CC BY
7
сокогорного природного очага чумы (Faunistic complexes of Caucasian mountain ground squirrel fleas withintheterritoryoftheCentralCaucasianhigh-mountai-nnaturalfocusofplague) / Л.И. Белявцева, Е.А. Котене-ва, Г.А. Мозлоев, Н.В. Цапко, Н.А. Давыдова, В.М. Дубянский / Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2018. № 3. С. 5-9.
prirodnogo ochaga chumy (Faunistic complexes of Caucasian mountain ground squirrel fleas withintheterri-toryoftheCentralCaucasianhigh-mountainnaturalfocus-ofplague) / L.I. Belyavceva, E.A. Koteneva, G.A. Mo-zloev, N.V. Capko, N.A. Davydova, V.M. Dubyanskij / Medicinskaya parazitologiya i parazitarnye bolezni. 2018. № 3. S. 5-9.
Белявцева Лариса Ивановна - кандидат биологических наук, биолог лаборатории медицинской паразитологии; Цапко Николай Владимирович - кандидат географических наук, биолог лаборатории медицинской паразитологии; Дубянский Владимир Маркович - доктор биологических наук, заведующий отделом эпизоотологиче-ского мониторинга и прогнозирования; Давыдова Наталья Анатольевна - биолог лаборатории медицинской зоологии; Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора.
УДК 616.98:579.841.95
Борисова С.В., Волох О.А., Кравцов А.Л., Кожевников В.А.
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, г. Саратов, Россия
ОЦЕНКА ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ СТРЕСС-БЕЛКОВ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА
Была проведена сравнительная оценка иммунобиологических свойств секретируемых стресс-белков (ШР, GroEl, В&) туляремийного микроба путем анализа процессов апоптоза и пролиферации иммунокомпетент-ных клеток морских свинок. Показано, что все исследуемые антигены вызывали иммунный ответ у биомоделей. Но введение комплекса белков (ШР) приводило к повреждению иммунных клеток крови и селезенки. Препараты GroEl и В& не нарушали баланс апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток. Это может служить основанием для их дальнейшего изучения и практического использования.
Ключевые слова: стресс-белки, FranciseUa tularensis, апоптоз, пролиферация.
Borisova S.V., Volokh O.A., Kravtsov A.L., Kozhevnikov V.A.
FGIH "Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe " of the Rospotrebnadzor, Saratov, Russia
EVALUATION OF IMMUNOBIOLOGICAL PROPERTIES OF TULAREMIA MICROBE STRESS PROTEINS
A comparative evaluation of the immunobiological properties of secreted stress proteins (HSP, GroEl, Bfr) of tularemia microbe was carried out by analyzing the processes of apoptosis and proliferation of guinea pig immunocompetent cells. It was shown that all the antigens elicited an immune response in biomodels. But the introduction of the proteins complex HSP led to damage of the blood and spleen immune cells. GroEL and Bfr preparations did not disrupt the balance of apoptosis and proliferation of immunocompetent cells. This can serve as a basis for their further study and practical use.
Keywords: stress proteins, Francisella tularensis, apoptosis, proliferation.
Белки-шапероны туляремийного микро- (HSP) - это семейство белков, которые выра-ба важны для адаптации микроорганизма к батываются клетками в ответ на воздействие воздействию стресс-факторов и при попадании стрессовых условий. Многие из них выполняв организм генерируют мощный иммунный ют функции шаперонов [10]. GroEL (HSP60) -ответ против инфекции [6]. Heat shock proteins это белок, который принадлежит к семейству © Борисова С.В., Волох О.А., Кравцов А.Л., Кожевников В.А., 2021
ВОПРОСЫ ЭПИДЕМИОЛОГИИ
HSP и содержится во многих бактериях [8]. Бактериоферритин (Bfr) - это белок, который способствует удалению H2O2 из цитоплазмы и уменьшению продукции активных форм кислорода [7]. Белки теплового шока F. tularensis могут рассматриваться как перспективные компоненты профилактических и диагностических препаратов [1]. Ранее было показано, что комплексный антиген Bfr-О, полученный из клеток туляремийного микроба, обладает иммуногенностью и не токсичен для животных [3]. Одним из современных методов для оценки иммунного ответа организма на воздействие чужеродных антигенов является проточная цитофлюориметрия [5].
