CC BY
389
Для корреспонденции
Гмошинский Иван Всеволодович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-71 E-mail: gmosh@ion.ru
Шипелин В.А., Шумакова А.А., Трушина Э.Н., Мустафина О.К., Селифанов А.В., Сото Х.С., Маркова Ю.М., Пичугина Т.В., Полянина А.С., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А.
Оценка in vivo подострой пероральной токсичности многостенных углеродных нанотрубок
Subacute oral toxicity in vivo of multi-walled carbon nanotubes
Shipelin V.A., Shumakova A.A., Trushina E.N., Mustafina O.K., Selifanov A.V., Soto Kh.S., Markova Yu.M., Pichugina T.V., Polyanina A.S., Gmoshinsky I.V., Khotimchenko S.A.
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва
Federal Research Centre of of Nutrition, Biotechnology and Food Safety,
Moscow
Многостенные углеродные нанотрубки (УНТ) рассматриваются в настоящее время как загрязнители окружающей среды, обладающие повышенной опасностью. В последнее время многостенные УНТ привлекают к себе внимание как перспективные компоненты упаковочных материалов для пищевой продукции, в качестве носителей для стимуляторов роста сельскохозяйственных растений, компонентов агрохимикатов и перспективных пестицидов, что создает вероятность их поступления через желудочно-кишечный тракт. Цель работы -оценка подострой пероральной токсичности многостенных УНТ для крыс в эксперименте длительностью 100 сут. Использовали препарат многостенных УНТ «Таунит-М®», охарактеризованный методами электронной микроскопии и комбинационного лазерного светорассеяния. Для введения животным нано-материал диспергировали в воде в присутствии 1% по массе неионогенного поверхностно-активного вещества (ПАВ) Тшвви 20 с обработкой ультразвуком. Эксперимент проведен на 80 растущих крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 86±2 г. Крысы опытных групп (со 2-й по 5-ю) получали вместо питьевой воды дисперсии многостенных УНТ, животные 1-й, контрольной, группы - раствор носителя (ПАВ). Дозы потребляемых многостенных УНТ составляли для 1-5-й групп соответственно 0 (контроль); 0,01; 0,1; 1,0 и 10 мг на 1 кг массы тела. После выведения из эксперимента у животных определяли гематологические и биохимические показатели крови по стандартным методикам, активность глутатионпероксидазы эритроцитов, содержание небелковых тиолов в печени, в моче экскрецию 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина (8-oxo-G), содержание основных и транзиторных компонентов кишечного микробиоценоза
Для цитирования: Шипелин В.А., Шумакова А.А., Трушина Э.Н., Мустафина ОК., Селифанов А.В., Сото Х.С., Маркова Ю.М., Пичугина ТВ., Полянина А.С., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Оценка in vivo подострой пероральной токсичности многостенных углеродных нанотрубок // Вопр. питания. 2017. Т. 86. № 4. С. 61-69.
Статья поступила в редакцию 10.03.2017. Принята в печать 30.06.2017.
For citation: Shipelin V.A., Shumakova A.A., Trushina E.N., Mustafina O.K., Selifanov A.V., Soto Kh.S., Markova Yu.M., Pichugina T.V., Polyanina A.S., Gmoshinsky I.V., Khotimchenko S.A. Subacute oral toxicity in vivo of multi-walled carbon nanotubes. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2017; 86 (4): 61-9. (in Russian) Received 10.03.2017. Accepted for publication 30.06.2017.
в содержимом слепой кишки. Апоптоз гепатоцитов изучали методом проточной цитофлуориметрии. В результате приема многостенных УНТ выявлены повышение уровней глюкозы и креатинина у крыс 2-й группы, достоверное снижение числа нейтрофилов и моноцитов за счет повышения количества лимфоцитов, снижение объема тромбоцитов, также наиболее выраженные у животных 2-й группы, получавших наименьшую дозу многостенных УНТ. Признаков усиления окислительного повреждения ДНК не выявлено. При наименьшей дозе многостенных УНТ в кишечном содержимом отмечено достоверное снижение количества бифидобактерий, повышение цитратассимилирующих энтеробак-терий. При дозе 0,1 мг на 1 кг массы тела достоверно возрастало количество гемолитических аэробных микроорганизмов и дрожжей. Указанные изменения в микробиоте следует рассматривать как неблагоприятные, способные привести к нарушениям в иммунной функции.
Ключевые слова: многостенные углеродные нанотрубки, крысы, пероральная токсичность, кишечный микробиоценоз
Multiwall carbon nanotubes (MWCNTs) are regarded as environmental pollutants with increased risk. Recently MWCNTs have attracted attention as a promising component of packaging materials for food products, as carriers for agricultural plant growth stimulants, agrochemicals components and advanced pesticides, which creates the possibility of their exposure through the gastrointestinal tract. Objective of the research is assessment of sub-acute oral toxicity to rats of MWCNTs in an experiment lasting 100 days. MWCNTs preparation «Taunit-Mwas preliminary characterized by electron microscopy and Raman light scattering. Nanomaterial was administered to animals as sonicated dispersion in water with 1% by weight of nonionic surfactant Tween 20. The experiment was performed on 80 growing male Wistar rats with initial body weight (b.w.) 86±2 g. Rats of experimental groups (from 2nd to 5th) received MWCNTs dispersion instead of drinking water, the animals of the 1st control group - a carrier solution (Tween 20). Doses of MWCNTs consumed were, respectively, in groups 1-5: 0; 0.01; 0.1; 1.0 and 10 mg/kg b.w. Hematological and biochemical indices of blood were determined together with the activity of glutathione peroxidase of erythrocytes, the content of non-protein thiols in the liver, excretion of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-oxo-G) and content of the main and transient components of gastrointestinal microbiocenosis in the cecum contents. Apoptosis of hepatocytes was studied by flow cytometry. As a result MWCNTs led to increase of blood glucose and creatinine in rats in group 2, a significant decrease in the number of neutrophils and monocytes by increasing the number of lymphocytes, decreased platelet volume, the most pronounced also in group 2, receiving the lowest dose of MWCNTs. There were no signs of oxidative DNA damage identified. At the lowest dose MWCNTs caused a significant decrease in the number of bifidobacteria, increase -citrate-assimilating Enterobacteriaceae, hemolytic aerobic microorganisms and yeast. These changes in the microbiota should be considered as adverse, apparently leading to disturbances in the immune function.
