CC BY
80
A.B. Воробьев, В.И. Сигаев, А.Д. Толчинский, С.Н. Успенская, Ю.В. Иванова, Е.В. Звя гина, С.П. Рыбалкин, Л.В. Михина, Н.М. Онацкий, A.A. Мазанова, Н.Р. Дядищев
Оценка токсичности многостенных углеродных нанотрубок для крыс при ингаляционном поступлении. По результатам острого и хронического экспериментов
Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов (НИЦ ТБП) — филиал ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России,
г. Серпухов Московской области
A.V. Vorobyev, V.I. Sigaev, A.D. Tolchinsky, S.N. Uspenskaya, Yu.V. Ivanova, E.V. Zvyagina, S.P. Rybalkin, L.V. Mikhina, N.M. Onatcky, A.A. Mazanova, N.R. Dyadishchev
Multi-wall carbon nanotubes inhalation toxicity In rats assessed in acute and chronic experiments
SFBES «Research Centre of Toxicology and Hygienic Regulation of Biopreparations» FMBA,
Serpukhov, Moscow region
Ключевые слова: многостенные углеродные на-нотрубки, белые крысы, ингаляционная токсичность, параметры острой токсичности, параметры хронической токсичности, иммунотокси-ческое действие, сенсибилизирующее действие.
Keywords: multi-walled carbon nanotubes, rats, inhalation toxicity, acute toxicity parameters, chronic toxicity parameters, immunotoxicity action, sensitive action.
Изучена острая токсичность многостенных углеродных нанотрубок «Таунит-М» при однократной ингаляции крыс в течение 4 часов. В эксперименте изучены концентрации аэрозоля «Таунит-М» 111, 39, 14 и 6 мг/м3. Величина CLS0 превышает максимальную исследованную концентрацию — 111 мг/м3. В качестве порога острого действия обоснована концентрация 39 мг/м3. Показаны достоверные изменения бронхоальвеолярного лаважа по концентрации макрофагов и активности щелочной фосфатазы по сравнению с контролем.
Проведена хроническая ингаляционная затравка крыс аэрозолем многостенных углеродных нано-трубок «Таунит-М». Затравки выполнялись по 4 часа в день 5 дней в неделю в течение 4 месяцев. Изучены концентрации аэрозоля 25, 5 и 1 мг/м3. Ингаляционная затравка крыс аэрозолем многостенных углеродных нанотрубок «Таунит-М» в концентрациях 1—25 мг/м3 в течение 4 месяцев вызывала развитие у животных антракозно-го фиброза (пятнистого антракоза). Фиброзные
The acute inhalation toxicity of multiwall carbon nanotubes (MWCNT) Taunit-m was studied in rats within a single inhalation procedure that lasted for 4 hours. Aerosol concentration of MUNT Taunit-m, studied in the experiment varied: 111, 39, 14, and 6 mg/m3. The value CLS0 exceeds the maximum concentration of MUNT Taunit-m-111 mg/m3 in the experiment. The concentration of 39 mg / m3 is justified as a threshold for acute action. Were observed significant changes in the broncho-alveolar fluid in the groups of experimental animals, changed in macrophages and alkaline phosphatase activity in comparison with the control groups. Within the study rats were inhaling the MUNT Taunit-m aerosol for 4 hours a way, 5 days a week for 4 months. Aerosol MUNT Taunit-m was used in concentration: 25, 5 and 1 mg/m3. In 4 months rats have developed antrakosis fibrosis (variegated antrakos). The fibroitic changes occurred only in a few animals and were expressed quite poorly. Aerosol concentration MUNT Taunit-m 25 mg/m3 was estimated as effective (12 toxicometric indicators
изменения встречались только у отдельных животных и были выражены достаточно слабо. Концентрация аэрозоля «Таунит-М» 25мг/м3 оценена как действующая (12 показателей жизнедеятельности отличаются от контроля), а в качестве порога хронического действия обоснована концентрация 5 мг/м3 (7 показателей жизнедеятельности отличаются от контроля). Изученную в эксперименте концентрацию 1 мг/м3 предложено рассматривать как недействующую, поскольку выявленные достоверные на данной концентрации аэрозоля изменения носят непостоянный характер и существенно не отличаются от контрольных значений. Для уточнения этого показателя, вероятно, потребуется проведение исследований с более низкими концентрациями аэрозоля многостен-ныхуглеродных трубок «Таунит-М». Изучено иммунотоксическое и сенсибилизирующее действие аэрозоля многостенных углеродных нанотрубок «Таунит-М» на группе крыс, выведенных из опыта через 1 месяц затравок по 5 дней в неделю по 4 часа в течение дня. Иммунотоксическое и сенсибилизирующее действие аэрозоля «Таунит-М» не установлено.
differ from the controls), the concentration of 5 mg/m3 is justified as a threshold for causing a chronic effect (7 toxicometric indicators differ from the control). The concentration of1 mg/m3 studied in the experiment was proposed to be considered as inactive, since the aerosol changes found to be reliable at this concentration are of a constant nature and differ significantly from the control values. To refine this indicator, a study with lower concentrations of the Taunit-M MWNT aerosol is likely to be required.
The immunotoxic and sensitizing effect of the Taunit-M MWNT aerosol was studied in the group of rats withdrawn from the experiment after 1 month of inhalation procedures for 5 days a week for 4 hours a day. Immunotoxic and sensitizing effect of MUNT Taunit-M is not established.
Углеродные нанотрубки (УНТ) являются одной из аллотропных модификаций углерода. Они представляют собой протяженные цилиндрические структуры диаметром от одного до нескольких десятков нанометров и длиной от одного до нескольких десятков микрон [2]. Основные сферы применения УНТ — электроника, автомобилестроение, энергетика, производство композитных материалов [8]. Наиболее крупными производителями УНТ в мире являются фирмы «Showa Denko», Япония (20%), «CNano», США (20%), «Nanocyl», Бельгия (16%), и «Bayer», Германия (10%). По оценкам специалистов, объем мирового рынка УНТ растет до 53% в год [13].
Объем потребления углеродных нано-материалов в России, по оценкам фирмы «Research Techart», составляет 380—390 кг в год с существенным приоритетом наноал-мазов (91%). Производство фуллеренов составляет 8%, а углеродного нановолокна и нанотрубок — не более 1% [4].
В настоящее время развитый коммерческий рынок УНТ в России отсутствует [3]. Проекты по их использованию в различных производствах находятся в основном на стадии научных исследований. Спрос на УНТ сегодня формируют исследователь-
ские организации, которые закупают опытные образцы в небольших (до 1 кг) количествах. По экспертным оценкам, производство УНТ в России составляет в среднем 10—11 кг в год. При этом среди общего количества синтезируемых трубок 98% приходится на многостенные углеродные нанотрубки (МУНТ). Всестороннее изучение токсических свойств этого типа нанотрубок является наиболее актуальной задачей при проведении научно-исследовательских работ по санитарно-гигиеническому нормированию при их производстве и применении.
Исследованиям токсических свойств УНТ при ингаляционном способе их поступления в органы дыхания лабораторных животных (мышей, крыс) в последнее время посвящено большое количество публикаций в научной литературе.
При этом в ряде работ используют эндо-трахеальный способ введения УНТ как наиболее просто осуществимый при отсутствии специализированной ингаляционной техники. В исследованиях C.W. Lam et al. (2004), D.B. Warheit et al. (2004), A.A. Shvedova et al. (2005), J. Muller et al. (2005) показано, что при эндотрахеальном введении суспензии УНТ лабораторным животным (мышам, крысам) в дозах от 0,1—0,5 до 10—40 мг/особь
практически во всех случаях отмечались эффекты воспалительных реакций, формирование гранулем и фиброзные изменения в легких [11; 14; 18; 21].
Очевидно, что эндотрахеальный метод введения токсикантов в виде суспензий не в полной мере отражает естественный процесс поступления вредных веществ через органы дыхания и может использоваться только на предварительной стадии исследования их токсических свойств. В связи с этим исследования, в которых введение токсикантов в органы дыхания лабораторных животных осуществляется ингаляционно, при экспонировании животных в атмосфере различных концентраций исследуемого вещества по системе «только нос» или «нос — голова», представляют наибольший интерес.
Публикации, посвященные исследованию токсических свойств МУНТ при ингаляционном способе введения, можно разделить на несколько групп с учетом времени экспонирования животных в атмосфере с различными концентрациями углеродных трубок. Так, в ряде исследований приведены результаты экспонирования лабораторных живот -ных в атмосфере различных концентраций МУНТ в течение одного или нескольких дней.
P.A. Stapleton et al. (2012) отмечают, что после однократного ингаляционного введения МУНТ крысам при концентрации 5 мг/м3 и последующего наблюдения в течение 4 дней отмечались воспалительная реакция и легочная токсичность [19]. Воздействие МУНТ приводило к значительному увеличению в бронхоальвеолярной жидкости количества полиморфноядерных лейкоцитов ( ПМ Л ), активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и концентрации общего белка.
J.P. Ryman-Rasmussen et al. (2009) выявили формирование фиброзных изменений в легких подопытных мышей через 14 дней наблюдения после однократного ингаляционного введения МУНТ в концентрации 100 мг/м3 в течение 6 часов [17].
