CC BY
39
хотя и превышали критический уровень, был ниже, чем в КГ, и составил 106 микробных тел в 1 мл отделяемого. Параллельно уменьшению бактериальной флоры была тенденция к повышению уровня чувствительности микрофлоры к ампициллину с 65,5% до 69,0% (р=0,77) и канамицину с 80,7% до 83,3% (р=0,84).
На 5 сут. лечения в КГ традиционная терапия не вызывала явного снижения микробной обсемененности (106 микробных тел в 1 мл отделяемого). Чувствительность микробов к антибиотикам в ряде случаев снизилась. В ОГ микробное число упало до 104 и шел рост чувствительности микрофлоры раны к антибиотикам.
Действие озономагнитофореза на микрофлору ран наиболее отчетливо проявлялось к 7 сут. лечения. Если в КГ уровень микробной обсемененности составлял 105 микробных тел, то в ОГ к этому сроку количество микроорганизмов в 1 мл раневого отделяемого составило 102 микробных тел. У лиц КГ, по сравнению с предыдущими сроками исследований, продолжалось снижение уровня чувствительности микробов к антибиотикам по всем штаммам. У лиц ОГ к этому сроку было максимально возможное повышение чувствительности микрофлоры к антибиотикам.
К 10 суткам в КГ наблюдалось уменьшение бактериальной обсемененности раны ниже критического уровня - 103 микробных тел в 1 мл отделяемого. Уровень чувствительности микрофлоры продолжал снижаться. В ОГ к этому сроку эффект воздействия озономагнитофореза на чувствительность микрофлоры к антибиотикам исчерпался и имелось снижение этого показателя. Большое значение в спаде чувствительности микробов к антибиотикам играет присоединение к микробному пейзажу гнойной раны «госпитальной инфекции». Через 10 сут. гистологически у лиц КГ сохраняется гнойный процесс по типу флегмонозного, с очагами формирования свежих абсцессов, и лишь в периферической зоне отмечается смена фазы экссудации на пролиферацию и явления организации. В биоптатах большинства больных ОГ шло снижение интенсивности гнойно-экссудативного процесса и превалирование продуктивной реакции.
Выводы. Местная озонотерапия гнойной раны на фоне низкочастотных магнитных полей имеет более выраженный бактерицидный эффект, способствует росту чувствительности микрофлоры к антибиотикам. Гистоморфологически при этом наблюдается динамика отторжения гнойно-некротических тканей с раневой поверхности, затихание экссудативной фазы воспаления с формированием грануляционной ткани в относительно ранние сроки и последующее ее ускоренное созревание и репарация.
Литература
1. Васильев И.Т. и др. // Вестн. хир.- 1995.- № 3.- С.73-74.
2. Васина Т.А. и др. // Тез. докл. 2-й Всерос. научно-практ. конф. «Озон в биологии и медицине».- Н. Новгород,1995.- С. 32.
3. Гречко Б.Н. // Тез. докл. 3-й Всерос. научно-практ. конф. «Озон и методы эфферентной терапии в медицине».- Н. Новгород, 1998.- С. 74-75.
4. Каменев Ю. Ф. и др. // МИС РТ.- 1999.- № 7.- С. 53-56.
5. Родоман Г.В., и др.// РМЖ.- 1999.- № 4.- С. 32-36.
6. Хмелевская И., Ковальчук Л.// Иммунол.-2000. №4.- С.42.
УДК 616-001; 615.33
ОЦЕНКА ХЕМОКИНЕТИКОТРОПНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ В НОРМЕ И ПРИ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ОСЛОЖНЕНИЯХ ТРАВМАТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ У ДЕТЕЙ
О.Н. ЗЛАКОМАНОВА*
Представлены результаты исследований локомоторной функции нейтрофилов периферической крови в норме и при травматической болезни у детей в проекции стадию процесса и возникновение осложнений. Показано развитие хемотаксической дисфункции нейтрофилов, как к регуляторам воспаления, так и к бактериям наиболее часто вызывающим хирургическую инфекцию.
Антибиотики принадлежат к числу наиболее применяемых лечебных препаратов. Их производство в мире растет, расширяется номенклатура противомикробных лекарственных средств. Более 20% назначаемых среднестатистическому больному ле-
карств относят к антимикробным препаратам. Если речь идет о больных с инфекционной патологией, то эта величина в зависимости от тяжести процесса возрастает в 2-4 раза. Интенсивное применение антибиотиков способствует росту числа негативных факторов, подавляющих функции иммунной системы и устойчивости возбудителей инфекционных заболеваний к антибиотикам, что снижает результативность применения средств этиотропной терапии инфекций [1, 2, 7, 9, 10, 11]. В то же время включение в схемы комплексной терапии иммуномодуляторов повышает эффективность лечебно-профилактических мероприятий. В связи с этим, изучение действия химиотерапевтических препаратов вообще и, антибиотиков в частности, на иммунную систему представляются особенно важным. Одним из показателей влияния антибиотиков на процесс взаимодействия клеток иммунной системы с микроорганизмами являются хемотаксис, адгезия, фагоцитоз и внутриклеточный киллинг возбудителей. Антибиотики модулируют активность клеток иммунной системы 2 способами: воздействуя на микроорганизмы либо на фагоциты [8].