Keywords: MWCNTs, rats, oral toxicity, intestinal microbiocenosis
Углеродные нанотрубки (УНТ) рассматриваются в настоящее время как загрязнители окружающей среды, обладающие повышенной опасностью. Большинство сценариев экспозиции человека УНТ принимают во внимание их ингаляционный путь поступления в условиях производства как самого наноматериала, так и содержащих его композитов, а также использования в быту содержащей УНТ продукции [1]. В последнее время УНТ привлекают к себе внимание как компоненты инновационных упаковочных материалов для пищевой продукции [2], а также в качестве носителей для стимуляторов роста сельскохозяйственных растений [3], компонентов агрохимикатов [4, 5] и перспективных пестицидов [6]. Повышенная вероятность поступления УНТ в организм человека через желудочно-кишечный тракт, в том числе в малых и сверхмалых дозах, обусловли-
вает определенные риски, связанные с токсичностью УНТ для человека и млекопитающих. Токсикологические эффекты при пероральном введении УНТ изучены недостаточно, а имеющиеся данные о действующих дозах противоречивы. Это может быть связано как с методическими трудностями при введении данного нерастворимого в воде наноматериала экспериментальным животным, так и с проблемами при определении его действующих доз в условиях сильной агрегации в биологическом окружении.
В нашем предыдущем исследовании был разработан и апробирован метод получения стабильных дисперсий многостенных УНТ для проведения длительных под-острых и (в перспективе) хронических исследований токсичности путем введения лабораторным животным с питьевой жидкостью в растворе неионогенного поверх-
ностно-активного вещества (ПАВ) Tween 20 (пищевая добавка Е433) [7]. Цель настоящей работы - токсиколого-гигиеническая оценка перорально вводимых многостенных УНТ в подостром эксперименте на крысах длительностью 100 сут с использованием комплекса показателей, включающих гематологию, апоптоз клеток печени, биохимические маркеры токсического действия, окислительного повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и состояния микробиоты толстой кишки.
Материал и методы
Исследуемый наноматериал
В качестве объекта исследования использовали аттестованный стандартизованный препарат многостенных УНТ, выпускаемый в промышленных масштабах, «Таунит-М®» (ООО «Нанотехцентр», Тамбов, РФ). По данным изготовителя, многостенные УНТ имели наружный диаметр 15-40 нм, диаметр внутренней полости - 3-8 нм, среднюю длину - более 2 мкм, содержание примесей, включая аморфный углерод, -менее 1,5%. Для приготовления стоковой дисперсии многостенные УНТ диспергировали в питьевой высо-коочищенной воде из установки «Milli-RO» («Waters», США) в присутствии 1% (по массе) неионогенного ПАВ Tween 20 («Panreac», Испания) с обработкой ультразвуком. Максимальная концентрация многостенных УНТ в стоковом растворе составляла 0,1 мг/см3. Методика диспергирования представлена в [7].
По данным динамического рассеяния света, комбинационного лазерного светорассеяния и трансмиссионной электронной микроскопии. препарат в полученной водной дисперсии был изначально представлен свободными многостенными УНТ диаметром около 20 нм, длиной более 1000 нм и их некрупными агрегатами [7].
Дизайн эксперимента на животных
Эксперимент проведен на 80 крысах-самцах линии Вистар исходной массой тела 86±2 г (M±m), полученных из питомника филиала «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России. Работу на животных выполняли в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики [8, 9]. На протяжении эксперимента животные получали сухой сбалансированный корм (ООО «Лабораторкорм», РФ) и воду в режиме неограниченного доступа. Крыс размещали по 2 особи в клетках из поликарбоната при 12/12-часовом режиме освещенности и температуре 21±1 °С. В начале эксперимента все животные были разделены методом случайной выборки на 5 групп по 16 крыс; средняя масса тела животных в группах не различалась (р>0,1 ANOVA). Дисперсии многостенных УНТ животным вводили с водой. Для получения в ней необходимой концентрации многостенных УНТ исходный стоковый раствор разбавляли 1% раствором используемого ПАВ. Дозы многостенных УНТ рассчитывали индивидуально для животных каждой клетки, исходя из фактичес-
кого объема ежедневного потребления жидкости, массовой концентрации многостенных УНТ в суспензии и суммарной массы тела крыс в клетке на день расчета. Фактические дозы потребляемых многостенных УНТ, которые определяли исходя из концентрации в дисперсии и объемов выпитой животными жидкости, незначительно отличались от расчетных и составляли для 1-5-й групп соответственно 0 (контроль); 0,01; 0,1; 1,0 и 10 мг на 1 кг массы тела.
Общая длительность эксперимента составила 100 сут. В ходе наблюдения крыс 2 раза в неделю взвешивали и ежедневно оценивали общее состояние животных. На 94-95-е сутки проводили сбор суточной мочи в индивидуальных обменных клетках. Выведение животных из эксперимента осуществляли на 101-е сутки после 16-часового голодания. Часть животных (по 10 из группы) выводили из эксперимента путем обескровливания из нижней полой вены под глубокой эфирной анестезией. На секции отбирали кровь для определения гематологических показателей и часть печени для изучения показателей апоптоза. Содержимое слепой кишки отбирали в асептических условиях в стерильные контейнеры для микробиологического исследования. Для изучения биохимических показателей у остальных животных из каждой группы (по 6 крыс) отбирали кровь на сыворотку после декапитации под легкой эфирной анестезией.
Аналитические методы
Гематологические показатели определяли стандартными методами на гематологическом анализаторе «Coulter AC TTM 5 diff OV» («Beckman Coulter», США) с набором реагентов («Beckman Coulter», Франция). Апоптоз клеток печени изучали на проточном цитофлуориметре «FC 500» («Beckman Coulter International S.A.», Австрия) с использованием технологии окрашивания гепатоцитов в суспензии флуоресцентными реагентами FITC-аннек-сином V и 7-аминоактиномицином (7-AAD) [10].
