CC BY
392
дигиена и санитария 2/2014
Профилактическая токсикология и гигиеническое нормирование
© ДУРНЕВ А.Д., 2014 УДК 614.7:612.6.05.064:008
Дурнев А.Д.
оценка генотоксичности наночастиц при использовании в медицине
ФГБУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» РАМН, 115325, Москва
Рассмотрены результаты исследования генотоксичности наночастиц с акцентом на исследования in vivo. В качестве общего механизма генотоксичности наночастиц определен окислительный стресс. Изложены практические соображения, касающиеся генотоксической оценки наночастиц. В частности, подчеркнут приоритет исследований in vivo, указано на возможную зависимость манифестации эффектов как от свойств наночастиц, так и от сроков экспозиции, дозы, пути введения, особенностей пробоподготовки. Отмечена целесообразность использования в экспериментах положительных контролей. В качестве задач, требующих решения, выделены оценка способности наночастиц к индукции генных мутаций и оценка их генотоксических эффектов в эмбриональных и зародышевых клетках. Дано заключение по общему состоянию проблемы и определены приоритеты развития исследований в области генотоксикологии наночастиц.
Ключевые слова: наночастицы; генотоксичность.
DurnevA.D. - GENOTOXICITY EVALUATION OF NANOPARTICLES
Zakusov Research Institute of Pharmacology of RAMS, Moscow, 125315, Russian Federation
There are considered the results of studies of genotoxicity of nanoparticles with an emphasis on studies in vivo. Oxidative stress was determined as a general mechanism genotoxicity of nanoparticles defined. There are reported the practical considerations relating to the genotoxic assessment of nanoparticles. In particular, there was pointed out the priority of research in vivo, there was indicated to a possible dependence of the manifestation of effects as well on the properties of nanoparticles, as the timing of exposure, dose, route of administration, the peculiarities of the sample preparation. There was noted the desirability of the usage of positive controls in experiments. As tasks requiring solutions, there were separated the assessment of the ability of nanoparticles to the induction of gene mutations and evaluation of their genotoxic effects in embryonic and germ cells. There was given a conclusion on the general state of the problem and there were identified the priorities of research in genotoxicology of nanoparticles.
Key words: nanoparticles; genotoxicity.
С развитием нанотехнологий связывают прогресс науки и техники в самых разнообразных областях человеческой деятельности. Следует ожидать прогрессивно расширяющегося контакта человека и экосистем с наночастицами, а также целенаправленного использования наночастиц в области медицины.
Экстенсивное развитие нанотехнологий происходит на фоне неполного знания о влиянии наночастиц на здоровье человека и экосистему в целом. Вместе с тем, уже первые исследования показали, что вещества в наноформе приобретают новые, ранее не присущие им свойства и биологические эффекты, повышенную биодоступность, способность вызывать окислительный стресс и воспаление, проникать в клетку и ядро [1, 2].
Недостаточно исследованным остается вопрос о генотоксичности нанопроизводных, до сих пор не сложилась методология оценки их генотоксических эффектов и прогноза генотоксического риска применения человеком.
Настоящая работа нацелена на анализ данных, полученных при изучении генотоксичности наночастиц, рассмотрение возможных механизмов их генотоксического действия и практических соображений по совершенствованию подходов к оценке генотоксичности наночастиц.
Отдаленные последствия генотоксических поражений
Имеются три основных мишени генотоксических поражений. Это соматические, зародышевые и эмбриональные
Для корреспонденции: Дурнев Андрей Дмитриевич, addur-nev@mail.ru
клетки. Поражения соматических клеток на ядерном уровне имеют следствием канцерогенез, на митохондриальном уровне приводят к развитию митохондриальных болезней. Индукция мутаций в зародышевых клетках — источник возникновения многочисленных наследственных заболеваний и бесплодия и поддержания их частоты на определенном уровне. Наконец, генотоксические воздействия на эмбриональные клетки являются причиной невынашивания беременности и тератогенеза [3].
Таким образом, поражения генетических структур соматических и зародышевых клеток неизбежно создают угрозу жизни и здоровью не только настоящего, но и будущих поколений.
Регистрация генотоксичности
Выделяют четыре категории генотоксических событий: повреждения ДНК, генные мутации, хромосомные и геномные мутации. Метода, позволяющего единомоментную регистрацию всех типов генетических повреждений, не существует, что вынуждает применять батареи из разных тестов, делить исследование на последовательные этапы. Наиболее распространенные методические подходы к регистрации генотоксичности и общий алгоритм исследований представлены на схеме [4].
В научных целях для регистрации генотоксичности используется более двух сотен методов, но для экспертной оценки генотоксических свойств применяются только некоторые, хорошо верифицированные тесты. Главные дискуссии сосредоточены в области сравнительной значимости данных, полученных in vitro и in vivo. В последнее время все большое распространение приобретает мнение о приоритете экспериментов in vivo.