Подобные эффекты были обнаружены в работе D.W. Porter et al. (2013) на мышах, которые экспонировались в аэрозоле МУНТ с концентрацией 10 мг/м3 в течение 2 дней и наблюдались до 14 дней после окончания ингаляционного воздействия [16]. Содержание
ПМЛ, альбумина и активность ЛДГ в бронхоальвеолярной жидкости были значительно выше контроля и зависели от концентрации аэрозоля. Гистопатологические исследования легких выявили фиброз, бронхоэпителиаль-ную гиперплазию и гипертрофию, а также показали, что МУНТ могут достигать плевры после ингаляционного воздействия.
H. Ellinger-Zigerbauer и J. Pauluhn (2009) проводили более длительные (в течение 3 месяцев) наблюдения крыс, экспонированных однократно в течение 6 часов в атмосфере с концентрацией МУНТ 11 и 241 мг/м3 [10]. Было показано, что воспалительная реакция наблюдалась при обеих концентрациях МУНТ, в то время как фиброзные изменения отмечались только при концентрации 241 мг/м3.
T. Umeda et al. (2013) проводили многократное ингаляционное введение МУНТ крысам в концентрациях 0,2, 1 и 5 мг/м3 в течение 14 дней [20]. У крыс, экспонированных при концентрациях 5 и 1 мг/м3, отмечали повышение концентрации общего белка и альбумина. Исследования показали наличие гранулематозных изменений в легких крыс, экспонированных при концентрации МУНТ 5 мг/м3. Эти изменения становились более выраженными в конце 4-недельного наблюдения после завершения ингаляций.
В литературе присутствуют лишь единичные сообщения об изучении токсичности МУНТ при многомесячном ингаляционном введении их лабораторным животным (крысам).
Так, в сообщении L. Ma-Hock et al. (2009) приведены результаты изучения ингаляционной токсичности МУНТ при введении их крысам в концентрациях 0,1, 0,5 и 2,5 мг/м3 в течение 3 месяцев [12]. Для исследования животных использовали широкий спектр сенсомоторных, рефлекторных и других патофизиологических тестов. Пробы, полученные от животных, изучали с применением биохимических, гематологических, гистологических и других методов исследования. После экспонирования крыс в аэрозоле с концентрациями МУНТ 0,5 и 2,5 мг/м3 вскрытие животных выявило наличие серого цвета легких и формирование в них муль-тифокальных гранулем. Одиночные гранулемы наблюдались также при экспонировании
животных при минимальной концентрации МУНТ — 0,1 мг/м3. Клинические исследования экспериментальные животных не выявили у них никаких признаков неблагоприятных последствий, таких как снижение массы тела, потребления корма, двигательной активности и т.п. Авторы сделали вывод об отсутствии системной токсичности МУНТ для крыс при ингаляционном введении изученных концентраций в течение 3 месяцев.
^ Раи1иЬп (2010) проводил ингаляционное введение МУНТ крысам при концентрациях 0,1, 0,4, 1,5 и 6 мг/м3 в течение 13 недель. Автор отмечает увеличение количества ПМЛ, растворимого коллагена в брон-хоальвеолярной жидкости, а также повышение уровня общего белка и активности ЛДГ при концентрациях аэрозоля МУНТ, начиная с 0,4 мг/м3 и выше [15]. Гранулематозные изменения и бронхиол оальвеолярная гиперплазия наблюдались при концентрации МУНТ 6 мг/м3.
В целом краткий анализ работ по исследованию токсических свойств МУНТ при ингаляционном введении лабораторным животным показывает широту различных мнений, неоднозначность оценки полученныгх данных даже в близких по характеру постановки экспериментах и необходимость дальнейшего систематического изучения токсических свойств нового класса наноматериалов, к которым относятся УНТ.
Материалы и методы
Многостенные углеродные нано-трубки
В проведенных ингаляционных токсикологических экспериментах были использованы МУНТ «Таунит-М» производства ООО «НаноТехЦентр» (Тамбов, Россия) [6]. «Таунит-М» представляет собой коаксиальные МУНТ с наружным диаметром 30—80 нм и длиной более 2 мкм. Одна трубка состоит из 2—6 слоев. Содержание неуглеродныгх примесей — не более 1% по массе. Насыпная плотность материала «Таунит-М» составляет 0,03—0,05 г/см3. Удельная геометрическая поверхность — 120—180 м2/г.
Экспериментальные животные
Взрослые самцы крыс линии Вистар весом 170—180 г получены из Научного центра
биомедицинских технологий (НЦБТ) РАМН, филиал «Андреевка». Крысы по 5 особей в клетках Тип-4 с подстилом содержались в специализированных помещениях в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», утвержденными Минздравом СССР 6 июля 1973 г., а также условиями, приведенными в руководстве «Guide for Care and Use of Laboratory Animals» (ILAR publication, 1996, National Academy Press, USA).
Создание и мониторинг аэрозоля МУНТ в экспозиционной камере
Экспонирование животных по системе «голова — нос» осуществляли в разработанной в НИЦ ТБП экспозиционной аэрозольной камерной установке (ЭАКУ) (патент РФ № 2552945) с использованием генератора сухих аэрозолей конструкции НИЦ ТБП. Работа генератора основана на принципах помола и «кипящего слоя». Характеристики устройств и методология работы с этим оборудованием были описаны нами ранее [7; 9].
Контроль концентрации аэрозоля МУНТ проводили прямым гравиметрическим и альтернативным фотометрическим способами, используя в качестве пробоотборников аналитические фильтры АФА-РМП-3. Объемная скорость отбора пробы составляла 2 л/мин.
Данные, полученные гравиметрическим методом, служили эталоном при калибровке альтернативного фотометрического метода определения концентрации аэрозолей МУНТ в установке ЭАКУ.
При использовании фотометрического метода фильтры АФА-РМП-3 по окончании времени отбора пробы аэрозоля помещали в стаканы с 5 мл этилацетата. Материал фильтра, перхлорвинил, полностью растворялся в этил ацетате. Далее производили оценку оптической плотности полученных суспензий МУНТ в режиме фотометрии на длине волны ^=315 нм на приборе «Флюорат 02 Панорама» производства ООО «Люмекс» (Санкт-Петербург, Россия).
Используя заранее установленную калибровочную зависимость «концентрация МУНТ в суспензии — оптическая плотность», определяли концентрацию МУНТ в жидких
пробах. Текущие значения концентрации аэрозоля МУНТ в точках пробоотбора в течение всего эксперимента определяли расчетным путем.
Для определения фракционно-диспер-сного состава (ФДС) аэрозоля исследуемого углеродного материала использовали 8-каскадный физический импактор Андерсена («ThermoAndersen Inc.», США). Объемная скорость отбора пробы составляла 28,3 л/мин, время отбора пробы — 1—2 минуты. Смыв частиц МУНТ с осадительных пластин каждой ступени проводили 5 мл этилацетата. Оптическую плотность полученных суспензий определяли фотометрическим методом. Процентное содержание частиц различных фракций в аэрозоле рассчитывали, используя данные фотометрического анализа.
Схемы экспериментов
В остром эксперименте животных экспонировали при концентрациях «Таунита-М» 111, 39, 14 и 6 мг/м3 однократно в течение 4 часов. На следующий день, а также через 14 дней восстановительного периода проводили цитологические, гематологические, биохимические и патоморфологические исследования.
В хроническом эксперименте животных экспонировали 4 часа в день 5 раз в неделю в течение 4 месяцев при концентрациях «Таунита-М» 25, 5 и 1 мг/м3 в рабочем объеме ЭАКУ. Через 1 и 4 месяца после начала экспонирования, а также через 1 месяц восстановительного периода проводили цитологические, гематологические, биохимические и патоморфологические исследования. На каждой концентрации и каждом сроке исследований были использованы по 5 животных.
Кроме того, было изучено сенсибилизирующее и иммунотоксическое действие МУНТ «Таунит-М» на животных, экспонированных в течение 1 месяца.
Контролем во всех случаях служили животные, экспонированные в атмосфере чистого воздуха.
Клинические наблюдения
Клинические наблюдения за состоянием животных, потреблением корма и воды проводили ежедневно, взвешивание — еженедельно в течение эксперимента.
Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ)
Животных усыпляли путем внутримышечного введения смеси золетил+ксила. После эвтаназии животных в атмосфере углекислого газа промывали легкие через трахею 5 мл стерильного охлажденного физиологического раствора.
Цитологическое изучение БАЛ
Клеточный состав лаважной жидко -сти определяли под световым микроскопом Axioskop 40 («Zeiss», Германия). Подсчет общего количества макрофагов проводили в камере Горяева после окрашивания реактивом Самсона. Для определения процентного содержания эозинофилов, сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов и макрофагов бронхоальвеолярную жидкость центрифугировали в течение 15 минут при 1500 об./мин, осадок окрашивали по Маю—Грюнвальду и Романовскому—Гимзе. Подсчет проводили среди 500 клеток.