Биохимические показатели сыворотки определяли на биохимическом анализаторе («Konelab 20i», Финляндия); активность глутатионпероксидазы - спектрофотомет-рическим методом, согласно [11], с незначительными модификациями; содержание небелковых тиолов в печени - спектрофотометрическим методом с реактивом Эллмана. Степень окислительного повреждения ДНК оценивали по экскреции с мочой 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина (8-oxo-G) [12], который определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [колонка Supersphere 100 RP18 (125x2 мм, 4 мкм) с предколонкой Supersphere 100 RP18 (10x2 мм), «Merck», Германия]. В качестве детектора использовали трехуровневый квадрупольный масс-спектрометр API 3000 («PE Biosystems», Германия). В анализируемых фракциях элюата отслеживали ион с M/Z=168 м/з, образуемый распадом иона-предшественника c M/Z=284. Время удерживания пика 8-oxo-G составило 7,2 мин.
Для оценки состояния микробиоты слепой кишки делали ряд десятикратных разведений проб кишечного содержимого в фосфатно-тиогликолевом буфере и ко-
личественно засевали на дифференциально-диагностические и селективные среды. Общее содержание аэробных микроорганизмов и содержание гемолитических микроорганизмов определяли на Колумбийском агаре с содержанием крови 5%; общее содержание анаэробных микроорганизмов - на Колумбийском агаре с содержанием крови 8%; содержание бифидобактерий -на среде ГМК; лактобацилл - на MRS-агаре; бактерий семейства Enterobacteriaceae - на среде Эндо и цитратном агаре, бактерий рода Staphylococcus - на агаре Байрд-Паркера; Enterococcus spp. - азидном агаре с канамицином и эскулином; Bacteroides spp. - на желчно-эскулиновом агаре для бактероидов; дрожжей и плесневых грибов - на агаре Сабуро. Инкубирование анаэробных микроорганизмов, бифидобактерий и лактобацилл осуществляли в анаэробных условиях с использованием газогенерирующих пакетов для химического связывания кислорода «AnaeroGen™» (Oxoid). Содержание микроорганизмов выражали в lg КОЕ/г сырой массы фекалий. Оценку антагонистической (кислотообразующей) активности популяций бифидобактерий проводили путем определения рН культуральной жидкости (тиогликолевой среды) на 5-е сутки инкубации с помощью рН-метра. Критериями служили пределы рН: менее 4,5 - антагонистически активные бифидобактерии; 4,6-5,1 - слабый антагонизм, более 5,1 - отсутствие антагонистической активности. Применявшиеся методики соответствовали [13].
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета SPSS 18.0. Расчет включал определение выборочного среднего (М), стандартной ошибки (m), вероятности принятия нуль-гипотезы о совпадении распределений сравниваемых выборок согласно критерию Стьюдента, Манна-Уитни, ANOVA и Краскела-Уоллиса. Различия признавали достоверными при уровне значимости р<0,05.
Результаты
При определении показателей апоптоза печени у животных 1-й, контрольной, группы выявлено, что количество живых клеток составляло 93,5±0,4%, клеток в «раннем» апоптозе (АпУ^1ТС+ 7-AAD-) - 5,37±0,48%, в «позднем» апоптозе (АпУ^1ТС+ 7-AAD+) - 0,65±0,16% и мертвых клеток (АпУ^ТС- 7-AAD+) - 0,52±0,25%, что соответствует данным для контрольных здоровых животных и свидетельствует об отсутствии токсического действия применявшегося ПАВ на печень. У крыс всех 4 опытных групп указанные показатели достоверно не отличались от контрольных значений. Величина пула восстановленных тиоловых соединений (глутатиона) в печени животных 1-й группы составила 44,8± 4,1 мкмоль, что практически не отличалось от данного показателя в группах с 3-й по 5-ю. Во 2-й группе (при наименьшей дозе многостенных УНТ) содержание тиолов было незначительно и статистически недостоверно ^>0,05) повышено (54,4±7,1 мкмоль) по сравнению с контрольным значением. Эти результаты, в сочетании с данными определения активности аминотрансфераз (табл. 1), показывают, что многостенные УНТ в данном интервале доз не оказывают видимого токсического действия на печень.
Представленные в табл. 1 биохимические показатели сыворотки крови животных контрольной, 1-й группы находятся в пределах нормы для самцов крыс данного возраста [14], за исключением сниженного уровня глюкозы, естественным образом связанного с 16-часовым голоданием животных перед выведением из эксперимента. Как следует из данных табл. 1, отличие показателей животных групп со 2-й по 5-ю от контроля статистически недостоверно, за исключением значимо повышенного уровня глюкозы у крыс 2-й группы, получавших на-
Таблица 1. Биохимические показатели крови крыс 1-5-й групп на 101-е сутки эксперимента (М±т)
Показатель Группа животных n=6) ANOVA, p, для 1-5-й групп
1 2 3 4 5
Доза многостенных УНТ, мг на 1 кг массы тела 0 0,01 0,1 1,0 10
Сыворотка крови
Глюкоза, ммоль/дм3 3,72±0,12 4,41 ±0,18* 3,83±0,26 3,88±0,20 3,90±0,20 >0,1
АЛТ, ед/дм3 73,4±6,9 59,2±5,1 77,8±5,6 62,8±3,9 68,4±7,1 >0,1
АСТ, ед/дм3 224±25 174±16 235±11 226±13 230±15 0,071
Щелочная фосфатаза, ед/дм3 118±12 142±10 140±11 150±10 120±8 >0,1
Белок, г/дм3 61,6±1,6 63,7±1,1 60,6±0,9 59,6±2,0 62,1 ±1,3 >0,1
Альбумин, г/дм3 29,6±0,7 29,4±0,5 30,1 ±0,4 29,8±0,5 30,0±0,6 >0,1
Креатинин, мкмоль/дм3 47,6±1,2 51,8±1,4* 47,7±1,0 47,1 ±1,6 44,6±1,0 0,015
Мочевая кислота, мкмоль/дм3 67,9±7,8 73,0±5,3 68,0±5,1 62,9±3,7 69,5±5,7 >0,1
Мочевина, ммоль/дм3 5,18±0,41 5,49±0,48 5,47±0,13 4,84±0,21 5,26±0,37 >0,1
Триглицериды, мкмоль/дм3 0,98±0,20 0,68±0,09 0,65±0,06 0,89±0,09 0,80±0,06 >0,1
Холестерин, мкмоль/дм3 1,76±0,12 1,72±0,03 1,58±0,06 1,69±0,10 1,76±0,14 >0,1
Эритроциты
Глутатионпероксидаза, моль/мин/мг белка 0,78±0,04 0,88±0,03 0,76±0,03 0,84±0,03 0,80±0,03 >0,1
П р и м е ч а н и е. * - статистически значимое (р<0,05) отличие от показателя 1-й группы, согласно Ь-критерию Стьюдента и/или критерию Манна-Уитни.