Целью работы являлась оценка иммунобиологических свойств секретируемых стресс-белков (HSP, GroEl, Bfr) методами in vivo и in vitro.
В работе использовался штамм Francisella tularensis 15 НИИЭГ, полученный из «Государственной коллекции патогенных бактерий». Клетки подвергали сочетанному стрессу - повышению температуры до 42 оС с добавлением 5мМ Н2О2. Стрессовое состояние клеток контролировалось методом электрооптического анализа [4]. После чего из безмикробного центрифугата антигенные препараты выделяли методом высаливания сульфатом аммония (насыщение 70%), с последующей хроматографической очисткой. Контроль чистоты выделенных фракций определяли методом SDS-электрофореза.
Работа была выполнена на 15 морских свинках массой от 270±30 г, иммунизированных антигенными препаратами подкожно в концентрации 0,5 мг/мл по белку. Группу контроля составили 3 морские свинки, которым был введен равный объем 0,9 % NaCl. Все работы с животными проводили в соответствии с протоколом исследования, утвержденным биоэтической комиссией института «Микроб» в условиях вивария ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» с уровнем биологической безопасности BCL 3. В течение первых 7 дней проводили оценку реактогенности вводимых биомоделям препаратов АГ. Каждый день определяли массу тела морских свинок, осматривали и пальпировали место инъекции. Через 7, 14, 21 и 30 дней у животных забирали кровь из сердца. Из крови выделяли сыворотку для иммунологических исследований и лейкоциты. Фракцию лейкоцитов получали методом лизиса эритро-
цитов деионизованной водой и изучали влияние стресс-белков на процентный состав лимфоцитов и гранулосодержащих фагоцитов, показатели апоптоза и пролиферации. На 30-е сутки животных умерщвляли хлороформом, извлекали селезенку и проводили выделение спленоцитов по стандартному протоколу [2]. Спленоциты анализировали на апоптоз и пролиферацию, а также на соотношение этих двух показателей. Все манипуляции с лимфоцитами, фагоцитами и спленоцитами проводились на проточном цитофлуориметре CyAn (Beckman Coulter, USA) после окрашивания раствором, содержащим 50 мкг/мл пропидия йодида [9]. Титр антител к стресс-белкам в сыворотках животных изучался методом им-муноферментного анализа.
Изменение количества лимфоцитов и гранулосодержащих фагоцитов под влиянием антигенных препаратов в различные сроки. Показано, что через 7 дней, в крови опытных образцов произошло существенное снижение доли фагоцитов: в случае с GroEl на 7-е сутки (до 1,9 %), а с Bfr на 14-е сутки (до 0,5 %), после чего, на 21-е сутки, все приходило в норму. Причиной может быть активация процессов клеточной миграции, когда в кровь поступают незрелые фагоциты, обладающие пролиферирующей активностью, в которых низкое содержание цитоплазматических гранул. Под действием HSP количественное содержание гранулоцитов практически не изменялось с течением времени.
Апоптоз лимфоцитов в крови оценивали по накоплению гиподиплоидных клеток. Введение морским свинкам HSP сильно повышало апоптическую активность лимфоцитов до максимального значения - относительно контроля данный показатель вырос в 5 раз на 7-е сутки. Однако, начиная с 21 суток, процент лимфоцитов в стадии апоптоза снижается. Одновременно с этим возрастает пролиферативная активность. Это может быть обусловлено пролиферацией В-клеток и продукцией антител, что подтверждается иммуноферментным анализом. Было показано, что на 7 и 14-е сутки титр антител в сыворотках биомоделей, иммунизированных GroEl и Bfr был 1/160, а у HSP наблюдался пик антителогенеза - 1/640. На 30-й день количество гиподиплоидных клеток снизилось до контрольных значений, как и титр антител. Например, у HSP он составил 1/160, а у GroEl и Bfr не превышал 1/80.
Соотношение апоптотических и пролифери-рующих лимфоцитов крови биомоделей показало, что данный показатель был превышен только у HSP - на 7-е сутки он возрос в 13 раз относительно контроля. Это говорит о повреждающем действии данного антигенного препарата на клетки крови.