Изучение биохимических параметров БАЛ
Для проведения биохимического анализа использовали надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования БАЛ на микроцентрифуге CycloTemp 202 (США) при 5500 об./мин в течение 10 минут. Биохимические показатели надосадочной жидкости — активность ферментов ЛДГ и щелочной фосфатазы (ЩФ) — определяли на полуавтоматическом биохимическом анализаторе STATFAX 4500 (США) с использованием соответствующих биохимических методик. ЩФ использовали как показатель активности эпителиальных клеток II типа, ЛДГ — как показатель степени цитотоксичности.
Гематологический анализ крови
Кровь для гематологического и биохимического анализа отбирали из бедренной вены после ночи голодания. Животных усыпляли путем внутримышечного введения смеси золетил+ксила. Гематологический анализ проводили с использованием автоматического гематологического ветеринарного анализатора ВС-2800Vet (КНР). Подсчет лейкоцитарной формулы крови животных проводили в световом микроскопе Axioskop 40 («Zeiss», ФРГ), в мазках крови, окрашенных по
Маю—Грюнвальду и Романовскому—Гимзе. Подсчет количества ретикулоцитов проводили после окраски 1% раствором бриллиантового крезилового синего.
Биохимический анализ сыворотки крови
Биохимические показатели сыворотки крови — общий белок, глюкозу, общий холестерин, мочевину, креатинин, общий билирубин, активность ЩФ и ЛДГ — определяли на полуавтоматическом биохимическом анализаторе STATFAX 4500 (США) с использованием соответствующих унифицированные методов.
Анализ мочи
Мочу анализировали на полуавтоматическом анализаторе мочи Urisys1100 (США).
Патоморфологические исследования
Некропсию всех животных проводили с подробным исследованием и описанием внешнего состояния тела, кожи, шерстного покрова, видимые слизистые оболочек, а также с исследованием грудной, брюшной и тазовой полостей с находящимися в них органами. У всех животные определяли массу следующих органов: сердца, легких, печени, почек, селезенки. Парные органы1 взвешивали вместе. Определяли коэффициенты относительной массы внутренних органов путем расчета отношения массы органа (г) к массе тела (кг), определенной перед некропсией после ночи голодания. Для гистологического анализа отбирали образцы следующих органов и тканей: легкого, сердца, печени, почек, селезенки. Фиксированные в 10% растворе формалина образцы органов и тканей обезвоживали, пропитывали парафином и заключали в парафиновые блоки. Срезы толщиной 5—6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Дополнительно окрашивали серию препаратов легких по Ван Гизону. Гистологические препараты исследовали под световым микроскопом Olympus CX41 (ФРГ). Для фотографирования препаратов использовали фотонасадку с цифровой камерой Canon Power Shot A95 (Япония).
Сенсибилизирующее действие
Через 21 день после завершения курса ингаляционного введения «Таунита-М» в течение 1 месяца животных тестировали для
выявления состояния гиперчувствительности, используя метод провокационной кожной капельной пробы. Разрешающую дозу волокнистого углеродного наноматериала в вазелиновом масле (2 мг/мл, 100 мкл на особь) наносили на депилированный участок кожи животного. На контрольный участок кожи наносили 100 мкл носителя. Реакцию на наружной поверхности кожи оценивали визуально в течение первых 30 минут, 1 часа, через 24 и 48 часов после введения разрешающей дозы в баллах.
Иммунотоксическое действие
Через 1 сутки после завершения курса ингаляционного введения «Таунита-М» в течение 1 месяца из плазмы крови крыс выделяли лимфоциты. Т-лимфоциты крысы выявляли в реакции Е-розеткообразования с эритроцитами морской свинки, В-лимфоциты — в реакции ЕАС-розеткообразования. Цитологические препараты, приготовленные после проведения реакций розеткообразования, окрашивали азур-эозином и просматривали под иммерсионной системой светового микроскопа. Рассчитывали процентное содержание розет-кообразующих лимфоцитов (Е-РОК и ЕАС-РОК) в цитологических препаратах.
Для определения уровня комплемента в сыворотке крови крыс использовали тест-систему с гемолитической сывороткой. В лунки микропланшетов с двукратными разведениями исследуемые сывороток крови добавляли 3% суспензию эритроцитов, сорбированные гемолитической сывороткой. После экспозиции микропланшетов при 37° C в течение 1 часа оценивали гемолиз эритроцитов визуально. За титр комплемента в исследуемой сыворотке принимали последнее разведение сыворотки, вызывающее полный гемолиз эритроцитов.
При оценке фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов (ПМФ) в качестве объекта фагоцитоза использовали клетки суточной культуры S. aureus, инактивиро-ванные прогреванием (30 минут при 100°C). В пробирки с монослоем ПМФ вносили суспензию S. aureus в соотношении микробная клетка : ПМФ = 50:1, пробы инкубировали при 37°C в течение 60 минут. Затем монослой ПМФ пятикратно отмывали от оставшихся в
культуральной среде бактерий, фиксировали 96° этанолом, окрашивали азур-эозином и просматривали под иммерсионной системой светового микроскопа. Рассчитывали активность фагоцитоза (АФ, процент макрофагов, поглотивших бактерии) и интенсивность фагоцитоза (ИФ, среднее количество бактерий в одном фагоците).
Результаты исследований
Острый ингаляционный эксперимент
Концентрация и ФДС аэрозоля МУНТ <<Таунит-М>> в динамических каналах ЭАКУ
Перед постановкой острого ингаляционного эксперимента была проведена серия методических экспериментов без использования животных для отработки надежных режимов создания планируемых концентраций аэрозоля «Таунит-М» в динамических каналах ЭАКУ.
При проведении острого эксперимента с животными были получены следующие концентрации аэрозоля «Таунит-М»:
• максимальная — 111±21 мг/м3;
• средняя 1 — 39±20 мг/м3;
• средняя 2 — 14±6 мг/м3;
• минимальная — 6±3 мг/м3.
Концентрации аэрозоля «Таунит-М» определялись в середине и в конце каждого часа в процессе 4-часового ингаляционного эксперимента (п=8 для каждого значения концентрации).
Фракционно-дисперсный состав аэрозоля «Таунит-М» представлен на рисунке 1.
Данные рисунка 1 показывают, что аэрозоль «Таунит-М» представлен преимущественно частицами размерами 2—6 мкм (около 80%). Среднемедианный диаметр частиц аэрозоля «Таунит-М» составил 3,0 мкм.
Рис. 1. Фракционно-дисперсный состав аэрозоля «Таунит-М» в остром эксперименте
Клинические наблюдения
По результатам клинических наблюдений в процессе проведения острого ингаляционного эксперимента гибели животных отмечено не было. Таким образом, по результатам эксперимента можно констатировать, что величина СЬ превышает максимально достигнутую концентрацию «Таунита-М» — 111 мг/м3.
На следующий после эксперимента день первая группа животных (30 крыс) была подвергнута эвтаназии для получения БАЛ легких как органа-мишени при ингаляционном поступлении наноматериала для установления показателей, наиболее пригодных для учета при выявлении токсического действия «Таунита-М».
Со второй группой животных (30 крыс) проводили клинические наблюдения в течение 14 дней. Случаев гибели в данной группе животных за период наблюдения отмечено не было. Клиническое состояние, потребление корма и воды у животных на протяжении 2-недельного периода наблюдения после однократного ингаляционного введения аэрозоля «Таунит-М» соответствовали показателям физиологической нормы.
Достоверных различий в массе тела животных, экспонированных при различных концентрациях «Таунита-М», в период наблюдения не выявлено. По окончании периода наблюдения животные второй группы также были подвергнуты эвтаназии, и от них получены образцы БАЛ для исследования по биохимическим и клеточным параметрам.
Цитологические и биохимические исследования образцов ВААА
Образцы лаважной жидкости от каждого животного были использованы для определения в них общего количества макрофагов, а также содержания полиморфноядер-ных нейтрофилов, лимфоцитов и эозино-филов. Биохимические исследования образцов БАЛ включали определение концентрации общего белка, активности ЛДГ и ЩФ. В пробах, полученных от группы животных, выведенных через день после однократного аэрозольного введения «Таунита- М», достоверно значимых различий количества альвеолярных макрофагов в бронхоальвеолярной жидкости не установлено (табл. 1).
0-0,4 0,4-0,7 0,7-1,1 1,1-2,1 2,1-3,3 3,34,7 4,7-5,8 5,8-9,0 Фракции аэрозоля, мкм
Таблица 1 Количество альвеолярных макрофагов в БАЛ на 1-й день после однократного аэрозольного введения «Таунита-М»
Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3 Количество альвеолярных макрофагов в 1 мл бронхоальвеолярной жидкости, х104
111 13,5±2,7
39 11,5±3,3
14 12,0±2,8
6 10,8±3,2
Контроль 11,3±1,8
Таблица 3 Количество альвеолярных макрофагов в БАЛ на 14-й день после однократного аэрозольного введения «Таунита-М»
Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3 Количество альвеолярных макрофагов в 1 мл бронхоальвеолярной жидкости, х104
111 23,7±7,5*
39 15,7±2,5*
14 12,8±3,1
6 8,8±3,4
Контроль 10,8±2,2
Примечание: * — различие с контролем статистически достоверно по /-критерию Стьюдента, р<0,05.