Таблица 2. Гематологические показатели (лейкоциты, тромбоциты) крыс 1-5-й групп на 101-е сутки эксперимента (М±т)
Группа Доза многостенных УНТ, мг на 1 кг массы тела п Лейкоциты, х109 дм-3 Нейтро- филы, % Эозино- филы, % Базо- филы, % Лимфоциты, % Моноциты, % Тромбоциты, х109 дм-3 Средний объем тромбоцита, мкм3 Тромбо- крит, %
1-я 0 8 14,0±1,4 32,6±3,6 1,80±0,35 0,19±0,05 54,8±3,3 10,6±1,2 620±25 6,38±0,14 0,39±0,02
2-я 0,01 9 17,8±1,5 30,0±2,7 1,84±0,15 0,22±0,05 63,7±3,1 4,6±0,5* 700±40 5,99±0,05* 0,42±0,02
3-я 0,1 9 16,9±1,3 22,6±1,3* 2,00±0,22 0,19±0,03 67,6±0,9* 7,3±0,7* 671 ±23 6,04±0,14 0,40±0,02
4-я 1,0 8 17,5±1,5 24,4±1,3* 2,24±0,32 0,19±0,04 65,5±1,5* 7,7±0,5* 649±36 6,01 ±0,15* 0,39±0,02
5-я 10 8 17,8±1,1 23,4±3,2 1,66±0,18 0,16±0,02 65,6±3,6* 9,1 ±0,9 614±32 6,15±0,15 0,38±0,02
А1\ША, р, для 1-5-й групп >0,1 0,033 >0,1 >0,1 0,018 <0,001 >0,1 >0,1 >0,1
* - статистически значимое (р<0,05) отличие от показателя 1-й группы, согласно Ь-критерию Стьюдента и/или критерию Манна-Уитни.
Таблица 3. Биохимические показатели мочи крыс 1-5-й групп на 95-е сутки эксперимента
Группа Доза многостенных УНТ, мг на 1 кг массы тела п Показатель (М±т)
концентрация креатинина, мкмоль/дм3 экскреция 8-oxod-G
нг/дм3 нг/мг креатинина
1-я 0 8 10,8±3,2 423±273 0,75±0,27
2-я 0,01 7 8,2±1,8 376±183 0,40±0,10
3-я 0,1 7 6,0±1,4 244±101 0,39±0,08
4-я 1,0 8 8,1 ±2,1 199±104 0,28±0,05
5-я 10 7 6,2±1,4 185±73 0,27±0,04*
А1\ША, р, для 1-5-й групп >0,1 >0,1 0,017
П р и м е ч а н и е. * - статистически значимое (р<0,05) отличие от показателя 1-й группы, согласно Ь-критерию Стьюдента.
именьшую дозу многостенных УНТ (0,01 мг на 1 кг массы тела). В этой же группе выявлено достоверное, хотя и не выходящее за пределы нормы для животных данного пола и возраста (50-80 мкмоль/л), повышение содержания креатинина, что ранее также отмечалось авторами [15] в условиях 6-месячного перорального введения крысам многостенных УНТ в очень низких дозах (менее 0,1 мг на 1 кг массы тела).
Определение состояния системы эритроцитов и уровня гемоглобина крови у крыс опытных групп показало отсутствие каких-либо значимых отличий от контрольных значений (данные не приведены). Однако при оценке лейкоцитарной формулы крови и тромбоцитов был выявлен ряд сдвигов, обусловленных приемом многостенных УНТ (табл. 2). Так, у крыс 3-й и 4-й групп в крови отмечалось достоверное снижение числа нейтрофилов и моноцитов за счет повышения количества лимфоцитов. Наименьшее количество моноцитов (снижение более чем в 2 раза) обнаружено у животных 2-й группы, получавших наименьшую дозу многостенных УНТ. Зависимость количества лимфоцитов от дозы многостенных УНТ в интервале от 0,1 до 1 мг на 1 кг массы тела отсутствовала. Средний объем тромбоцита был достоверно снижен по сравнению с контролем у крыс 2-й и 4-й групп, причем в наибольшей степени при самой низкой дозе наноматериала.
Определение величины экскреции 8-охо^, являющегося маркером окислительной деструкции ДНК, пока-
зало (табл. 3), что этот показатель монотонно снижается с увеличением дозы многостенных УНТ и составляет в 5-й группе (при дозе 10 мг на 1 кг массы тела) только 36% от контрольного уровня. Таким образом, свидетельств усиления окислительного повреждения генетического аппарата клетки под действием многостенных УНТ получено не было.
