не может влиять на выработку поствакцинальных антител. Таким образом, надлежит следить за прививочным статусом против дифтерии и столбняка у пациентов с СД и при необходимости проводить дополнительные ревакцинации [17].
Антитоксический противодифтерийный иммунитет у детей с СД снижается быстрее наступления сроков ревакцинаций, регламентируемых Национальным календарем профилактических прививок. Напряженность иммунитета к дифтерии повыша-
лась с увеличением числа вакцинаций и ревакцинаций и снижалась с увеличением интервала после последней прививки независимо от того, что применяли для первичной иммунизации - АКДС или АДС-М препараты.
Концентрация антител к столбняку коррелировала также с числом ревакцинаций и длительностью заболевания и независимо от числа ревак-цинирующих прививок уменьшалась с удлинением интервала после иммунизация. Уровень защищенности против столбняка при наличии одной и двух ревакцинаций превышал показатели иммунитета к дифтерии, и только третья ревакцинация сглаживала индивидуальные особенности иммунного ответа на вакцинные антигены. Число осложнений СД негативно отражается на напряженности иммунитета к столбняку. СГТ АТ постоянно была на уровне средних и высоких значений, однако регрессионный анализ показал, что ^-АТ как к дифтерии, так и к столбняку после третьей ревакцинации снижались ниже защитного уровня через семь лет.
Список литературы можно получить в редакции.