Цитологический анализ мазков, приготовленных из БАЛ на 1-й день после однократного аэрозольного введения «Таунита-М», также не выявил достоверно значимых различий между контрольными и экспериментальными животными (табл. 2).
В пробах БАЛ, полученные от животных на 14-й день после однократного аэрозольного введения «Таунита-М», выявлены достоверно значимые различия количества альвеолярных макрофагов в бронхоальвео-лярной жидкости в группах животные, экспонированных при концентрации препарата в аэрозоле 111 и 39 мг/м3, по сравнению с контрольной группой (табл. 3).
Достоверно значимое увеличение количества альвеолярных макрофагов у животных, получивших «Таунит-М» в концентрациях 111 и 39 мг/м3, может свидетельствовать об ответной реакции организма крыс на воздействие МУНТ.
Цитологический анализ мазков, приготовленных из БАЛ на 14-й день после однократного аэрозольного введения «Таунита-М», выявил достоверно значимые различия в следующих показателях между контрольными и экспериментальными животными (табл. 4):
• увеличение количества сегментоядерных нейтрофилов и макрофагов у животных, получивших «Таунит-М» в концентрациях 111 мг/м3;
• снижение доли лимфоцитов у животных, получивших «Таунит-М» в концентрациях 111, 39 и 14 мг/м3;
• увеличение количества макрофагов у животных, получивших «Таунит-М» в концентрациях 111 и 39 мг/м3.
Достоверно значимое увеличение количества сегментоядерных нейтрофилов, макрофагов и снижение количества лимфоцитов могут свидетельствовать о воспалительной реакции организма в ответ на аэрозольное поступление «Таунита-М» в легкие экспонированных животных.
По результатам биохимического исследования БАЛ крыс после курса однократного введения «Таунита-М» у животных подопытных групп установлены следующие статистически значимые изменения относительно контрольной группы: повышение активности ЩФ в группе, получавшей «Таунит-М»
Таблица 2 Соотношение различных видов лейкоцитов в мазках БАЛ, приготовленных на 1-й день после однократного аэрозольного введения «Таунита-М»
Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3 Эозино- филы, % Сегменто-ядерные нейтро-филы, % Лимфоциты, % Макрофаги, %
111 0,5±0,4 14,1±4,7 23,5±9,1 61,9±7,2
39 0,6±0,4 10,6±4,4 30,2±10,0 58,6±9,3
14 0,7±0,4 7,7±3,3 28,4±10,8 63,2±9,2
6 1,0±0,8 7,4±4,5 27,5±7,5 64,2±6,6
Контроль 0,7±0,4 9,5±2,8 24,4±8,6 65,4±6,6
Таблица 4 Соотношение различных видов лейкоцитов в мазках БАЛ на 14-й день после однократного аэрозольного введения «Таунита-М»
Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3 Эозино- филы, % Сегменто-ядерные нейтро-филы, % Лимфоциты, % Макрофаги, %
111 0,3±0,2 8,4±4,0* 21,0±2,4* 70,4±4,1*
39 0,4±0,4 7,2±5,6 19,7±4,1* 72,7±7,1*
14 1,3±1,1 6,4±6,3 21,4±6,4* 70,9±11,6
6 0,8±0,6 5,9±7,1 28,5±6,0 64,8±11,0
Контроль 0,7±0,4 2,1±0,8 34,5±5,7 62,8±5,7
Примечание: * — различие с контролем статистически достоверно по /-критерию Стьюдента, р<0,05.
в концентрации 111 мг/м3; понижение активности ЛДГ и повышение активности ЩФ в группе, получавшей «Таунит-М» в концентрации 39 мг/м3 (табл. 5).
По результатам биохимических исследований образцов БАЛ, полученных от группы животных после однократного аэрозольного введения «Таунита-М» и восстановительного периода в течение 14 дней, отмечено, что в группах, получавших препарат в концентрации 14—111 мг/м3, показатели активности ЩФ и ЛДГ не имели достоверных отличий от установленных для контрольной группы животных (табл. 6).
Хронический ингаляционный эксперимент
В хроническом ингаляционном эксперименте было проведено экспонирование экспериментальных животных в атмос-
Таблица 6
Биохимические показатели БАЛ после однократного
введения «Таунита-М» и восстановительного периода
14 дней
Показа- Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3
тель Контроль 111 39 14
ЛДГ, Е/л 34,9±2,3 35,1±6,6 33,5±5,0 38,0±3,8
ЩФ, Е/л 9,9±3,0 10,9±5,8 12,4±5,6 12,1±4,7
Примечание: * — различие с контролем статистически
достоверно по /-критерию Стьюдента, р<0,05.
фере трех различных концентраций аэрозоля МУНТ «Таунит-М». Исследуемое вещество вводили ингаляционно 4 часа 5 дней в неделю в течение 4 месяцев. Контрольные животные экспонировались в атмосфере чистого воздуха. В опыте были использованы 100 самцов белых крыс Вистар, по 25 особей в каждой группе. Группы животных обследовались через 1 месяц ингаляций, 4 месяца ингаляций и после 1 месяца восстановительного периода.
Отдельную группу животных, экспонированных в заданных концентрациях «Таунита-М» в течение 1 месяца, использовали для изучения иммунотоксического действия и сенсибилизирующего действия in vivo.
Концентрация и ФДС аэрозоля <Тау-нит-М> в динамических каналах ЭАКУ
Оценку массовой концентрации аэрозоля МУНТ «Таунит-М» в динамических каналах ЭАКУ осуществляли периодически в течение каждого месяца проведения эксперимента. Обобщенные данные о реальных концентрациях аэрозоля «Таунит-М» в эксперименте представлены в таблице 7.
Исходя из средних значений реальных концентраций «Таунита-М» в динамических каналах ЭАКУ в течение ингаляционного хронического эксперимента, в последующих таблицах результатов аналитических исследований, проведенных в течение хронического эксперимента, которые будут представлены далее, целесообразно использовать обобщенные и округленные до целых чисел значения концентраций аэрозоля «Таунит-М», а именно:
• максимальная — 25 мг/м3;
• средняя — 5 мг/м3;
• минимальная — 1 мг/м3.
Таблица 7 Концентрация МУНТ «Таунит-М» в динамических каналах ЭАКУ в течение ингаляционного хронического эксперимента
Период ингаляционного хронического эксперимента Концентрация «Таунита-М»* в динамических каналах ЭАКУ, мг/м3
Канал А (максимальная) Канал В (средняя) Канал С (минимальная)
1 месяц 24,8±2,0 5,4±0,8 0,9±0,7
2 месяца 25,2±4,6 6,2±0,8 1,1±0,2
3 месяца 24,1±2,0 5,1±2,0 0,9±0,8
4 месяца 25,2±4,8 5,0±1,4 1,2±0,6
Среднее 24,8±1,6 5,4±0,6 1,0±0,3
Примечание: * — га=12 для каждого значения концентрации; значения статистически достоверны по /-критерию Стьюдента, р<0,05.
Таблица 5
Биохимические показатели БАЛ крыс
после однократного введения «Таунита-М»
Показа- Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3
тель Контроль 111 39 14
ЛДГ, Е/л 542,4±305,9 315,0±111,8 154,2±53,3* 249,7±109,4
ЩФ, Е/л 5,2±3,4 10,0±2,4* 9,9±3,4* 6,4±2,4
Примечание: * — различие с контролем статистически
достоверно по /-критерию Стьюдента, р<0,05.
Многочисленными определениями ФДС аэрозоля МУНТ «Таунит-М» в течение хронического эксперимента было установлено, что этот показатель имел близкие значения с наблюдавшимся ранее в остром эксперименте и также характеризовался преимущественным содержанием аэрозольных частиц размером 2—6 мкм (см. рис. 1).
Результаты исследований после 1 месяца ингаляций
Клинические наблюдения. Клиническое состояние, потребление корма и воды у животныгх, получавших ингаляционно на протяжении 1 месяца исследуемый препарат, соответствовали показателям физиологической нормы. Во всех экспериментальных группах выявлены достоверно значимые различия в массе тела по сравнению с контролем.
Несмотря на отсутствие в показателях массы тела экспериментальных животных дозовой зависимости в первые недели наблюдения, в дальнейшем достоверно показано, что поступление даже минимальных концентраций аэрозоля «Таунит-М» приводило к уменьшению прироста массы тела.
Цитологические и биохимические исследования образцов БАЛ. После 1 месяца аэрозольного введения «Таунита-М» у животных, получавших исследуемый препарат в концентрации 5 и 25 мг/м3, выявлено достоверно значимое увеличение альвеолярных макрофагов в бронхоальвеолярной жидкости (табл. 8).
Подсчет клеток БАЛ в мазке через 1 месяц ингаляционного введения выявил достоверно значимое снижение доли сегментоядер-ных нейтрофилов только в группе животных, экспонированных в аэрозоле «Таунит-М» в минимальной концентрации (табл. 9).
Таблица 9 Процентное соотношение различных видов лейкоцитов в окрашенном мазке БАЛ через 1 месяц ингаляционного введения «Таунита-М»
Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3 Эозино- филы, % Сегменто-ядерные нейтро-филы, % Лимфоциты, % Макрофаги, %
25 0,4±0,2 6,9±2,7 41,1±7,1 51,6±6,3
5 0,5±0,3 6,4±1,6 50,2±11,4 42,9±10,5
1 0,5±0,3 2,8±1,3* 60,3±13,7 36,3±13,8
Контроль 0,6±0,3 5,4±1,6 48,3±13,1 45,7±13,6
Примечание : достоверно по * — различие с контролем статистически /-критерию Стьюдента, р<0,05.