Цель работы - изучение влияния антибактериальных препаратов на хемотаксическую функцию нейтрофилов периферической крови здоровых детей и лиц с травматической болезнью.
Материалы и методы. Исследования проведены in vitro на нейтрофилах периферической крови 41 клинически здорового ребенка и 235 детей в различные периоды травматической болезни (острый период (ОП), катаболическую фазу (КФ) и анаболическую фазу (АФ) периода развернутой клинической картины болезни), из них 27 лиц с осложненным течением травматической болезни. Нейтрофилы периферической крови получали способом, разработанным Wong L., Wilson R.D. (1975). С этой целью у пациентов забирали 10 мл венозной крови в стерильную силикони-зированную пробирку с 10-15 ЕД гепарина фирмы «Гедеон -Рихтер» (Венгрия), разведенного в 1 мл физраствора. Эритроциты осаждали путем отстаивания при 37°С в течение 30 мин после перемешивания крови с 6% раствором декстрана Т-500 («Pharmacia», Швеция) в соотношении 10:1. Далее плазму с лейкоцитами наслаивали на двойной градиент плотности фикола («Phar-macia», Швеция) и верографина («Spofa», Чехия) и центрифугировали 40 мин при 4°С и 1500 об/мин. Плотность верхнего слоя градиента составляла 1,073-1,075, а нижнего - 1,093-1,095.
Объем каждого слоя градиента соответствовал 1,5 мл. По окончании центрифугирования на границе между плазмой и верхним слоем градиента образовывалось клеточное кольцо, состоящее из мононуклеаров (лимфоцитов и моноцитов). Между двумя слоями градиентов локализовался слой гранулоцитов, содержащий 98-100% нейтрофилов. Клетки аккуратно собирали, помещали в силиконизированные пробирки и 3-кратно отмывали раствором Хенкса путем центрифугирования в течение 10 мин при 3000 об/мин. Морфологический контроль клеточных взвесей показал, что фракция полиморфноядерных клеток содержала 98100% нейтрофилов и не нуждалась в дальнейшей очистке.
Хемотаксис нейтрофилов исследовали под агарозой по методу R.D. Nelson et al. (1975). Клеточную взвесь, полученную вышеописанным способом, доводили до концентрации 5 х 108 клеток/мл и делили на 12 равных частей, которые размещали в лунках агарозного геля в объеме 0,02 мл.. Четыре части клеток использовались для исследования хемотаксической функции нейтрофилов к небактериальным хемоаттрактантам, четыре части
- для оценки хемотаксиса нейтрофилов к бактериям и четыре последних части - для исследования хемотаксиса клеток к антибактериальным препаратам. В качестве бактериальных хемоат-трактантов нами были использованы живые суточные культуры Staphylococcus aureus (штамм 209), Escherichia coli, Proteus vulgaris и Pseudomonas aeruginosa. Небактериальные хемоаттрактан-ты: С5а-компонент комплемента сыворотки, активированной зимозаном и препараты рекомбинантных цитокинов - известных регуляторов иммунного воспаления: ИЛ-1 (НИИ ОЧБ, Санкт-Петербург), ИЛ-8 (НИИ Биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова), естественный цитокиновый комплекс (лейкинферон) (НИИ им. Н.Ф. Гамалея). Лекарственные хемоаттрактанты - амоксиклав, гентамицин, линкомицин, цефо-таксим. Концентрации препаратов были определены, исходя из рекомендуемых лечебных доз для детей и с учетом числа ней-трофилов (амоксиклав - 0,1 мг/мл, гентамицин - 0,05 мг/мл, лин-комицин - 0,07 мг/мл, цефотаксим - 0,3 мг/мл). После внесения всех компонентов в лунки чашки Петри помещали в эксикатор с
* Челябинская ГМА 454092 г. Челябинск, ул. Воровского, 64.
полного химического синтеза) и имеющие с антибиотиками общность механизмов и типов воздействия на микробную клетку.
Таблица 4
Индекс хемотаксиса нейтрофилов периферической крови здоровых детей (п=41) к бактериям и небактериальным хемоаттрактантам под действием антибактериальных препаратов
Индекс хемотаксиса Нф без АБП (контроль), усл. ед., Индекс хемотаксиса нейтрофилов под действием АБП, усл. ед.
Амоксиклав Гентамицин Линкомицин Цефотаксим
С5а-комп. ком-та 2,19±0,1 1,754±0,05* 1,927±0,1 2,165±0,14 1,825±0,09*
ИЛ-1 2,32±0,11 1,429±0,05* 1,569±0,12* 1,639±0,09* 1,713±0,14*
ИЛ-8 1,92±0,08 1,390±0,06* 1,444±0,07* 1,540±0,09* 1,471±0,1*
Лейкинферон 2,13±0,09 1,529±0,11* 1,665±0,1* 1,768±0,11* 1,761±0,13*
St. aureus 1,971±0,01 1,700±0,08* 1,439±0,12* 1,413±0,1* 1,438±0,09*
E. coli 1,356±0,03 1,591±0,04* 1,703±0,02* 1,487±0,03* 1,916±0,1*
Pr. vulgaris 1,590±0,001 1,305±0,13* 1,285±0,1* 1,418±0,1 1,277±0,08*
Ps. aeruginosa 1,430±0,031 1,281±0,02* 1,330±0,02* 1,219±0,01* 1,403±0,01
Примечание: *— достоверные различия с контролем при уровне значимости р<0,05.