76
Вывод о генотоксичности может быть сделан только на основе результатов комплексных сопряженных исследований, характеризующих влияние изучаемого агента на различные категории генотоксических событий. Минимальная программа испытаний, принятая в России, ограничивается оценкой генных мутаций у микроорганизмов (тест Эймса) и структурных хромосомных аберраций и/или микроядер в соматических клетках мышей in vivo.
К этим тестам все чаще добавляется метод оценки повреждений ДНК, как правило, метод ДНК-комет. Метод учета доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей, еще недавно входивший в этот список, используется крайне редко из-за высокой вариабельности результатов, а новые методы учета мутирования в зародышевых клетках находятся в стадии верификации [5].
Таким образом, в области практической оценки генотоксичности внимание сосредоточено на событиях в соматических клетках. В подавляющем большинстве, это клетки крови и костного мозга млекопитающих. Оценка эффектов в зародышевых клетках проводится только в случае регистрации генотоксических эффектов в соматических клетках или в случае получения неопределенных результатов (см. схему). Оценка генотоксических событий в митохондриальном геноме не проводится из-за отсутствия методических подходов.
Наночастицы: источники, определения и особенности
Источником наночастиц являются нанотехнологии — «совокупность методов и приемов, обеспечивающих возможность контролируемым образом создавать и модифицировать объекты, включающие компоненты с размерами менее 100 нм, хотя бы в одном измерении, и в результате этого получившие принципиально новые качества» («Концепции развития в Российской Федерации работ в области нанотехнологий»). Различают два основных способа получения наночастиц. Первый — сверхтонкий помол веществ, второй — конденсация молекул при помощи плазмы, электромагнитного или лазерного излучения и другими способами [6].
Известные сегодня наночастицы — инженерно спроектированные образования, гомогенные по составу, форме, физико-химическим свойствам. В этом их принципиальное отличие от загрязняющих атмосферу ультрамалых частиц, которые гетерогенны по указанным параметрам.
В литературе неоднократно рассматривались физикохимические особенности наночастиц, определяющие их отличия в сравнении с макродисперсиями тех же веществ. В обобщающей работе [7] отмечены пять особенностей. Во-первых, большая кривизна поверхностей и сопряженные особенности топологии атомов существенно изменяют растворимость, каталитические свойства и реакционноспособ-ность наночастиц. Во-вторых, высокая удельная поверхность усиливает их реакционноспособность, каталитические и адсорбционные свойства. В-третьих, в силу небольших размеров наночастицы способны проникать в органеллы и взаимодействовать с макромолекулами. В-четвертых, наночастицы являются электрически заряженными, что увеличивает их адсорбционные свойства и способность проникать через биобарьеры. В-пятых, высокая способность к аккумуляции. Многие частицы не подвергаются биодеградации и не распознаются защитными системами организма.
В целом каждый образец наночастиц характеризуется уникальной формой, размером, площадью поверхности, наличием внутренних пространств и пор, заряда, характеристиками растворимости, способностью к образованию агрегатов и агломератов и другими особенностями. Без детальной характеристики свойств наночастиц невозможно адекватно объяснить наблюдаемый биологический эффект, что делает принципиально важными как исчерпывающее описание, так и стандартизацию образцов, исследуемых в эксперименте [8].
Оценка генотоксичности наночастиц. Первые результаты
Наиболее полным обобщением результатов генотоксических исследований наночастиц начального периода явилась
работа R. Landsiedel и соавт. [9], а также ее более поздняя реплика [10]. Авторами упомянуто около четырех десятков работ, посвященных оценке генотоксичности наночастиц.
Наиболее часто для оценки повреждений ДНК применяли метод ДНК-комет. С его помощью была продемонстрирована слабая ДНК-повреждающая активность фуллеренов С60 (< 1 нм) в лимфоцитах периферической крови человека, одностенных углеродных нанотрубок (диаметр от 0,4 до 1,2 нм, длина 1-3 мкм) в V79-клетках, наночастиц «Carbon Black Printex 90» (диаметр 14 нм) в клетках А549.
Сильно выраженная (17-кратное превышение над контролем, метод ДНК-комет) генотоксичность кобальтохромовых наночастиц (29,5 ± 6,3 нм) была обнаружена в человеческих фибробластах in vitro. Диоксид титана в нескольких типоразмерах продемонстрировал ДНК-повреждающее действие в В-клеточных лимфобластоидных WIL2-NS-клетках и фибробластах человека. Квантовые точки, имеющие свойства полупроводников, CdSe/ZnS и наночастицы золота (1-12 нм) повреждали плазмидную ДНК, наночастицы никеля (20 нм) — суперспирализованную ДНК in vitro.
Оксимагнетит (mno-yFe2O3, 6 нм) в культуре фибробластов, диоксид титана (21 нм) в клетках L5178Y мышиной лимфомы, оксид кремния в нескольких типоразмерах в В-клеточных лимфобластоидных WIL2-NS-клетках не продемонстрировали способности повреждать ДНК (метод ДНК-комет).