Анализ данных показывает, что «Тау-нит-М» при ингаляционном введении в течение 1 месяца не вызывает значительных изменений клеточного состава БАЛ у животных по сравнению с контролем. Снижение доли сегментоядерных нейтрофилов у животных, экспонированных в аэрозоле «Таунит-М» в минимальной концентрации, носит случайный характер и не связано с введением препарата.
Биохимические показатели БАЛ после 1 месяца введения «Таунита-М» представлены в таблице 10.
Анализ данных показывает, что «Тау-нит-М» при ингаляционном введении в течение 1 месяца не вызывает значительных изменений активности ферментов в БАЛ животных по сравнению с контролем.
Гематологические и биохимические исследования образцов крови. При анализе гематологических показателей крови после 1-месячного курса введения крысам аэрозоля «Таунит-М» (табл. 11) выявлены следующие статистически значимые изменения:
• повышение количества ретикулоцитов и снижение количества тромбоцитов у животных, получавших «Таунит-М» в максимальной концентрации 25 мг/м3;
Таблица 8 Количество альвеолярных макрофагов после 1 месяца аэрозольного введения «Таунита-М»
Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3 Количество альвеолярных макрофагов в 1 мл бронхоальвеолярной жидкости, х104
25 31,3±4,3*
5 21,8±2,9*
1 16,0±0,8
Контроль 14,8±0,5
Примечание: * — различие с контролем статистически достоверно по /-критерию Стьюдента, р<0,05.
Таблица 10 Биохимические показатели БАЛ крыс после 1 месяца ингаляционного введения «Таунита-М»
Показатель Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3
Контроль 25 5 1
ЛДГ, Е/л 187,5±33,0 180,5±38,9 176,3±38,1 164,5±20,9
Щелочная фосфатаза, Е/л 13,9±7,4 14,9±10,9 17,0±4,3 18,9±6,8
Таблица 11 Гематологические показатели крови крыс после 1 месяца введения «Таунита-М»
Показатель Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3
25 5 1 Контроль
Гемоглобин, г/л 161,8±3,1 160,2±2,8 167,0±2,4 163,2±2,6
Эритроциты, млн/мм3 9,4±0,2 9,3±0,2 9,7±0,2 9,5±0,2
Гематокрит, % 47,3±1,1 47,1±0,4* 49,1±0,6 48,5±0,8
Ср. объем эритроцитов, мкм3 50,6±0,6 50,4±0,5 50,6±0,6 51,0±0,7
Ретикулоциты, % 1,6±0,5* 1,5±0,7 1,1±0,3 1,0±0,2
Тромбоциты, тыс. 1066,2±66,9* 1125,8±52,2 1240,8±55,2 1218,8±137,7
Лейкоциты, тыс./мм3, в том числе: 13,3±1,1* 13,3±1,1* 12,2±1,8 12,0±0,7
Базофилы, % 0 0,2±0,4 0 0
Эозинофилы, % 0,4±0,5 0,2±0,4 0 0,4±0,9
Юные, % 0 0 0 0
Палочкоядерные, % 1,2±0,4 1,6±0,9 1,6±1,3 1,6±0,9
Сегментоядерные, % 38,2±4,8 37,0±1,4 29,8±4,4 33,0±6,7
Лимфоциты, % 57,4±4,4 58,6±1,9 66,8±5,2 62,6±7,9
Моноциты, % 2,8±0,8 2,4±0,5 1,8±0,4 2,4±0,8
Примечание: * — различие с контролем статистически достоверно по /-критерию Стьюдента, р<0,05.
• снижение показателя гематокрита и повышение количества лейкоцитов у животных, получавших «Таунит-М» в средней концентрации 5 мг/м3.
Анализ данных гематологических исследований показывает, что аэрозоль исследуемого препарата при ингаляционном введении в течение 1 месяца в изученных концентрациях не вызывал значительных изменений гематологических показателей крови. По результатам биохимического исследования сыворотки крови крыс после 1-месячного курса введения препарата установлены следующие статистически значимые изменения относительно контрольной группы (табл. 12):
• повышение уровня общего белка и понижение концентрации холестерина в группе, получавшей аэрозоль «Таунит-М» в концентрации 25 мг/м3;
• повышение уровня общего белка и понижение концентраций холестерина и креатинина в группе, получавшей аэрозоль «Таунит-М» в концентрации 5 мг/м3;
• повышение уровня общего белка в группе, получавшей аэрозоль «Таунит-М» в концентрации 1 мг/ м3.
Сенсибилизирующее действие. На отдельной группе животных изучено сенсибилизирующее действие МУНТ «Таунит-М» при ингаляционном введении в течение 1 месяца. Ингаляцию проводили по 5 дней в неделю по 4 часа. Исследовали воздействие двух концентраций аэрозоля: 5 и 25 мг/м3. Контролем были животные, не подвергавшиеся ингаляционному воздействию наномате-риала и экспонированные в атмосфере чистого воздуха.
В результате проведенного исследования не выявлено ни одного животного с состоянием гиперчувствительности к исследуемому веществу: после нанесения разрешающей дозы не отмечено изменений в состоянии наружной поверхности кожи в течение всего периода наблюдений (0 баллов, видимой реакции нет). После нанесения разрешающей дозы не было отмечено признаков беспокойства, изменений в поведении животных из групп опыта и контроля.
Установлено, что МУНТ «Таунит-М» при ингаляционном воздействии на животных в течение 1 месяца в концентрациях до 25 мг/м3 сенсибилизирующим действием не обладают.
Таблица 12 Биохимические показатели крови крыс после введения «Таунита-М» в течение 1 месяца
Показатель Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3
Контроль 25 5 1
Общий белок, г/л 63,1±1,8 68,5±3,9* 65,9±1,9* 67,2±3,3*
Глюкоза, ммоль/л 8,1±1,1 6,8±0,4 7,4±1,2 8,2±1,3
Мочевина, ммоль/л 7,7±0,7 7,9±0,5 7,6±0,7 8,2±0,8
Холестерин, ммоль/л 1,6±0,2 1,3±0,1* 1,3±0,1* 1,8±0,1
Билирубин, мкмоль/л 16,6±1,9 15,1±0,7 16,8±2,4 15,1±0,7
Креатинин, мкмоль/л 60,7±1,9 61,1±3,9 56,1±3,4* 60,2±3,7
АлАТ, Е/л 59,8±7,2 53,0±9,9 54,1±11,8 68,5±10,0
АсАТ, Е/л 108,1±14,1 104,7±14,5 117,3±2,4 120,0±16,1
Щелочная фосфатаза, Е/л 177,3±34,9 154,0±19,4 138,9±27,2 211,9±20,7
Примечание: * — различие с контролем статистически достоверно по /-критерию Стьюдента, р<0,05.
Иммунотоксическое действие. Изучение иммунотоксического действия МУНТ «Таунит-М» проводили на отдельной группе животных при ингаляционном введении исследуемого материала в течение 1 месяца.
Исследовали воздействие трех концентраций аэрозоля: 1, 5 и 25 мг/м3. На следующие сутки после последнего ингаляционного введения МУНТ оценивали уровень Т- и В-лимфоцитов крови, комплемента в сыворотке крови, а также фагоцитарную активность ПМФ.
Приведенные в таблице 13 данные свидетельствуют об отсутствии различий в уровнях Т- и В-лимфоцитов у животных из опыта и контроля.
Уровень комплемента у крыс после ингаляционного введения МУНТ не отличался от уровня в контрольной группе. Установлено также, что показатели фагоцитарной активности ПМФ у крыс после ингаляционного введения МУНТ достоверно не отличались от значений в контрольной группе.
Таким образом, установлено, что при ингаляционном введении в течение 1 месяца в концентрациях до 25 мг/м3 МУНТ
гической нормы. Достоверно значимых различий в массе тела между экспериментальными группами животных и контрольной не выявлено. По-видимому, в течение этого периода произошла адаптация животных к поступлению исследуемого наноматериала.
Цитологические и биохимические исследования образцов БАЛ. Подсчет клеток в мазках из БАЛ после окончания ингаляционного введения «Таунита-М» выявил достоверно значимое снижение доли альвеолярных макрофагов и увеличение доли эозинофилов в группах животных, получавших препарат при концентрациях в аэрозольной камере 25 и 5 мг/м3, а также достоверно значимое увеличение доли сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов в группе животных, получавших препарат при концентрации 25 мг/м3 (табл. 14).
Анализ данных показывает, что исследуемый наноматериал при ингаляционном введении в течение 4 месяцев вызывает значительные изменения клеточного состава БАЛ. Снижение доли макрофагов и увеличение остальных популяций клеток у экспериментальные животных на больших дозах может свидетельствовать о развивающемся альвеолите.