5% содержанием СО2 до появления оранжевой окраски агарозного геля и инкубировали в термостате при 37°С нейтрофилы в течение 3 и 18 часов - моноциты. После инкубации для фиксации клеток к покровному стеклу чашки заливали 2,5% глутарового альдегида или 47% р-ром формалина на 30 мин, слой агарозного геля удаляли, стекло промывали проточной водой. Ср. длительность реакции равна 4-5 часов.
Учет результатов вели под микроскопом (увеличение 56) с помощью окулярного микрометра. Для этого измеряли величину двух зон миграции клеток: в сторону хемоаттрак-танта (А) и в сторону среды 199 (В). Индекс хемотаксиса (ИХ) определяли как отношение величины А к величине В: ИХ=А/В. Если индекс хемотаксиса составлял менее 1 усл. ед., то такой хемотаксис определяли как отрицательный, если он превышал данный показатель, то трактовался как положительный. Результаты исследований обрабатывали на ПК с использованием пакета прикладных программ «ЗіаІЇБ-Ііса 6.0». Статистическую обработку результатов вели стандартно, с определением средней арифметической вариационного ряда (М), среднего квадратичного отклонения (а) и ошибки средней арифметической (т). О достоверности различий средних величин судили по 1-критерию Стьюден-та с использованием таблиц граничных значений по Вебер.
Результаты. Почти все исследуемые небактериальные хемоаттрактанты - известные регуляторы иммунного воспаления обладали выраженной хемотаксической активностью по отношению к нейтрофилам периферической крови здоровых детей. При этом максимальный хемотаксис ПМЯЛ (полиморфноядерных лейкоцитов) вызывал ИЛ-1 (табл. 1).
Таблица 1
Индекс хемотаксиса нейтрофилов периферической крови здоровых детей (п=41) к биологически активным веществам различной природы
Хемоаттрактанты
Среда 199 (контроль) С5а-компонент комплемента ИЛ-1 ИЛ-8 Лейкинферон
0,914±0,017 2,19±0,1* 2,32±0,11* 1,92±0,08* 2,13±0,09*
Здесь и далее: * — достоверные различия с контролем при р<0,001
Антибиотики (табл. 2) инициировали положительную хе-мотаксическую реакцию нейтрофилов периферической крови здоровых детей, которая совпадала с таковой к живым суточным культурам бактерий, наиболее часто вызывающих хирургическую инфекции по направленности и по амплитуде (табл. 3).
Таблица 2
Индекс хемотаксиса нейтрофилов периферической крови здоровых детей (п=41) к антибактериальным препаратам
Хемоаттрактанты
Среда 199 (контроль) Амоксиклав Гентамицин Линкомицин Цефотаксим
0,914±0,017 1,564±0,1* 1,402±0,05* 1,555±0,09* 1,524±0,07*
Таблица 3
Индекс хемотаксиса нейтрофилов периферической крови здоровых детей (п=41) к живым суточным культурам бактерий
Хемоаттрактанты
Среда 199 (контроль) Staphylococcus aureus Escherichia coli Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa
0,914±0,017 1,971±0,01* 1,356±0,031* 1,590±0,038* 1,430±0,031*
Феноменологическое сходство целенаправленной двигательной активности нейтрофилов к бактериям и антибактериальным препаратам, как по направленности, так и по амплитуде, на наш взгляд, вполне закономерно. Оно может быть объяснено происхождением антибиотиков и антибактериальных препаратов. Антибиотики - специфические продукты жизнедеятельности микроорганизмов (конечные продукты метаболизма), накапливающиеся внутри клетки и выделяющиеся в окружающую среду и обладающие высокой физиологической активностью в отношении к ряду микроорганизмов. Антибактериальные препараты получают в ходе промышленного производства (биосинтеза, химической трансформации молекулы природного антибиотика,
Являясь продуктами жизнедеятельности микроорганизмов, , дериватами микробов, или их синтетическими аналогами, АБ и АБП реализуют свое кинетикотропное действие через те же рецепторные структуры и механизмы, что и сами бактерии. Далее изучили - как влияют антибактериальные препараты на двигательную активность нейтрофилов при контакте, что имеет значение для эффективной элиминации патогена?
С этой целью нами изучена целенаправленная двигательная активность нейтрофилов периферической крови здоровых детей к бактериям и небактериальным хемоаттрактантам под действием антибактериальных препаратов - амоксиклава, гентамицина, линкомицина и цефотаксима. Концентрации препаратов были рассчитаны, исходя из среднетерапевтических дозировок для детского возраста, и составили для амоксиклава, гентамицина, линкомицина и цефотаксима - 0,15 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл и
0,5 мг/мл соответственно. После часовой инкубации цельной крови с АБП при 37°С, нейтрофилы периферической крови выделены описанным выше способом и использованы для хемотакси-ческого теста. Антибактериальные препараты при непосредственном контакте явно изменяли хемотаксический ответ нейтро-филов периферической крови здоровых детей, как на бактерии, так и на небактериальные хемоаттрактанты (табл. 4).