При иммунизации морских свинок антигенными препаратами апоптозная и пролифе-ративная активность клеток селезенки на 30-е сутки иммуногенеза немного превышали показатели в группе контроля у всех групп белков. Так, например, препарат Bfr повышал проли-феративную активность в группе на 30±2,4 %. После введения GroEl и HSP также наблюдалось повышение, но всего на 3±0,5 и на 4,2±0,3 % соответственно. Однако во всех случаях соотношение спленоцитов в стадии апоптоза и пролиферации не превышало еди-
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
¡.Диагностическая значимость рекомбинант-ного белка GroEl FTT_1696 для выявления противо-туляремийных антител / А.А. Горбатов [и др.] // Бактериология. 2017. Т. 2. № 3. С. 9-15.
2.Иммунологические методы / под ред. Г. Фримеля. М. : Медицина. 1987. С. 374.
3.Комплекс Bfr-O антиген внешних мембран Francisella tularensis: получение, характеристика, возможности использования / Е.М. Кузнецова [и др.] // Биотехнология. 2019. Т. 35. № 1. С. 73-81.
4.Применение нового инструментального метода для оценки функционального состояния клеток Francisella tularensis в стрессовых условиях / С.В. Борисова [и др.] // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология. 2019. Т. 19. № 3. С. 326-330.
5.Применение проточной цитометрии при разработке вакцин против особо опасных инфекций: современные достижения и перспективы / А.Л. Кравцов [и др.] // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2011. № 4 (59). С. 53-60.
6.An improved vaccine for prevention of respiratory tularemia caused by Francisella tularensis SchuS4 strain / C.S. Bakshi [et. al.]. Vaccine 2008. Vol. 26 (41). P. 5276-5288. DOI: 10.1016/j.vaccine.2008.07.051.
7.Bacterioferritin protects the anaerobe Desul-fovibrio vulgaris Hildenborough against oxygen / M.C. Figueiredo [et. al.] // Anaerobe. 2012. Vol. 18 (4). P. 454-458. DOI: 10.1016/j.anaerobe.2012.06.001.
8.B-cell epitopes in GroEL of Francisella tularensis / Z. Lu [et. al.] // PLoS One. 2014. Jun. N. 26. Vol. 9 (6). P. 9-105. DOI: 10.1371/journal.pone.0099847. eCollection 2014.
9.Reduced apoptosis of mouse macrophages induced by yscW mutant of Yersinia pestis results from the reduced secretion of YopJ and relates to caspase-3 signal
ницы (от 0,02 до 0,31), что свидетельствует об отсутствии повреждающего действия стресс-белков на них. Таким образом, установлено, что белки GroEl и Bfr не оказывают повреждающего действия на иммунокомпетентные клетки селезенки морских свинок.
Иммунизация HSP оказывала незначительное повреждающее воздействие на иммунные клетки крови и селезенки, но не приводила к гибели животных. Препараты GroEl и Bfr туляремийного микроба не обладали токсичностью на уровне макроорганизма, не вызывали значимых изменений во внутренних органах и нарушения баланса процессов апоптоза и пролиферации иммунокомпе-тентных клеток в условиях данного эксперимента, что может служить основанием их дальнейшего изучения и практического использования.
REFERENCES
1. Diagnosticheskaya znachimost' rekombi-nantnogo belka GroEl FTT_1696 dlya vyyavleniya protivotulyaremijnyh antitel / A.A. Gorbatov [i dr.] // Bakteriologiya. 2017. T. 2. № 3. S. 9-15.
2. Immunologicheskie metody / pod red. G. Frimelya. M. : Medicina. 1987. S. 374.
3. Kompleks Bfr-O antigen vneshnih membran Francisella tularensis: poluchenie, harakteristika, vozmozhnosti ispol'zovaniya / E.M. Kuznecova [i dr.] // Biotekhnologiya. 2019. T. 35. № 1. S. 73-81.
4. Primenenie novogo instrumental'nogo metoda dlya ocenki funkcional'nogo sostoyaniya kletok Francisella tularensis v stressovyh usloviyah / S.V. Borisova [i dr.] // Izvestiya Saratovskogo universiteta. Novaya ser-iya. Seriya: Himiya. Biologiya. Ekologiya. 2019. T. 19. № 3. S. 326-330.