По результатам биохимического исследования БАЛ крыс после 4-месячного курса ингаляционного введения «Таунита-М» у животные подопыггные групп установлено статистически значимое относительно контрольной группы повышение активности ЩФ в группе, экспонированной при концентрации аэрозоля 25 мг/м3 (табл. 15).
Таблица 13 Оценка иммунотоксического действия «Таунита-М» при ингаляционном введении крысам в течение 1 месяца
Исследованный показатель Полученные значения (M±m)
Контроль Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3
1 5 25
Е-РОК, % 30,8±2,4 1,4±2,2 1,2±1,6 1,8±2,8
ЕАС-РОК, % 8,8±1,6 8,4±1,7 8,8±1,0 8,6±1,9
АФ, % 62,0±2,3 62,8±1,8 62,2±3,2 62,6±2,1
ИФ, м.кл. 2,6±0,2 2,6±0,1 2,6±0,1 2,6±0,2
Уровень комплемента, log2 титра 2,8±0,6 2,6±0,7 2,6±0,7 2,8±0,6
Таблица 14 Процентное соотношение различных видов лейкоцитов в окрашенных мазках БАЛ после окончания ингаляционного введения «Таунита-М»
Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3 Эозино-филы, % Сегменто-ядерные нейтрофилы, % Лимфоциты, % Макрофаги, %
25 2,4±1,2* 19,8±4,8* 39,7±3,8* 38,2±7,4*
5 1,9±0,6* 17,5±4,5 32,7±5,9 47,9±4,9*
1 0,5±0,3 17,7±8,9 25,9±4,9 56,1±7,9
Контроль 0,6±0,6 9,8±4,2 27,6±4,3 62,1±5,7
Примечание: * — различие с контролем статистически /-критерию Стьюдента, р<0,05. значимо по
«Таунит-М» иммунотоксическим действием не обладают.
Результаты исследований после 4 месяцев ингаляций
Клинические исследования. Клиническое состояние, потребление корма и воды у животных, получавших ин-галяционно на протяжении 4 месяцев исследуемый препарат «Таунит-М», соответствовали показателям физиоло-
Таблица 15 Биохимические показатели БАЛ крыс после 4-месячного курса введения «Таунита-М»
Показатель Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3
Контроль 25 5 1
ЛДГ, Е/л 42,6±4,9 41,9±2,6 49,9±13,9 45±7,2
ЩФ, Е/л 26,7±8,9 61,8±12,3* 26,8±4,9 33±5,6
Примечание: * — различие с контролем статистически достоверно по /-критерию Стьюдента, р<0,05.
Гематологические и биохимические исследования образцов крови. По окончании хронической затравки «Таунитом-М» показано достоверное увеличение количества лейкоцитов на всех испытанных концентрациях аэрозоля (табл. 16). Снижение количества тромбоцитов у животных, получавших ингаляции минимальной концентрацией аэрозоля, следует рассматривать как случайное, так как отсутствует дозовая зависимость.
По результатам биохимического исследования сыворотки крови крыс после 4-месячного курса введения «Таунита-М» у животных подопытных групп установлены следующие статистически значимые изменения относительно контрольной группы (табл. 17):
• повышение активности АсАТ в группе, экспонированной при концентрации аэрозоля 25 мг/ м3;
• понижение концентрации холестерина и повышение активности АлАТ и АсАТ в
Таблица 16
Гематологические показатели крови крыс после окончания курса ингаляционного введения «Таунита-М»
Показатель Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3
25 5 1 Контроль
Гемоглобин, г/л 176,0±14,9 170,3±17,7 167,0±6,5 161,8±2,1
Эритроциты, млн/мм3 9,9±0,7 9,6±0,9 9,6±0,2 9,7±0,4
Гематокрит, % 50,6±5,4 48,1±4,9 48,0±1,6 46,8±0,5
Ср. объем эритроцита, мкм3 51,1±1,8 49,9±1,4 50,0±1,3 48,6±1,8
Ретикулоциты, % 3,1±3,5 1,4±0,2 1,3±0,1 1,6±0,7
Тромбоциты, тыс. 1390,5±186,5 1336,5±363,7 1225,8±32,3* 1295,3±30,5
Лейкоциты, тыс./мм3, 18,1±8,3* 10,9±0,7* 11,4±0,6* 9,2±0,9
в том числе:
Базофилы, % 0 0,3±0,5 0,3±0,5 0
Эозинофилы, % 1,0±0,1 0,8±0,5 0,3±0,5 0,3±0,5
Юные, % 0 0 0 0
Палочкоядерные, % 2,8±1,3 2,3±1,0 2,5±1,3 3,8±2,2
Сегментоядерные, % 52,8±7,9* 39,3±4,8 43,8±8,7 36,5±3,7
Лимфоциты, % 36,3±8,8* 54,3±3,5 48,8±6,6 56,0±2,4
Моноциты, % 7,3±2,2 3,3±1,3 4,5±1,3 3,5±1,7
Примечание: * — различие с контролем Стьюдента, р<0,05. статистически достоверно по /-критерию
группе, экспонированной при концентрации аэрозоля 5 мг/ м3; • повышение активности АлАТ и АсАТ в группе, экспонированной при концентрации аэрозоля 1 мг/ м3.
Исследование образцов мочи. После 4-месячного курса ингаляционного введения наноматериала «Таунит-М» у крыс в экспериментальных группах, которые получали аэрозоль при концентрациях 1, 5 и 25 мг/м3, статистически значимых показателей мочи не отмечено.
Патоморфологические исследования. При патоморфологическом исследовании после 4-месячного курса ингаляционной экспозиции крыс в аэрозоле «Таунит-М» при наружном осмотре не было установлено различий между трупами животных подопытных и контрольной групп: шерстный покров был гладкий, блестящий, кожа эластичная, подвижная, подкожная клетчатка умеренно выражена, видимые слизистые оболочки бледные, чистые, без изъязвлений и посторонних наложений, патологические выделения из естественных отверстий тела отсутствовали.
При патологоанатомическом вскрытии животных подопытных и контрольной групп органы грудной и брюшной полостей имели анатомически правильное расположение и нормальную макроструктуру, за исключением легких крыс, получавших аэрозоль «Таунит-М» в концентрации 25 мг/м3. Легкие указанных животных имели слегка бугристую поверхность и пеструю окраску из перемежающихся участков серого, бурого и черного цвета (рис. 2). При этом легкие крыс, получавших аэрозоль нанотрубок в меньших концентрациях, имели нормальный вид и макроструктуру, не отличавшиеся от таковых у животных контрольной группы.
При статистическом анализе коэффициентов относительной мас-
Таблица 17 Биохимические показатели крови крыс после 4-месячного курса введения «Таунита-М»
Показатель Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3
Контроль 25 5 1
Общий белок, г/л 66,1±3,4 62,9±3,7 63,3±4,0 65,5±0,6
Глюкоза, ммоль/л 5,8±1,4 4,5±1,5 5,3±0,7 5,9±0,5
Мочевина, ммоль/л 5,4±0,8 6,9±1,9 6,6±1,2 5,7±0,8
Холестерин, ммоль/л 1,3±0,2 0,9±0,4 1,0±0,2* 1,2±0,2
Билирубин, мкмоль/л 3,5±0,5 4,4±2,6 5,1±2,5 4,8±2,6
Креатинин, мкмоль/л 63,1±1,8 68,3±6,9 64,6±3,2 63,1±1,2
АлАТ, Е/л 64,6±6,2 70,1±19,5 85,3±15,7* 89,8±13,2*
АсАТ, Е/л 149,4±17,3 203,5±9,7* 226,1±27,5* 199,9±39,9*
ЩФ, Е/л 164,9±29,0 181,5±47,1 163,3±36,6 184,8±25,4
Примечание: * — различие с контролем статистически достоверно по /-критерию Стьюдента, р<0,05.
сы органов крыс было установлено значимое превышение коэффициента легких животных, получавших аэрозоль «Таунит-М» в концентрациях 25 и 5 мг/м3, относительно показателя контрольной группы (табл. 18).
Таблица 18 Коэффициенты относительной массы внутренних органов крыс после 4 месяцев ингаляционной затравки аэрозолем «Таунит-М»
Концентрация «Тауни-та-М» в аэрозоле, мг/м3 Сердце Легкие Печень Почки Селезенка
Контроль 3,1±0,3 7,3±1,3 24,1±0,7 6,5±0,5 1,5±0,2
25 3,9±1,0 18,4±11,7* 29,2±4,5 6,6±1,0 1,5±0,4
5 3,2±0,3 10,3±1,6* 28,2±4,0 6,1±0,4 1,4±0,4
1 3,2±0,5 8,9±1,1 25,1±1,5 7,3±1,0 1,2±0,2
Примечание: * — различие с /-критерию Стьюдента, р<0,05. контролем статистически достоверно по
При патоморфологическом исследовании гистологических препаратов органов крыс значимые изменения были отмечены в легких всех крыс, получавших аэрозоль «Таунит-М». При этом морфологическая картина мало зависела от концентрации нанотрубок в аэрозоле и, с небольшой вариабельностью, заключалась в следующем.
В полостях альвеол обнаруживали свободнолежащие (одиночные и группами) макрофаги с черными включениями высокой оптической плотности (рис. 3). Поскольку в данном случае было известно, что эти включения являются исследуемыми нанотрубками, далее макрофаги с частицами классифицировали как кониофаги.