Все тестируемые АБП достоверно угнетали целенаправленную двигательную активность нейтрофилов здоровых детей к ИЛ-1, ИЛ-8 и лейкинферону. При этом максимальное снижение хемотаксической реакции нейтрофилов к исследуемым модуляторам миграционной функции зарегистрировано под действием амоксиклава (к лейкинферону - с 2,13 до 1,529 усл. ед.; к ИЛ-1 -с 2,32 до 1,429 усл. ед.; к ИЛ-8 - с 1,92 до 1,39 усл. ед.). Динамика изменения хемотаксиса нейтрофилов к С5а-компоненту комплемента под действием амоксиклава и линкомицина имела ту же направленность, что и к другим небактериальным хемоаттрактан-там, только с меньшей амплитудой, при этом более выраженное угнетение локомоторной реакции нейтрофилов к С5а-компоненту комплемента вызывал также амоксиклав (с 2,19±0,1 до 1,754 усл. ед.). Гентамицин и линкомицин не вызывали достоверных изменений хемотаксической реакции нейтрофилов к С5а. Хемотаксический ответ нейтрофилов периферической крови здоровых детей на бактерии под влиянием антибиотиков отличался разнонаправ-ленностью. АБП вызывали угнетение хемотаксиса Нф к взвеси суточных культур стафилококка, протея и синегнойной палочки, при этом линкомицин максимально тормозил хемотаксис к стафилококку и синегнойной палочке, а цефотаксим - к протею. Оппозитной оказалась динамика влияния антибактериальных препаратов на хемотаксический ответ Нф к взвеси суточной культуры Escherichia coli. В отличие от грамположительных и др. грамотрицательных бактерий, двигательная активность к ней нейтрофилов под действием антибиотиков росла. Достоверно более высокий уровень хемотаксической реакции к Escherichia. coli инициировал цефотаксим (1,916 против 1,356 усл. ед.).
Антибиотики инициируют положительную хемотаксиче-скую реакцию нейтрофилов периферической крови здоровых
детей, которая совпадает с таковой к живым суточным культурам бактерий, являющихся, как правило, возбудителями хирургической инфекции. При контакте с нейтрофилами периферической крови здоровых детей антибактериальные препараты оказывают блокирующее действие на целенаправленную двигательную активность данных клеток. Подобный феномен антибактериальных препаратов, по нашему мнению, связан с тем, что, антибиотики конкурируют с бактериями и другими хемоаттрактантами за общие рецепторы нейтрофилов, количество которых на покоящихся клетках невелико, вызывая тем самым рецепторную блокаду и ослабление хемотаксической реакции Нф. Кроме того, стафилококк может использовать рецепторы для компонентов комплемента, а ряде бактерий и вирусов - рецепторы для а2-макроглобилина в качестве доступа к внутриклеточному существованию [5]. Еще одной причиной угнетения локомоторной реакции нейтрофилов при инкубации с антибактериальными препаратами является способность последних индуцировать продукцию цитокинов клетками периферической крови, что при травматической болезни потенцирует «кондиционирование» нейтрофилов и создает основу для усиления деструктивных процессов.
При применении антибиотиков спад хемотаксической активности нейтрофилов к стафилококку, протею и синегнойной палочке может являться одной из причин персистенции микроорганизмов во внутренней среде организма и формированию у них устойчивости к действию средств этиотропной терапии. Стимуляция хемотаксиса к кишечной палочке может вести к элиминации нормальной микрофлоры и способствовать развитию дисбактериоза, что также снижает эффективность этиотропной терапии.
Далее предстояло выяснить, как изменяется локомоторная активность нейтрофилов периферической крови детей с неосложненной механической травмой скелета и пациентов, в течение травматической болезни которых, развились гнойновоспалительные осложнения, по поводу чего они получавших антибактериальные препараты. В процессе развития травматической болезни происходит угнетение целенаправленного движения фагоцитов к стандартному хемоаттрактанту (С5а-компоненту комплемента) и к изучаемым биомодуляторам (табл. 5). При этом развивается мобилизационная блокада этих клеток, которая носит системный характер, не связанный с локализацией очага воспаления, что обусловлено изменением состояния рецепторного аппарата нейтрофилов, развивающимся после тканевого повреждения. Угнетение целенаправленной миграции к изучаемым биомодуляторам инициировано спадом числа функционирующих (имеющих высокое сродство к цитокину) мембранных рецепторов. Максимальное снижение активности медиаторов - в острый период травматической болезни. По мере купирования асептического воспаления отмечалась тенденция к регрессу двигательных дисфункций этих клеток.
Таблица 5
Хемотаксис нейтрофилов периферической крови детей с неосложненной механической травмой к биологически активным веществам различной природы
Вещества Здоровые дети (контроль) (n=41) Индекс хемотаксиса нейтрофилов, усл. ед.