Данные табл. 4 свидетельствуют о влиянии многостенных УНТ на ряд представителей микробиоты толстой кишки. Так, при наименьшей дозе наноматериала (0,01 мг/кг) отмечено достоверное снижение (более чем в 15 раз) количества бифидобактерий, повышение в 3,9 раза количества цитратассимилирующих энтеро-бактерий на фоне снижения содержания общих энте-робактерий. При следующей по величине дозе 0,1 мг на 1 кг массы тела достоверно возрастало (в 1,7 раза) количество гемолитических аэробных микроорганизмов и более чем в 250 раз - количество дрожжей. Указанные изменения в микробиоте следует рассматривать как неблагоприятные, свидетельствующие о возможном развитии дисбиотических изменений. Они, в свою очередь, могут привести к сдвигам в иммунной функции, что находит отражение в выявленных изменениях лейкоцитарной формулы, однако для подтверждения этого предположения необходимо исследование с применением более специфических иммунологических методов. Характерно, что нежелательные сдвиги в микробиоте отмечались только при низких дозах многостенных УНТ,
тогда как при наибольших (1 и 10 мг на 1 кг массы тела) подобного не наблюдалось, и, напротив, при наибольшей дозе 10 мг на 1 кг массы тела отмечено достоверное торможение (порядка 10 раз по медиане) развития нежелательной плесневой микрофлоры.
Обсуждение
Имеющиеся в доступной литературе данные о пер-оральной токсичности различных многостенных УНТ частично противоречивы, получены на различных экспериментальных моделях и в разных (часто неперекрывающихся) интервалах доз.
Так, в эксперименте на беременных крысах с 6-19 днями гестации [16] пероральная эмбриотоксич-ность многостенных УНТ диаметром 10-15 нм и длиной 20 мкм не выявлялась при дозах вплоть до 1000 мг на 1 кг массы тела. Оцененная величина максимальной недействующей дозы (ЫОАЕЦ по изменениям в массе внутренних органов самок составила 200 мг на 1 кг массы тела в сутки. В отличие от этого, согласно [17], гидроксилированные УНТ уже при однократном пер-оральном введении беременным мышам в дозе 10 мг на 1 кг массы тела вызывали резорбцию плодов и их скелетные аномалии. Характерно, что при более высокой дозе (100 мг на 1 кг массы тела) эти эффекты не проявлялись, что авторы связывают с усилением агрегации УНТ. Одностенные УНТ диаметром 0,9-1,7 нм и длиной менее 1 мкм, вводимые однократно в желудок крыс в дозах 0,064 или 0,64 мг на 1 кг массы тела,
вызывали увеличение продукции 8-охо^ в печени [18]. В отличие от этого, многостенные УНТ в дозах до 50 мг на 1 кг массы тела при однократном пероральном введении не приводили к повышению уровня аддуктов ДНК в моче крыс [19]. При пероральном введении мышам в остром опыте одностенных УНТ длиной более 1 мкм в очень высокой дозе (1000 мг на 1 кг массы тела) никаких признаков токсичности не выявлено. Можно предположить, что при таких высоких дозах УНТ, как и в случае нашего исследования, начинают преобладать процессы образования в кишечнике крупных неабсор-бируемых волокноподобных агрегатов наноматериала, выводимых с калом [20].
Наиболее близки по методологии к настоящей работе исследования, в которых многостенные УНТ вводили животным с питьевой жидкостью. Потребление мышами водной дисперсии многостенных УНТ «Таунит-М®» в дозах 0,3; 3 и 30 мг на 1 кг массы тела на протяжении 30 сут не вызывало каких-либо изменений в скорости роста животных и морфологии внутренних органов [21]. Однако при дозе 30 мг/кг (большей, чем максимальная доза в нашей работе) были выявлены воспалительные инфильтраты в печени. По данным недавнего исследования [22], многостенные УНТ «Таунит-М®», вводимые мышам перорально в дозе 30 мг на 1 кг массы тела в течение 30 сут, вызывали очаги локального некроза в слизистой оболочке тонкой кишки с частичным лизисом энтероцитов и разрушением их апикальных мембран. В цитоплазме отдельных энтероцитов были выявлены электронноплотные структуры, напоминающие короткие обломки многостенных УНТ, однако их пол-
Таблица 4. Микробиологические показатели содержимого слепой кишки крыс 1-5-й групп на 101-е сутки эксперимента
Показатель Группа (п=6) р** для 1-5-й групп
1-я 2-я 3-я 4-я 5-я
Доза многостенных УНТ, мг на 1 кг массы тела 0 0,01 0,1 1,0 10
Содержание, ^ КОЕ/г, M±m
Анаэробы 9,00±0,12 8,74±0,37 9,04±0,16 8,85±0,15 8,67±0,11 >0,1
Аэробы 8,39±0,31 8,06±0,17 8,33±0,12 8,14±0,29 8,06±0,16 >0,1
Бифидобактерии 8,17±0,31 6,83±0,31* 7,67±0,33 7,33±0,49 7,67±0,21 >0,1
Лактобациллы 8,39±0,29 8,11 ±0,28 8,55±0,14 8,27±0,29 8,12±0,17 >0,1
Бактероиды 6,50±0,13 6,85±0,15 7,01 ±0,24 6,73±0,38 6,57±0,17 >0,1
Энтеробактерии 7,07±0,24 6,55±0,26 6,73±0,26 6,22±0,44 6,37±0,31 >0,1
Энтерококки 6,77±0,34 6,46±0,13 7,58±0,50 6,76±0,42 6,87±0,12 >0,1
Цитратассимилирующие энтеробактерии 6,21 ±0,16 6,80±0,14* 6,50±0,17 6,00±0,43 5,80±0,33 0,021
Стафилококки 5,94±0,50 6,07±0,28 6,78±0,61 6,18±0,67 6,37±0,46 >0,1
Аэробы гемолитические 7,49±0,33 7,25±0,25 7,72±0,23* 7,31 ±0,30 7,39±0,34 >0,1
Анаэробы гемолитические 6,79±0,07 7,20±0,55 7,53±0,31 7,00±0,36 6,73±0,12 >0,1
Дрожжи 3,70±0,74 4,70±0,53 6,13±0,34* 5,22±0,42 4,93±0,50 0,046
Содержание, ^ КОЕ/г, медиана (интервал изменения)
Плесени 3,04 (2,30-3,78) 2,3 (2,30-3,30) 2,6 (2,30-3,00) 2,3 (2,30-4,18) 2,3 (2,30-2,30)* >0,1
рН среды инкубации, M±m
Антагонистическая активность бифидобактерий 4,34±0,23 4,43±0,30 4,22±0,25 4,78±0,26 4,46±0,15 >0,1
П р и м е ч а н и е. * - статистически значимое (р<0,05) отличие от показателя 1-й группы, согласно Ь-критерию Стьюдента и/или критерию Манна-Уитни; ** - критерий АЫОУА и/или Краскела-Уоллиса.