Встречались также отдельные альвеолы, плотно заполненные макрофагами без видимой фагоцитарной активности и не содержавшие каких-либо видимых частиц. В основном ткань легкого и большинство бронхов не имели видимых повреждений, лишь в отдельных участках средних и мелких бронхов определялись немногочисленные очаги некроза и гнойного расплавления слизистой оболочки (рис. 4). При этом признаков фибропролиферативного процес-
Рис. 2. Легкое крысы № 13
Бугристая поверхность и пестрая окраска органа (концентрация «Таунита-М» в аэрозоле 25 мг/м3)
Рис. 3. Кониофаги в полостях альвеол, легкое крысы № 11
Окраска гематоксилином и эозином, ув. 400 (концентрация «Таунита-М» в аэрозоле 25 мг/м3)
Гематологические и биохимические исследования образцов крови. Гематологические показатели крови крыс после восстановительного периода представлены в таблице 19.
Отмечено повышение концентрации гемоглобина и уровня гематокрита в группе крыс, экспонированных при концентрации «Таунита-М» в аэрозоле 25 мг/м3, а также количества ретикулоцитов в группе крыс, экспонированных при концентрации «Таунита-М» в аэрозоле 5 мг/м3. Лейкоцитарная формула в экспериментальных группах не имела достоверных различий с контролем.
После восстановительного периода у крыс отмечено статистически значимое различие в следующих биохимических показателях крови (табл. 20):
• повышение уровня билирубина в группе, получавшей аэрозоль «Таунит-М» в концентрации 25 мг/м3;
• повышение уровня креатинина в группе, получавшей аэрозоль «Таунит-М» в концентрации 5 мг/м3;
• повышение уровня билирубина в группе, получавшей аэрозоль «Таунит-М» в концентрации 1 мг/м3.
Анализ результатов биохимических показателей сыворотки крови крыс после восстановительного периода показывает, что полученные изменения показателей у животных
Таблица 19 Гематологические показатели крови крыс после восстановительного периода
Показатель Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3
25 5 1 Контроль
Гемоглобин, г/л 155,3±6,4* 166,7±2,1 160,4±4,2 163,4±1,7
Эритроциты, млн/мм3 8,7±0,4 9,2±0,2 9,0±0,2 9,1±0,3
Гематокрит, % 43,0±1,9* 45,3±1,0 44,4±1,2 44,9±0,2
Средний объем эритроцита, мкм3 49,5±0,8 49,6±0,1 49,6±0,5 19,4±1,6
Ретикулоциты, % 2,1±0,7 1,5±0,2* 2,8±0,6 2,9±1,4
Тромбоциты, тыс. 1234,3±113,6 1285,3±60,7 1300,8±220,8 1305,1±90,7
Лейкоциты, тыс./мм3, в том числе: 15,1±4,0 13,3±0,9 11,4±2,6 10,6±1,6
Базофилы, % 0,7±0,6 0,3±0,6 0,4±0,5 0,6±0,5
Эозинофилы, % 1,7±1,5 0,7±0,6 0,6±0,5 0,6±0,5
Юные, % 0 0 0 0
Палочкоядерные, % 3,0±1,7 2,3±0,6 2,2±0,8 3,0±1,2
Сегментоядерные, % 45,3±2,3 57,3±3,1 43,2±6,1 51,4±5,5
Лимфоциты, % 43,7±4,2 32,3±3,8 47,6±6,2* 37,4±4,5
Моноциты, % 5,7±0,6 7,0±2,0 5,4±0,9 7,0±1,6
Примечание: * — различие с контролем статистически достоверно по /-критерию Стьюдента, р<0,05.
Рис. 4. Легкое крысы № 14
Окраска гематоксилином и эозином, ув. 400. Некроз и гнойное расплавление стенки бронха (концентрация «Таунита-М» в аэрозоле 25 мг/м3)
са в легких не наблюдали, в том числе при исследовании препаратов органа, окрашенных по Ван Гизону.
Исследования по завершении восстановительного периода
Клинические исследования. Клиническое состояние, потребление корма и воды у животных в течение восстановительного периода соответствовали показателям физиологической нормы. Достоверно значимых различий массы тела между экспериментальными и контрольной группами животных не выявлено.
Таблица 20 Биохимические показатели крови крыс после восстановительного периода
Показатель Концентрация «Таунита-М» в аэрозоле, мг/м3
Контроль 25 5 1
Общий белок, г/л 68,9±2,1 73,0±4,8 68,2±1,0 73,0±4,2
Глюкоза, ммоль/л 6,5±1,2 7,4±3,0 5,7±0,1 5,4±0,2
Мочевина, ммоль/л 6,0±1,0 6,4±1,1 7,0±0,8 6,1±0,5
Холестерин, ммоль/л 1,5±0,3 1,6±0,2 1,3±0,1 1,3±0,2
Билирубин, мкмоль/л 3,6±0,8 7,0±0,9* 4,8±1,0 7,2±1,2*
Креатинин, мкмоль/л 58,6±1,5 60,3±5,9 63,9±2,1* 57,3±3,1
АлАТ, Е/л 74,4±10,7 74,9±12,8 79,3±14,0 77,8±12,2
АсАТ, Е/л 160,4±25,6 156,6±10,2 183,3±14,4 180,2±28,6
ЩФ, Е/л 157,7±17,8 184,4±55,5 164,7±20,3 180,9±22,6
Примечание: * — различие с контролем статистически достоверно по /-критерию Стьюдента, р<0,05.
подопытных групп не имеют дозовой зависимости, вызваны случайными причинами и не связаны с действием тестируемого наноматериала.
Исследование образцов мочи. После восстановительного периода статистически значимых различий у животных подопытных групп по сравнению с контролем не выявлено.
Патоморфологические исследования. По окончании восстановительного периода при патологоанатомическом вскрытии животных подопытных и контрольной групп наблюдали ту же картину, что и после периода затравки: органы грудной и брюшной полостей имели анатомически правильное расположение и нормальную макроструктуру, за исключением легких крыс, ранее получавших аэрозоль в концентрации 25 мг/м3. Как и в предыдущий срок исследования, легкие указанные животные имели слегка бугристую поверхность и пеструю окраску из перемежающихся участков серого, бурого и черного цвета, и коэффициенты относительной массы легких животные, получавших аэрозоль нано-трубок в концентрациях 25 и 5 мг/м3, зна-
чимо превышали показатель контрольной группы (табл. 21).
При патоморфологическом исследовании гистологических препаратов органов крыс значимые изменения также были отмечены только в легких. Однако, в отличие от исследования по окончании затравки, в контрольной группе у трех крыс из пяти наблюдали ма-крофагальную реакцию в легких (без видимых включений в макрофагах), в двух случаях сопряженную с наличием очагов некроза и гнойного расплавления слизистой оболочке бронхов.
В легких крыс морфологическая картина мало зависела от концентрации ранее ин-галированного аэрозоля «Таунит-М». У всех крыс, как и в первый период исследования, в стенках и просветах альвеол обнаруживались немногочисленные кониофаги. Однако у отдельных животных в каждой из групп имелись перибронхиально расположенные небольшие поля альвеол, заполненных макрофагами, полиморфноядерными лейкоцитами, с отдельными узелками из полиморфно-ядерных лейкоцитов. Также встречались немногочисленные плазмоцитарные гранулемы (рис. 5). Важным отличительным морфологическим признаком по сравнению с первым сроком исследования стало обнаружение у отдельных животных в каждой из групп, экспонированные в аэрозоле «Таунит-М», пе-рибронхиальных очагов грануляционной ткани с разрастанием волокон соединительной ткани (рис. 6) . При этом фибропластиче-ская пролиферация наблюдалась именно пе-рибронхиально и не затрагивала альвеолярную часть легких.
Таким образом, ингаляционная затравка крыс аэрозолем МУНТ «Таунит-М» в концентрациях 1—25 мг/м3 в течение 4 месяцев вызывает развитие у животных антра-козного фиброза (пятнистого антракоза). При этом собственно фиброзные изменения встречаются только у отдельных животные и выра-
Таблица 21 Коэффициенты относительной массы внутренних органов крыс после окончания восстановительного периода
Концентрация «Тауни-та-М» в аэрозоле, мг/м3 Сердце Легкие Печень Почки Селезенка
Контроль 3,4±0,3 7,8±1,2 24,9±1,8 6,4±0,3 1,5±0,1
25 3,8±0,1 12,3±2,7* 29,0±5,9 6,9±0,3 1,6±0,2
5 3,6±0,4 10,2±0,5* 25,3±0,9 6,9±0,6 1,2±0,2
1 3,4±0,5 9,1±1,1 25,6±2,5 6,7±0,4 1,6±0,4
Примечание: * — различие с контролем статистически достоверно по Стьюдента, р<0,05. /-критерию
Рис. 5. Гранулема из плазматических клеток в легком крысы № 21
Окраска гематоксилином и эозином, ув. 400 (концентрация «Таунита-М» в аэрозоле 25 мг/м3)
жены локально и достаточно слабо. Следует также особо отметить существенную материальную кумуляцию нанотрубок «Таунит-М» в легких животных, что подтверждается их длительной персистенцией в кониофагах и общим накоплением в ткани легких. Это приводит к стойкому увеличению показателя относительной массы органа.