Острый период (n=108) Катаболи-ческая фаза (n=103) Анаболическая фаза (n=85)
С5а 2,19±0,10 1,42±0,01* 1,57±0,004* 1,80±0,02*
ИЛ-1 2,32±0,11 1,69±0,02* 1,65±0,004* 1,86±0,02*
ИЛ-8 1,92±0,08 1,34±0,01* 1,64±0,005* 1,64±0,01*
Лейкинферон 2,13±0,09 1,24±0,006* 1,36±0,01* 1,60±0,003*
Примечание: Здесь и далее * - достоверные различия с контролем при уровне значимости р<0,001
Исследование хемотаксиса нейтрофилов больных детей с травмой к различным видам живых суточных бактериальных культур (табл. 6), показало, что эти клетки реагировали на бактерии также, как и клетки здоровых детей - положительным хемо-таксическим ответом, уровень которого был достоверно выше 1 усл. ед. Максимальная хемотаксическая активность была отмечена к 209 штамму золотистого стафилококка (1,856±0,017 усл. ед.), что совпадало с результатами, полученными у здоровых детей.
Таблица 6
Индекс хемотаксиса нейтрофилов периферической крови пациентов с травматической болезнью (п=108) к живым суточным культурам бактерий
Хемоаттрактанты
Среда 199 (контроль) Staphylococcus aureus Escherichia coli Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa
0,914±0,017 1,856±0,02* 1,362±0,012* 1,425±0,001* 1,550±0,013*
Для изучения значения локомоторных дисфункции нейтро-филов у детей с травматической болезнью в развитии инфекционных осложнений нами были обследованы 27 детей, у которых в посттравматическом периоде развились гнойно-воспалительные осложнения. У всех пациентов проводилось бактериологическое исследование раневого отделяемого. Микрофлора была выделена у больных в 40,7% случаев. Чаще определялась монокультура (81,9%), представленная в 63,64% наблюдений золотистым стафилококком и в 18,18% - кишечной палочкой. У 18,18% больных была выявлена микст-инфекция в виде ассоциации стафилококка и синегнойной палочки (табл. 7).
Таблица 7
Вид микрофлоры, выделенной из раны у детей с гнойновоспалительными осложнениями травматической болезни
Характеристика микрофлоры Количество больных
Абсолютное число %
Микрофлора не выделилась 16 59,3
Микрофлора выделилась 11 40,7
Монокультура 9 81,9
Грамположительные бактерии:
- стафилококк 7 63,64
Грамотрицательные бактерии:
- синегнойная палочка - -
- протей - -
- кишечная палочка 2 18,18
Миксты: - стафилококк и синегнойная палочка 2 18,18
При развитии гнойных осложнений травматической болезни регистрировалось еще более выраженное угнетение целенаправленной миграции нейтрофилов к модуляторам миграционной функции уже в остром периоде болезни (рис. 1).
□ Норма йБез осложнеий ОС осложнениями
Рис. Хемотаксис нейтрофилов к регуляторам иммунного воспаления в остром периоде при неосложненной (п=108) и осложненной травме (п=27) и у здоровых детей (п=41).
Таблица 8
Хемотаксическая реакция нейтрофилов у пациентов с осложненным течением травматической болезни к живым суточным культурам бактерий
Индекс хемотаксиса нейтрофилов к живым суточным культурам бактерий, усл. ед.
St. aureus E. coli Pr. vulgaris Ps. aeruginosa
0,78±0,02 * # то 1,24±0,01 1,55±0,08 1,29±0,02
2,00±0,001 0,62±0,001 * # то 1,00±0,001 1,75±0,001
1,56±0,10 1,32±0,03 0,83±0,03 * # то 1,68±0,04
1,77±0,01 1,79±0,05 1,83±0,08 0,76±0,02 * # то
0,86±0,01 # то 0,93±0,03 # то 1,59±0,01 1,69±0,01
0,79±0,10 * то 1,63±0,10 0,90±0,05 # то 1,60±0,05
1,00±0,05 * # 1,35±0,04 1,90±0,07 0,96±0,04 # то
1,51±0,06 0,94±0,04 * # то 0,80±0,05 * то 1,76±0,08
Примечание: *, #, да — достоверность различия средних исследуемых показателей при последовательном сравнении, при уровне значимости р<0,05
Данные, полученные при изучении хемотаксиса нейтрофи-лов больных с различными видами хирургической инфекции к живым суточным культурам возбудителей, приведены в табл. 8.
У 17 (62,97%) пациентов хемотаксическая деактивация ней-трофилов выявлялась только по отношению к одному из четырех возбудителей, в частности, к золотистому стафилококку - у 9
(52,94%), к протею - у 5 (29,4%), к синегнойной палочке - у 2 (11,76%) детей и к кишечной палочке - у 1 (5,96%) пациента. На фоне развития хемотаксической деактивации к конкретному микроорганизму нейтрофилы сохраняли способность целенаправленно двигаться к бактериям другого вида. У остальных 10 (37,04%) детей хемотаксическая деактивация нейтрофилов отмечалась одновременно к двум микроорганизмам, при сохранении положительного хемотаксиса к двум другим видам бактерий.
Полученные данные выявили неоднозначность изменения уровня хемотаксической реакции к живым суточным культурам возбудителей инфекции при развитии гнойно-воспалительного процесса у детей. Возникла необходимость сопоставления результатов проведенного исследования с данными бактериологического тестирования, которое позволило идентифицировать возбудителя только у 40,7% обследованных детей (табл. 8).