ная идентификация была невозможна. По данным [15], многостенные УНТ, вводимые с питьевой водой в течение 6 мес в очень низких дозах (менее 0,1 мг на 1 кг массы тела), вызывали ряд сдвигов в биохимических показателях крыс, включая повышение уровня креатинина, активности щелочной фосфатазы и аланин-аминотрансферазы, снижение уровня липопротеинов высокой плотности, наличие признаков окислительного стресса в эритроцитах. Количественно сопоставление этих данных с результатами нашего эксперимента, однако, затруднено, ввиду того что в этой работе изначально использовали животных с массой тела 300 г, имеющих оценочно исходный возраст более 2,5 мес, а в конце эксперимента - более 8 мес.
Таким образом, проведенный эксперимент показал, что вводимые крысам в течение 100 дней с водой многостенные УНТ «Таунит-М®» способны вызывать ряд неблагоприятных эффектов, включая изменения в уровнях гликемии и креатинина, в лейкоцитарной формуле, состоянии кишечной микробиоты. В основном все указанные изменения наблюдались при низких дозах наноматериала (от 0,01 до 0,1 мг на 1 кг массы тела), а при наибольшей дозе отсутствовали, что согласуется с данными литературы. Так, имеются данные об изменении стабильности микробиоты под воздействием наночастиц в низких дозах, соответствующих их остаточным концентрациям в окружающей среде (0,01 мкг/дм3 ZnO, 0,01 мкг/дм3 CeO2 и 3 мг/дм3 TiO2) в эксперименте in vitro с использованием модели изолированного кишечника [23]. Введение этих наночастиц приводило к нелетальным, но значительным изменениям фенотипических свойств микробного сообщества, которые могут быть соотнесены с общими последствиями для здоровья.
Системные биологические эффекты УНТ могут быть связаны как с их действием на микрофлору толстой
Сведения об авторах
кишки, так и с проникновением через стенку кишки во внутреннюю среду организма, - принципиальная возможность этого была показана в модельных системах in vitro [24] и in vivo [22]. Примечательно, что кишечное всасывание многостенных УНТ считается наиболее вероятным именно при их наименьших дозах в условиях минимальной агрегации [25]. Однако следует иметь в виду, что системное действие многостенных УНТ, развивающееся по механизму незавершенного фагоцитоза, обязательно сопровождается признаками окислительного стресса, что противоречит данным нашего исследования (пул тиолов печени, экскреция 8-oxo-G).
Особый интерес представляет выявленный в настоящей работе эффект более чем 2,5-кратного снижения экскреции 8-oxo-G у крыс, получавших «Таунит-М®» в наибольшей дозе 10 мг на 1 кг массы тела. Подобное действие в отношении генетического аппарата клетки нельзя объяснить действием многостенных УНТ самих по себе, а следует, предположительно, связать с адсорбирующим действием избытка многостенных УНТ в отношении неустановленных генотоксических конта-минантов, которые в неопределяемых аналитическими методами количествах могут присутствовать в объектах окружающей среды (корма, питьевая вода, опилки). В пользу этого предположения свидетельствуют данные о способности различных УНТ связывать гидрофобные токсиканты, такие как фенантрен [26, 27].
Таким образом, исследованный образец многостенных УНТ при поступлении в организм с водой в условиях 100-дневного эксперимента оказывает неоднозначное воздействие на комплекс биохимических, гематологических и микробиологических показателей, что следует учитывать при установлении пороговой токсической дозы этого наноматериала с привлечением более широкого круга информативных биомаркеров.
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва):
Шипелин Владимир Александрович - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: v.shipelin@yandex.ru
Шумакова Антонина Александровна - научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: antonina_sh@list.ru
Трушина Элеонора Николаевна - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории спортивного питания с группой алиментарной патологии E-mail: trushina@ion.ru
Мустафина Оксана Константиновна - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории спортивного питания с группой алиментарной патологии E-mail: mustafina@ion.ru
Селифанов Александр Васильевич - младший научный сотрудник лаборатории химии пищевых продуктов E-mail: avselifanov@mail.ru
Сото Селада Хорхе - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболомного и про-теомного анализа E-mail: jsotoc@mail.ru
Маркова Юлия Михайловна - научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома E-mail: yulia.markova.ion@gmail.com
Пичугина Татьяна Викторовна - кандидат технических наук, научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома E-mail: bbtvp@ion.ru
Полянина Анна Сергеевна - лаборант-исследователь лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома E-mail: polyanina.anna.sergeevna@gmail.com
Гмошинский Иван Всеволодович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: gmosh@ion.ru
Хотимченко Сергей Анатольевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: hotimchenko@ion.ru
Литература
1. Фатхутдинова Л.М., Халиуллин Т.О., Шведова А.А. Оценка риска здоровью при воздействии углеродных нанотрубок: от токсикологии к эпидемиологическим исследованиям (обзор современ- 15. ного состояния проблемы) // Рос. нанотехнологии. 2015. Т. 10,
№ 5-6. С. 144-150.
2. Kavoosi G., Dadfar S.M., Dadfar S.M., Ahmadi F. et al. Investigation of gelatin/multi-walled carbon nanotube nanocomposite films as packaging materials // Food Sci. Nutr. 2014. Vol. 2, N 1. 16. P. 65-73.
3. Смирнова Е.А., Гусев А.А., Зайцева О.Н., Лазарева Е.М. и др. Углеродные нанотрубки проникают в ткани и клетки и оказывают стимулирующее воздействие на проростки эспарцета 17. Onobrychis Arenaria (Kit.) // Acta Naturae (русскоязычная версия). 2011. Т. 3, № 1. С. 106-113.
4. Mukherjee A., Majumdar S., Servin A.D., Pagano L. et al. Carbon nanomaterials in agriculture: a critical review // Front. Plant Sci. 18. 2016. Vol. 7. P. 172.