Обсуждение результатов
Карбокониозы объединяют различные профессиональные заболевания легких, связанные с ингаляцией пыли углерода: антрацита, других видов угля, графита и сажи. В условиях горной промышленности и других производств, как правило, аэрозоли и пыль содержат не только углеродные частицы, но и двуокись кремния, а это отражается на характере заболеваний легких. Специалисты Института медицины труда РАМН, обобщая отечественный и мировой опыт профпатологов, предложили относить аэрозоли угольной пыли к фиброген-ным, если в них более 10% двуокиси кремния. Таким образом, двуокиси кремния отводится роль основного фиброгенного агента [1]. Угольные частицы, особенно если это частицы сажи, вызывают карбокониозы со слабо выраженным фиброзом легких. Аэрозоль антрацита среди других угольных аэрозолей обладает наиболее выраженным фиброгенным действием. К сожалению, достаточно сложно выделить фи-брогенное действие чисто углеродных частиц, так как в условиях промышленности практически всегда есть примесь двуокиси кремния.
Рис. 6. Фибропластический узелок в легком крысы № 21
Перибронхиальный очаг грануляционной ткани. Окраска по Ван Гизону, ув. 100 (концентрация «Таунита-М» в аэрозоле 25 мг/м3)
МУНТ представляют собой материал из чистого углерода с регулярной волокнистой структурой, поэтому оценка их влияния на легочную ткань экспериментальных животных позволит прогнозировать последствия воздействия на персонал в условиях производства и использования углеродных наноматериалов.
По результатам проведения острого ингаляционного эксперимента установлены следующие параметры острой ингаляционной токсичности МУНТ «Таунит-М».
Среднее мертельная концентрация «Таунита-М» в воздухе не достигнута, так как в исследованиях более высоких, чем 100.мг/м3, концентраций с высокой вероятностью может наблюдаться не токсическое, а механическое действие углеродного нано-материала [5].
В качестве действующей установлена концентрация аэрозоля МУНТ &Тау-нит-М[ 111 мг/м3. Отмечено достоверное увеличение количества макрофагов в брон-хоальвеолярной жидкости, увеличение доли сегментоядерных нейтрофилов, снижение доли лимфоцитов, а также увеличение активности ЩФ.
В качестве порога острого действия аэрозоля МУНТ &Таунит-М> установлена концентрация Lim = 39 мг/м3. Показано достоверное увеличение количества альвеолярных макрофагов, снижение доли лимфоцитов и повышение активности ЩФ.
Недействующая концентрация аэрозоля многостенных МУНТ &Таунит-М>
в остром опыте составила 14 мг/м3. При данной концентрации аэрозоля было отмечено только снижение доли лимфоцитов в лаважной жидкости через 14 суток после ингаляции. Остальные изученные параметры токсикометрии соответствовали таковым у контрольных животных.
Хроническая ингаляционная .затравка крыс аэрозолем МУНТ «Таунит-М» в концентрациях 1—25 мг/м3 в течение 4 месяцев вызывала развитие у животных ан-тракозного фиброза (пятнистого антракоза). Фиброзные изменения встречались только у отдельные животные и были выражены достаточно слабо.
Концентрация аэрозоля 25 мг/м3 оценивается как действующая (12 показателей жизнедеятельности отличаются от контроля).
В качестве порога хронического действия предлагается концентрация ЫтсЬ = 5 мг/м3 ( 7 показателей жизнедеятельности отличаются от контроля).
Изученную в эксперименте концентрацию 1 мг/м3 предлагается предварительно рассматривать как недействующую, поскольку выявленные достоверные на данной концентрации аэрозоля изменения носят непостоянный характер и существенно не отличаются от контрольных значений. Для уточнения этого показателя, вероятно, потребуется проведение исследований с более низкими концентрациями аэрозоля МУНТ «Таунит-М».
Заключение
Многостенные углеродные нанотруб-ки «Таунит-М» при однократном воздействии в виде аэрозоля в концентрации 39 мг/м3 и выше вызывают раздражение слизистой оболочки дыхательных путей.
В концентрациях, близких к действующим гигиеническим нормативам для аэрозолей углеродных материалов (уголь, графит, сажа) в воздухе рабочей зоны, многостенные углеродные нанотрубки «Таунит-М» способны вызывать развитие клинической картины антракоза у экспериментальных животных.
Литература
1. Бабанов С.А., Аверина О.М. Диагностика, лечение и профилактика профессионалы-ных заболеваний легких // Русский медицинский журнал. 2012. № 6. С. 306.
2. Дыячков П.Н. Углеродные нанотрубки: строение, свойства, применение. М.: БИНОМ, 2006.
3. Крестинин А.В. Проблемы и перспективы развития индустрии углеродных нанотру-бок в России // Наноматериалы. 2007. Т. 2. № 5-6. С. 18-23.
4. Маркетинговые исследования рынка углеродных нанотрубок: Аналитический отчет. Research Techart, 2012.
5. Методические рекомендации МР № 267383 «Обоснование пределыно допустимых концентраций (ПДК) аэрозолей в рабочей зоне». М., 1983.
6. Ткачев А.Г. Углеродный наноматериал «Таунит» — структура, свойства, производство и применение // Перспективные материалы. 2007. № 3. С. 5—9.
7. Толчинский А.Д., Сигаев В.И., Воро-быев А.В., Мажинский А.А. Разработка и испытания экспозиционной аэрозолы-ной камерной установки для нормирования вредных веществ в воздухе рабочей зоны // Прикладная токсикология. 2014. № 1. С. 10—17.
8. Томишко М.М., Демичева О.В., Алексеев А.М. и др. Многослойные углеродные нанотрубки и их применение // Российский химический журнал. 2008. Т. LII. № 5. С. 39—42.
9. Сигаев В.И., Толчинский А.Д., Воро-быев А.В., Звягина Е.В. Технические и методологические аспекты перевода волокнистых углеродных материалов в аэ-розолыное состояние при проведении ингаляционные токсикологических экспериментов / / Прикладная токсикология. 2015. № 1. С. 44—54.
10. Ellinger-Ziegelbauer H., Pauluhn J. Pulmonary toxicity of multi-walled carbon nanotubes (baytubes) relative to alpha-quartz following a single 6 h inhalation exposure of rats and a 3 months post-
exposure period // Toxicology. 2009. Vol. 266. P. 16-29.
11. Lam C.W., James J.T., McCluskey R., Hunter R.L. Pulmonary toxicity of singlewall carbon nanotubes in mice 7 and 90 days after intratracheal instillation // Toxicological Sciences. 2004. Vol. 77. P. 126-134.
12. Ma-Hock L., Treumann S., Strauss V. et al. Inhalation toxicity of multiwall carbon nanotubes in rats exposed for 3 months // Toxicological Sciences. 2009. Vol. 112. P. 468-481.
13. Markets and Markets, 2014. Available at: http: / /www. marketsandmarkets. com / (accessed: 13.12.2016).
14. Muller J., Huaux F., Moreau N. et al. Respiratory toxicity of multi-wall carbon nanotubes // Toxicology and Applied Pharmacology. 2005. Vol. 207. P. 221-231.
15. Pauluhn J. Subchronic 13-week inhalation exposure of rats to multi-walled carbon nanotubes: Toxic effects are determined by density of agglomerate structures, not fibrillar structures // Toxicological Sciences. 2010. Vol. 113. P. 226-242.
16. Porter D.W., Hubbs A.F., Chen B.T. et al. Acute pulmonary dose-responses to inhaled multi-walled carbon nanotubes // Nanotoxicology. 2013. Vol. 7. No. 7. P. 1179-1194.
17. Ryman-Rasmussen J.P., Tewksbury E.W., Moss O.R. et al. Inhaled multi-walled carbon nanotubes potentiate airway fibrosis in murine allergic asthma // American
Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 2009. Vol. 40. P. 349-358.
18. Shvedova A.A., Kisin E.R., Mercer R. et al. Unusual inflammatory and fibrogenic pulmonary responses to single-walled carbon nanotubes in mice // American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 2005. Vol. 289. No. 5. P. 698-708.
19. Stapleton P. A., Minarchick V.C., Cump-ston A.M. et al. Impairment of coronary arteriolar endothelium-dependent dilation after multi-walled carbon nanotube inhalation: A time-course study // International Journal of Molecular Sciences.
2012. Vol. 13. P. 13781-13803.
20.Umeda Y., Kasai T., Saito M. et al. Two-week toxicity of multi-walled carbon nanotubes by wholebody inhalation exposure in rats // Journal of Toxicologic Pathology.
2013. Vol. 26. P. 131-140.
21. Warheit D.B., Laurence B.R., Reed K.L. et al. Comparative pulmonary toxicity assessment of single-wall carbon nanotubes in rats // Toxicological Sciences. 2004. Vol. 77. P. 117-125.
Контакты:
Сигаев Владимир Иванович,
ведущий научный сотрудник отдела аэрозольной токсикометрии НИЦ ТБП — филиала ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник. Тел. раб.: (4967) 39-97-38. E-mail: vsigaev@list.ru