5. Primenenie protochnoj citometrii pri razrabot-ke vakcin protiv osobo opasnyh infekcij: sovremennye dostizheniya i perspektivy / A.L. Kravcov [i dr.] // Epi-demiologiya i vakcinoprofilaktika. 2011. № 4 (59). S. 53-60.
6. An improved vaccine for prevention of respiratory tularemia caused by Francisella tularensis SchuS4 strain / C.S. Bakshi [et. al.]. Vaccine 2008. Vol. 26 (41). P. 5276-5288. DOI: 10.1016/j.vaccine.2008.07.051.
7. Bacterioferritin protects the anaerobe Desul-fovibrio vulgaris Hildenborough against oxygen / M.C. Figueiredo [et. al.] // Anaerobe. 2012. Vol. 18 (4). P. 454-458. DOI: 10.1016/j.anaerobe.2012.06.001.
8. B-cell epitopes in GroEL of Francisella tu-larensis / Z. Lu [et. al.] // PLoS One. 2014. Jun. N. 26. Vol. 9 (6). P. 9-105. DOI: 10.1371/journal.pone.0099847. eCollection 2014.
9. Reduced apoptosis of mouse macrophages induced by yscW mutant of Yersinia pestis results from the reduced secretion of YopJ and relates to caspase-3 signal
ВОПРОСЫ ЭПИДЕМИОЛОГИИ
pathway / Y. Bi [et. al.] // Scand. J. Immunol. 2009. Vol. 70 (4). P. 358-367.
10. Struzik J, Szulc-Dqbrowska L, Nie-
mialtowski M. Participation of heat shock proteins in modulation of NF-kB transcription factor activation during bacterial // Postepy Hig Med Dosw. 2015. N. 2. P. 969-77. DOI: 10.5604/17322693.1165199.
pathway / Y. Bi [et. al.] // Scand. J. Immunol. 2009. Vol. 70 (4). P. 358-367.
10. Struzik J, Szulc-Dqbrowska L, Nie-mialtowski M. Participation of heat shock proteins in mod-ulation of NF-kB transcription factor activation during bacterial // Postepy Hig Med Dosw. 2015. N. 2. P. 969-77. DOI: 10.5604/17322693.1165199.
Борисова Светлана Владимировна - младший научный сотрудник лаборатории холерных вакцин отдела профилактических препаратов; Волох Оксана Александровна - кандидат биологических наук, заведующая отделом профилактических препаратов; Кравцов Александр Леонидович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела иммунологии; Кожевников Виталий Александрович - младший научный сотрудник отдела иммунологии; ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора.
УДК 616.98:616.61-002.151 (470.63)
Василенко Н.Ф., Прислегина Д.А., Манин Е.А., Цапко Н.В., Ашибоков У.М., Малецкая О.В., Куличенко А.Н.
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, Ставрополь, Россия
ЭПИЗООТИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ НА ТЕРРИТОРИИ СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ
Проведен анализ эпизоотических проявлений геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) в Ставропольском крае в современный период (2016-2020 гг.). Установлено, что основным природным резервуаром ортохантавирусов на территории края является обыкновенная полёвка Microtus аrvalis. Маркеры ортохантавирусов выявлены в районах, расположенных в степной, лесостепной и предгорной ландшафтно-географических зонах края. Впервые на территории Ставропольского края выявлена циркуляция ортохантавиру-са «Тула».
Ключевые слова геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, ортохантавирус, природный резервуар, Ставропольский край.
Vasilenko N.F., Prislegina D.A., Manin E.A., Tsapko N.V., Ashibokov U.M., Maletskaya O.V., Kulichenko A.N.
Federal Government Health Institution Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor, Stavropol, Russian Federation
EPIZOOTIC MANIFESTATIONS OF HEMORRHAGIC FEVER WITH RENAL SYNDROME ON THE TERRITORY OF THE STAVROPOL TERRITORY
The analysis of epizootic manifestations of hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in the Stavropol Territory in the modern period (2016-2020) was carried out. It was found that the main natural reservoir of orthochantavirus-es in the territory of the region is the common vole Microtus arvalis. Markers of orthohantaviruses were detected in areas
© Василенко Н.Ф., Прислегина Д.А., Манин Е.А., Цапко Н.В., Ашибоков У.М., Малецкая О.В., Куличенко А.Н., 2021