5. Sekhon B.S. Nanotechnology in agri-food production: an overview // Nanotechnol. Sci. Appl. 2014. Vol. 7. P. 31-53.
6. Васюкова И.А., Грибановский С.Л., Гусев А.А., Убогов А.Ю. и др. 19. Оценка репродуктивной токсичности и возможных популяци-онно-экологических эффектов многостенных УНТ на мышевидных грызунах // Рос. нанотехнологии. 2015. Т. 10, № 5-6. 20. С. 109-116.
7. Гмошинский И.В., Шипелин В.А., Хотимченко С.А. Токсико-лого-гигиеническая оценка в эксперименте многостенных углеродных нанотрубок // Сб. тезисов VIII Ежегодной конференции нанотехнологического общества России. М., 2017. С. 160- 21. 162.
8. Приказ Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики».
9. Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed. Commit- 22. tee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division
on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. Washington : The National Academies Press, 23. 2011.
10. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Биодоступность наночастиц оксида железа при использовании 24. их в питании. Результаты экспериментов на крысах // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 3. С. 25-30.
11. Разыграев А.В. Метод определения глутатионпероксидазной активности с использованием пероксида водорода и 5,5'-дити- 25. обис(2-нитробензойной кислоты)// Клинико-лабораторный консилиум. 2004. № 4. С. 19-22.
12. De Martinis B.S., Bianchi M.L.P. Methodology for urinary 8-hydroxy- 26. 2'-deoxyguanosine analysis by HPLC with electrochemical detection // Pharmacol. Res. 2002. Vol. 46, N 2. P. 129-131.
13. МУ 1.2.2634-10 «Микробиологическая и молекулярно генети- 27. ческая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза».
14. Zhang Z.P., Tian Y.H., Li R., Cheng X.Q. et al. The comparison of the normal blood biochemical values of Wistar rats with different
age and sex // Asian J. Drug Metab. Pharmacokinet. 2004. Vol. 4. P. 215-218.
Хрипач Л.В., Рахманин Ю.А., Михайлова Р.И., Князева Т.Д. и др. Влияние углеродных нанотрубок и активированного угля на биохимические показатели состояния организма при хроническом введении препаратов крысам с питьевой водой // Гиг. и сан.
2014. № 5. С. 36-42.
Lim J.H., Kim S.H., Lee I.C., Moon C., Kim S.H., Shin D.H., et al. Evaluation of maternal toxicity in rats exposed to multi-wall carbon nanotubes during pregnancy // Environ. Health Toxicol. 2011. Vol. 26. Article ID e2011006.
Philbrook N.A., Walker V.K., Afrooz A.R., Saleh N.B., Winn L.M. Investigating the effects of functionalized carbon nanotubes on reproduction and development in Drosophila melanogaster and CD-1 mice // Reprod. Toxicol. 2011. Vol. 32, N 4. P. 442-448. Folkmann J.K., Risom L., Jacobsen N.R., Wallin H. et al. Oxidatively damaged DNA in rats exposed by oral gavage to C60 fullerenes and single-walled carbon nanotubes // Environ. Health Perspect. 2009. Vol. 117, N 5. P. 703-708.
Szendi K., Varga C. Lack of genotoxicity of carbon nanotubes in a pilot study // Anticancer Res. 2008. Vol. 28, N 1A. P. 349352.
Kolosnjaj-Tabi J., Hartman K.B., Boudjemaa S., Ananta J.S. et al. In vivo behavior of large doses of ultrashort and full-length single-walled carbon nanotubes after oral and intraperitoneal administration to Swiss mice // ACS Nano. 2010. Vol. 4, N 3. P. 14811492.
Васюкова И.А., Гусев А.А., Халиуллин Т.О., Фатхутдинова Л.М. и др. Многостенные углеродные нанотрубки и их влияние на показатели мужской репродуктивной системы // Нанотехноло-гии и охрана здоровья. 2014. № 6 (18). С. 10-15. Масютин А.Г., Ерохина М.В., Сычевская К.А., Гусев А.А. и др. Многостенные углеродные нанотрубки индуцируют патологические изменения в органах пищеварительной системы мышей // Бюл. экспер. биол. 2016. Т. 161, № 1. С. 143-148. Taylor A. A. et al. Metal oxide nanoparticles induce minimal pheno-typic changes in a model colon gut microbiota // Environ. Eng. Sci.
2015. Vol. 32, N 7. P. 602-612.
Coyuco J.C., Liu Y., Tan B.-J., Chiu G.N.C. Functionalized carbon nanomaterials: exploring the interactions with Caco-2 cells for potential oral drug delivery // Int. J. Nanomed. 2011. Vol. 6. P. 2253-2263.
Bergin I.L. Witzmann F.A. Nanoparticle toxicity by the gastrointestinal route: evidence and knowledge gaps // Int. J. Biomed. Nanosci. Nanotechnol. 2013. Vol. 3. P. 1.
Cui X.Y., Jia F., Chen Y.X., Gan J. Influence of single-walled carbon nanotubes on microbial availability of phenanthrene in sediment // Ecotoxicology. 2011. Vol. 20, N 6. P. 1277-1285. Ferguson P.L., Chandler G.T., Templeton R.C., Demarco A. et al. Influence of sediment-amendment with single-walled carbon nano-tubes and diesel shoot on bioac-cumulation of hydrophobic organic contaminats by bentic invertebrates // Environ. Sci. Technol. 2008. Vol. 42, N 10. P. 3879.
References
1. Fatkhutdinova L.M., Khaliullin T.O., Shvedova A.A. Assessment of health risks when exposed to carbon nanotubes, from toxicology to epidemiology research (overview of the current state of the problem). Rossiiskie nanotekhnologii [Nanotechnologies in Russia]. 2015; 10 (5-6): 144-50. (in Russian)
2. Kavoosi G., Dadfar S.M., Dadfar S.M., Ahmadi F., et al. Investigation of gelatin/multi-walled carbon nanotube nanocomposite films as packaging materials. Food Sci Nutr. 2014; 2 (1): 65-73.