Результаты сопоставления приведены в табл. 9. У всех 9 детей с хемотаксической деактивацией нейтрофилов к золотистому стафилококку был высеян из раневого гнойного отделяемого данный вид микроорганизма. Аналогичное совпадение результатов исследования хемотаксиса к живым суточным культурам бактерий и результатов бактериологического анализа наблюдалось и у детей с ассоциацией возбудителей. В группе пациентов, у которых микрофлора не высевалась, хемотаксическая деактивация развилась только по отношению к грамотрицательной флоре, которая, по мнению ряда авторов [3, 6], реже определяется бактериологическим методом (табл. 9). При этом у 5 из них индекс хемотаксиса достоверно снижался к синегнойной палочке, а у 4 пациентов - к протею. У остальных имелась отрицательная хемотаксическая реакция на ассоциации бактерий, из которых чаще встречалось сочетание кишечной палочки и протея (43%) и реже - комбинация стафилококка с грамотрицательной флорой.
Таблица 9
Вид микрофлоры, выявленной при изучении хемотаксиса нейтрофи-лов к живым суточным культурам бактерий, у детей с положительными результатами бактериологических исследований
Характеристика микрофлоры Абсолютное количество и% с неидентифицированной микрофлорой (16)
Монокультура 9 (81,8%)
Грамположительные бактерии:
- стафилококк 7 (77,8%)
Грамотрицательные бактерии:
- синегнойная палочка -
- протей -
- кишечная палочка 2 (22,2%)
Миксты: 2 (18,2%)
- стафилококк и синегнойная палочка 2 (100%)
- стафилококк и протей -
- стафилококк и кишечная палочка -
- кишечная палочка и протеи -
Таблица 10
Вид микрофлоры, выявленной при изучении хемотаксиса ней-трофилов к живым суточным культурам бактерий, у детей с отрицательными результатами бактериологических исследований
Характеристика микрофлоры Абсолютное количество и% с неидентифицированной микрофлорой (16)
Монокультура 9 (56,25%)
Грамположительные бактерии:
- стафилококк -
Грамотрицательные бактерии:
- синегнойная палочка 5 (55,6%)
- протей 4 (44,4%)
- кишечная палочка -
Миксты: 7 (43,75)
- стафилококк и синегнойная палочка 1 (14,29%)
- стафилококк и протей 2 (28,57%)
- стафилококк и кишечная палочка 1 (14,29%)
- кишечная палочка и протей 3 (42,85%)
Подводя краткий итог, можно сделать вывод о том, что при развитии у пациентов с механической травмой гнойного осложнения их нейтрофилы, контактируя с возбудителем in vivo, лишаются способности целенаправленно двигаться in vitro только к этому виду бактерий, что свидетельствует о формировании специфической хемотаксической «толерантности».
Общая тенденция к снижению двигательных ресурсов фагоцитов на фоне дестабилизации гомеостаза позволяет сделать предположение, что этот феномен связан не только со снижением рецепторной чувствительности к регуляторам воспаления, но и с нарушением механизмов, обеспечивающих выход нейтрофилов и моноцитов в эктравазальное пространство, таких как, избыточная продукция цитокинов, в частности, хемокинов, которая инициирует функциональную перестройку нейтрофилов или эпителио-цитов, приводя к блокаде направленной миграции клеток в очаг повреждения [12, 13, 14, 17]. Несвоевременная миграция фагоцитов в очаг тканевой деструкции не позволяет этим клеткам реализовать элиминационный потенциал, что может стать причиной гнойного процесса и участвовать в процессах репаративной регенерации костной ткани, приближая ее к исходной архитектонике.
Далее нами была изучена целенаправленная двигательная активность нейтрофилов периферической крови детей, получавших антибактериальные препараты по поводу развившихся гнойно-воспалительных осложнений механической травмы. Учитывая, что бактериологическая идентификация вида возбудителя гнойно-воспалительного процесса и определение его чувствительности к антибиотикам традиционными методами процесс длительный и не всегда эффективный [1, 8, 9], по нашим данным
- 40,7%, то антибактериальные препараты пациентам назначали, как правило, эмпирически. Для лечения лиц с инфекционными осложнениями были использованы: гентамицин, линкомицин, ципрофлоксацим, цефазолин, цефамизин, оксациллин, амикоцин.
Схема исследования хемотаксиса была аналогичной ранее применявшейся. Исследования были проведены в двух группах: 1) пациенты с гнойно-воспалительными осложнениями травмы (27 человек), 2) здоровые дети (41 ребенок). В первую группу мы объединили всех пациентов с гнойно-воспалительными осложнениями травматической болезни, по поводу которых они получали этиотропную терапию, вне зависимости от конкретного антибактериального препарата. Мы сочли это вполне корректным, так как применяемые для лечения данных пациентов этиотропные средства (гентамицин, линкомицин, ципрофлоксацим, цефазолин, цефамизин, оксациллин, амикоцин) имеют много общего, а именно: пенициллины и цефалоспорины структурно объединяет наличие 4-х членного бета-лактамного кольца; все АБП, назначенные пациентам, являются препаратами широкого спектра действия и во многом схожего между собой и имеют общие механизмы антимикробного действия (аминогликозиды и линком-самиды подавляют синтез белка, а пенициллины и цефалоспори-ны угнетают синтез микробной стенки) [1, 10].
Исследования показали, что применение антибактериальных препаратов усугубляет развивающиеся после механического повреждения нарушения локомоторной функции нейтрофилов. Нами зарегистрировано достоверное снижение хемотаксической реакции к С5а, ИЛ-1, ИЛ-8 и лейкинферону, а также к живым суточным культурам стафилококка, протей и синегнойной палочки. Динамика уровня хемотаксиса нейтрофилов к кишечной палочке характеризовалась лишь тенденцией к росту (табл. 11).
Таблица 11
Хемотаксис нейтрофилов периферической крови здоровых детей и пациентов с осложненным течением травматической болезни, получавших антибактериальные препараты
Хемоаттрак- Здоровые дети, Индекс хемотаксиса нейтрофилов пациентов с осложненной травмой, усл.ед.
танты (n=41) До приема АБП (контроль), (n=27) После приема АБП, (n=27)
С5а-компонент комплемента 2,19±0,1 1,25±0,03* 1,12±0,001* #
ИЛ-1 2,32±0,11 1,68±0,01* 1,21±0,05* #
ИЛ-8 1,92±0,08 1,34±0,004* 1,08±0,01* #
Лейкинферон 2,13±0,09 1,51±0,005* 1,17±0,001* #
Staphylococcus aureus 1,971±0,017 1,856±0,09 1,283±0,001*#
Escherichia coli 1,356±0,031 1,425±0,02 1,466±0,04
Proteus vulgaris 1,590±0,038 1,425±0,005* 1,30±0,001* #
Pseudomonas aeruginosa 1,430±0,031 1,555±0,07 1,236±0,001* #
Примечание: * — достоверные различия с нормой при уровне значимости р<0,001, # — достоверные различия с контролем при уровне значимости р<0,001
Антимикробный эффект антибиотиков преломляется через систему фагоцитов. Универсальный эффектор гомеостаза и инструмент его управления фагоциты в условиях инфекционного воспаления при травме являются мишенью для этиотропных воздействий антибактериальных препаратов. Однако, как показали наши исследования, эти воздействия не всегда благоприятные.
Полученные данные согласуются с современными представлениями о том, что фармакологическое подавление инфекционного начала, создавая перевес над патогеном, повышает устойчивость организма к инфекции. Однако окончательный итог определяет состояние эффекторного звена, т. е. тех факторов, которые участвуют в элиминации патогена. Необходимость коррекции двигательных нарушений фагоцитов при травматической болезни, несмотря на приоритетность этиотропной терапии, становится очевидной с лечебной и с профилактической целью.
Литература
1. Антибактериальная терапия / Практическое руководство под ред. Л.С. Страчунского и жр..- М., 2000.- 191 с.
2. Белобородов В.Б., Митрохин С. Д. // Инфекции и антимикробная терапия.- 2003.- Т. 5, №1.- С. 12-18.
3. Белокуров Ю.Н и др. Сепсис.- Киев, 1983.- 128
с.
4. Заславская М.И. Маянский А.Н. // Цитокины и воспаление.- 2006.- Т. 5, № 1.- С. 50-52.
5. Зорин Н. и др. // Клин. лаб. диагн.- 2004.- №
11 - С. 18.
6. Исхакова Х.И. и др. // Ж. микробиол., эпиде-миол.и и иммунол.- 1983.- № 4.- С. 45-50.
7. Коленчукова О .А., Савченко А.А. // Антибиотики и химиотерапия.- 2005.- Т. 50, № 4.- С. 3-6.
8. Никитин А.В. // Антибиотики и химиотерапия.- 1990.- Т. 35, № 8.- С. 45-48.
9. Савицкая К.И. и др. // Антибиотики и
химиотерапия.- 1993.- Т. 38, № 12.- С. 29-33.
10. Стандарты антибактериальной терапии: Спр-к: Пер. с англ. / вОз.- М.: Мед. лит., 2005.- 288 с.
11. Хмелевская И., Ковальчук Л.И Иммунол.-2000.- № 4.- С.42-47.
12. Camus si G. et al. 11 Clin. Immunol. Immunopaph.-1990.- Vol. 57.- P. 333-338.
13. Coenjaerts F. et al. // J Immunol.- 2001.- № 7.-P. 3988-3998.
14. Cuschieri J. et al. // Trauma.- 2003.- 1.- P. 104.
15. Nelson R.et al.//Immunol.- 1975.- № 6.- P. 1650.
16. Wong L.,Wilson R //Immunol Meth.- 1975.-Vol. 7.- P. 69.
17. Xythalis D. et al. // Inflammation.- 2002.- № 2.-P. 83-96.
УДК 617.54-001-005.1-08-089
СОСТОЯНИЕ СИСТЕМНОГО ГЕМОСТАЗА У БОЛЬНЫХ СО СКЕЛЕТНОЙ ТРАВМОЙ В ДИНАМИКЕ ЛЕЧЕНИЯ
А.Г. КАРПЕНКО, Н.Г. КОЛОСОВ, Е.М. ЛОКТИН, С.К. ПОЗДНЯКОВА, С.А.ФИРСОВ, Л. А. ШПАГИНА *
У больных с переломами длинных трубчатых костей в остром и послеоперационном периоде лечения отмечается активация коагуляционного потенциала системы гемостаза, изменения плазменнокоагуляционного гемостаза и фибринолиза, истощение антикоагу-ляционного резерва.