3. Smirnova E.A., Gusev A.A., Zaytseva O.N., Lazareva E.M., et al. Carbon nanotubes penetrate the tissues and cells, and have a stimulating effect on the seedlings sainfoin Onobrychis Arenaria (Kit.). Acta Naturae. 2011; 3 (1): 106-13. (in Russian)
4. Mukherjee A., Majumdar S., Servin A.D., Pagano L., et al. Carbon nanomaterials in agriculture: a critical review. Front Plant Sci. 2016; 7: 172.
5. Sekhon B.S. Nanotechnology in agri-food production: an overview. Nanotechnol Sci Appl. 2014; 7: 31-53.
6. Vasyukova I.A., Gribanovskii S.L., Gusev A.A., Ubogov A.Yu., et al. Assessment of reproductive toxicity of multiwalled carbon nano-tubes and their putative effects on population ecology of mouselike rodent. Rossiiskie nanotekhnologii [Nanotechnologies in Russia]. 2015; 10 (5): 458-67. (in Russian)
7. Gmoshinsky I.V., Shipelin V.A., Khotimchenko S.A. Toxicological and hygienic assessment of multi-walled carbon nanotubes in the experiment. In: Sbornik tezisov VIII Ezhegodnoy konferentsii nanotekhnologicheskogo obshchestva Rossii [Proceedings of the VIII Annual conference of the nanotechnological society of Russia]. Moscow, 2017: 160-2. (in Russian)
8. Russian Federation Ministry of Health and Social Development Order on 23.08.2010, N 708n «On approval of the Rules of laboratory practice». (in Russian)
9. Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. Washington: The National Academies Press, 2011.
10. Raspopov R.V., Trushina E.N., Gmoshinsky I.V., Khotimchenko S.A. Bioavailability of nanoparticles of ferric oxide when used in nutrition. Experimental results in rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2011; 80 (3): 25-30. (in Russian)
11. Razygraev A.V. Method for determining the activity of glutathione with hydrogen peroxide and 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid). Kliniko-laboratorniy konsilium [Clinical Laboratory Consultation]. 2004; (4): 19-22. (in Russian)
12. De Martinis B.S., Bianchi M.L.P. Methodology for urinary 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine analysis by HPLC with electrochemical detection. Pharmacol Res. 2002; 46 (2): 129-31.
13. MU 1.2.2634-10 Microbiological and molecular genetic evaluation of nanomaterials impact on members microbiocenosis. Guidelines. 2010: 48 p. (in Russian)
14. Zhang Z.P., Tian Y.H., Li R., Cheng X.Q., et al. The comparison of the normal blood biochemical values of Wistar rats with different age and sex. Asian J Drug Metab Pharmacokinet. 2004; (4): 215-8.
15. Khripach L.V., Rakhmanin Yu.A., Mikhailova R.I., Knyazeva T.D., et al. Influence of carbon nanotubes and activated carbon on biochemical indicators of the state of the organism in chronic administration to rats of drugs in drinking water. Gigiena i sanitariya [Hygiene and Sanitation]. 2014; (5): 36-42. (in Russian)
16. Lim J.H., Kim S.H., Lee I.C., Moon C., Kim S.H., Shin D.H., et al. Evaluation of maternal toxicity in rats exposed to multi-wall carbon nanotubes during pregnancy. Environ Health Toxicol. 2011; 26: e2011006.
17. Philbrook N.A., Walker V.K., Afrooz A.R., Saleh N.B., et al. Investigating the effects of functionalized carbon nanotubes on reproduction and development in Drosophila melanogaster and CD-1 mice. Reprod Toxicol. 2011; 32 (4): 442-8.
18. Folkmann J.K., Risom L., Jacobsen N.R., Wallin H., et al. Oxidatively damaged DNA in rats exposed by oral gavage to C60 fullerenes and single-walled carbon nanotubes. Environ Health Perspect. 2009; 117 (5): 703-8.
19. Szendi K., Varga C. Lack of genotoxicity of carbon nanotubes in a pilot study. Anticancer Res. 2008; 28 (1A): 349-52.
20. Kolosnjaj-Tabi J., Hartman K.B., Boudjemaa S., Ananta J.S., et al. In vivo behavior of large doses of ultrashort and full-length singlewalled carbon nanotubes after oral and intraperitoneal administration to Swiss mice. ACS Nano. 2010; 4 (3): 1481-92.
21. Vasyukova I.A., Gusev A.A., Khaliullin T.O., Fatkhutdinova L.M., et al. Multi-walled carbon nanotubes and their effect on the male reproductive system. Nanotekhnologii i okhrana zdorov'ya [Nanotechnology and Health Protection]. 2014; (6): 10-5. (in Russian)
22. Masyutin A.G., Erokhina M.V., Sychevskaya K.A., Gusev A.A., et al. Multiwall carbon nanotubes induce pathological changes in the digestive system of mice organs. Byulleten' eksperimental'noi biologii i meditsiny [Bulletin of Experimental Biology and Medicine]. 2016; 161 (1): 143-8. (in Russian)
23. Taylor A.A., et al. Metal oxide nanoparticles induce minimal phe-notypic changes in a model colon gut microbiota. Environ Eng Sci. 2015; 32 (7): 602-12.
24. Coyuco J.C., Liu Y., Tan B.-J., Chiu G.N.C. Functionalized carbon nanomaterials: exploring the interactions with Caco-2 cells for potential oral drug delivery. Int J Nanomed. 2011; 6: 2253-63.
25. Bergin I.L. Witzmann F.A. Nanoparticle toxicity by the gastrointestinal route: evidence and knowledge gaps. Int J Biomed Nanosci Nanotechnol. 2013; 3: 1.
26. Cui X.Y., Jia F., Chen Y.X., Gan J. Influence of single-walled carbon nanotubes on microbial availability of phenanthrene in sediment. Ecotoxicology. 2011; 20 (6): 1277-85.
27. Ferguson P.L., Chandler G.T., Templeton R.C., Demarco A., et al. Influence of sediment-amendment with single-walled carbon nanotubes and diesel shoot on bioac-cumulation of hydrophobic organic contaminats by bentic invertebrates. Environ Sci Technol. 2008; 42 (10): 3879.