Одним из наиболее частых компонентов при множественных и сочетанных повреждениях являются переломы. Повреждения конечностей у данной категории пострадавших наблюдается в 86%, таза в 28%, позвоночника в 19% [1, 2].
Актуальной проблемой травматологии является нарушение репаративного остеогенеза при повреждениях костей скелета. Длительность сроков консолидации переломов определяется степенью нарушений микроциркуляции в зоне перелома, изменениями клеточного и коагуляционного гемостаза и минерального
* НГМУ, кафедра травматологии ортопедии и медицины катастроф, ГКБ №
2, город Новосибирск, ул. Ползунова 21
обмена. В связи с чем повышение эффективности лечения переломов трубчатых костей на основе ранней диагностики сосудистых и гемостазиологических изменений, имеет большое значение для практического здравоохранения [3-4, 6-8].
Цель работы — изучение системы гемостаза у лиц с повреждениями трубчатых костей опорно-двигательного аппарата, в условиях острой травмы, в ближайший после операции период.
Материалы и методы. В исследование включены больные, лечившиеся в травматологическом отделении с преимущественным повреждением трубчатых костей конечностей. Исследование проведено у 56 пациентов мужского пола от 18,1 до 50,2 лет, средний возраст составил 34 года. Критерии включения - наличие перелома костей конечностей. Критерии исключения: тяжёлые анемии, атеросклеротическое и диабетическое поражение сосудов, хронические воспалительные заболевания в стадии обострения. По локализации переломов больные разделились на 2 группы. 1 группа - 21 чел. с переломами верхних конечностей (ПВК), 2 - 35 чел. с переломами нижних конечностей (ПНК). Группу контроля составили 20 человек, практически здоровых мужчин без травматических повреждений.
Таблица 1
Для исследования системы гемостаза венозную кровь получали из локтевой вены широкой иглой в пластиковые пробирки в соответствии с рекомендациями руководства З.С. Баркагана и А. П. Момота (2001). Кровь немедленно смешивали с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Для исследования функции тромбоцитов получали богатую тромбоцитами плазму для чего кровь центрифугировали при 1000 об/мин (140-160g) в течение 7 минут. Центрифугировали при 3000-4000 об/мин (12001400 g) в течение 15 мин при температуре +18...+25°С. Богатую и бедную тромбоцитами плазму (БТП) использовали при исследованиях в течение первых 2 часов.
При оценке системы гемостаза определяли общие параметры с использованием наборов и реагентов фирмы «Технология-стандарт» (Барнаул), НПО «Ренам» (Москва): активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ) - по Caen et al. (1968); тромбиновое время (ТВ) - по Biggs, Macfarlane (1962); концентрация растворимого фибрина в плазме - орто-фенантролиновым тестом (О-ФТ) по В.А. Елыкомову, А.П. Мо-моту (1987); Па-зависимый лизис эуглобулинов - по Г.Ф. Еремину, А.Г. Архипову (1982); уровень фибриногена в плазме - по Clauss (1957); активность антитромбина III (АТ-III) - по Abildgaard (1970); скрининг нарушений в системе протеина С -по оценке нормализованного отношения (НО), которое определяли в БТП до и после внесения в нее активатора протеина С (патент № 2184976, 2002, Россия).
Исследования тромбоцитарного гемостаза: спонтанная агрегация тромбоцитов в крови - по Н. И. Тарасовой (1979); определение агрегационной активности тромбоцитов - на агрегометре Biola ЛА 230-2 с индукторами. В данном методе использовались
Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз
Наименование показателей Контрольные данные n=20 Сроки исследования.
После травмы После операции. 10 - 11 сутки после операцуи и
1 группа n=21 2 группа n=35 1 группа n=21 2 группа n=35 1 группа n=21 2 группа n=35
Кол-во тромбоцитов х109/л. 247,9±4,46 235,4±8,8 * 190,5±9,2** * 224,5±6,1 * 185,4±7,1 243,4±8,5 * 209,2±7,2**
Спонтанная агрегация тромбоцитов% 24,4±2,5 26,5±3,2 29,1±1,8 28,3±4,1 * 32,3±2,7 25,8±5,1 * 31,2±1,6
АДФ- агрегация% 90,1±4,66 93,2±3,7 * 108,2±2,1 96,4±4,1 * 114,3±4,5 92,8±5,1 * 101,6±3,2
Адреналин- агрегация% 96,9±2,40 99,3±3,1 * 110,9±3,7 ** 101,2±4,3 * 114,5±5,8 98,5±4,3 * 109,7±3,4 **
Коллаген- агрегация% 90,50±3,89 99,5±5,4 * 120,8±4,1 * 107,3±3,5 * 125,1±7,3 * 101,4±2,8 * 112,1±6,2
Тромбин- агрегация,% 98,54±4,47 103,5±4,3 * 117,5±6,5 108,1±6,2 * 120,8±6,2 99,3±4,1 * 116,8±5,5
Актив-ть ф-ра Виллебранда в плазме% 90,87±3,5 * 102,1±3,7 * 132,5±3,1 ** * 109,3±6,2 * 142,2±3,3 104,2±3,1 * 125,1±2,4 **
Примечание: здесь и далее: *- значения, достоверно (Р<0,05) отличающиеся от контроля; ** - значения достоверности между 1-й и 2-й группами. (Р<0,05)