При учете генных мутаций в тесте Эймса практически все исследования были отрицательны. В частности, в этом тесте не продемонстрировали активности наночастицы диоксида титана (21 нм), одностенные углеродные трубки (диаметр от 0,4 до 1,2 нм, длина 1-3 мкм), наночастицы диоксида титана (21 нм). Наночастицы «nano-FePt» (диаметр 9 нм, 78,1-5000 мкг/чашку), тестированные в тесте Эймса на штаммах TA 98, TA 100, TA 1535 и TA 1537, и E. coli штамм WPA2uvrA/ pKM101 были слабо мутагенны только в TA 100 без метаболической активации.
Наночастицы SiO2 (7,21 нм) и TiO2 (21 нм) проявили способность к индукции генных мутаций в клетках млекопитающих при использовании HPRT-теста, однако те же частицы диоксида титана не проявили мутагенной активности в L5118Y-клетках мышиной лимфомы.
В тестах на индукцию микроядер в культивируемых клетках млекопитающих активность проявили кобальтохромовые наночастицы (29,5 ± 6,3 нм, 5-500 мкм3/клетка), наночастицы SiO2 (7,21 нм, в В-клеточных лимфобластоидных WIL2-NS-клетках). Микроядра индуцировали частицы TiO2 < 20 нм (1 мг/мл в эмбриональных фибробластах сирийского хомячка) и частицы того же вещества размером 10 нм (10 мг/мл) и 6,75 нм (130 мг/мл) в BEAS-2B-клетках, а также диоксида титана, легированные церием (13 нм, 10 мкг/мл в клетках гепатомы человека 7402).
Многослойные углеродные трубки (диаметром 11,3 нм и длиной до 700 нм) индуцировали микроядра в концентрации 50 мкг/мл в культивируемых RLE эпителиальных клетках крыс.
Хромосомные аберрации in vitro индуцировали наночастицы оксида цинка (100 нм, 105 мг/мл, CHO-клетки), диоксида титана (21 нм, 12,5 и 50 мг/мл, CHL-клетки, только в условиях предварительного ультрафиолетового облучения). В свою очередь, наночастицы диоксида титана не проявили цитогенетической активности в культурах CHO-клеток и печеночных эпителиальных клеток.
In vivo цитогенетическую активность, регистрируемую по показателям продукции микроядер и/или хромосомных аберраций, проявили наночастицы магнетита (9,2 нм, 5 • 1015, 5 • 1016, 5 • 1017 частиц/кг). При однократном внутрибрюшинном введении самцам мышей Swiss они повышали выход микроядер в полихроматофильных эритроцитах в 3,8-5 раз. Факт увеличения выхода микроядер под действием этих частиц был подтвержден при их внутривенном введении.
77
[гиена и санитария 2/2014
Стратегия тестирования химических веществ на генотоксичность. На основе [4]
78
Таким образом, большинство пионерских исследований продемонстрировали генотоксичность наночастиц. Однако далеко не во всех случаях исследованные образцы были должным образом стандартизированы и/или описаны. Выбор дизайна части экспериментов часто имел явно произвольный характер, применялись нетипичные тест-системы, не учитывался опыт классических генотоксикологических исследований, практически отсутствовали работы in vivo. В совокупности это снижает доказательную значимость исследований, придает им исключительно пилотный характер.
Одновременно этот первый опыт позволил авторам сосредоточить внимание на методологии оценки генотоксичности наночастиц [10, 11]. Прозвучали мнения о непригодности микробиологических тест-систем клеток из-за непроницаемости бактериальных стенок для наночастиц; стало понятно, что генотоксический эффект может возникать не только за счет прямых воздействий, но также быть опосредованным через эндогенные механизмы, которые могут быть учтены только в экспериментах in vivo.
Возможные механизмы генотоксичности наночастиц
Согласно формирующимся представлениям [11], существуют прямые и непрямые механизмы генотоксического воздействия наночастиц.
Прямые механизмы предполагают непосредственное воздействие наночастиц на ДНК и/или клеточные структуры, обеспечивающие расхождение хромосом в митозе. В литературе имеются указания на способность наночастиц проникать в ядро. Обычно это наночастицы терапевтического или диагностического назначения, поверхность которых модифицирована пептидами, облегчающими проникновение внутрь клетки. Однако способность проникать в клеточное ядро отмечена также у наночастицы серебра [12], кремния [13] и некоторых других. Предполагается, что наночастицы могут являться каталитическим центром образования генотоксических свободных радикалов непосредственно в хроматине и/или прямо способны воздействовать на ДНК за счет интеркаляции, физического или электрохимического взаимодействия. Другой путь повреждения - воздействие на ферменты репарации и репликации за счет нарушения под действием наночастиц конформации/фолдинга и агрегации/ фибриллирования белков [14]. Однако прямые доказательства отсутствуют, гипотезы прямого взаимодействия в большей степени умозрительны и базируются на данных о свойствах наночастиц, полученных за рамками биологических экспериментов.
Более обоснован механизм непрямого генотоксического воздействия через образование эндогенных мутагенов, активных форм кислорода и продуктов перекисного окисления липидов. Генотоксическая активность этих продуктов хорошо известна [15], так же как причины, вызывающие их гиперпродукцию: индукция «прооксидантных» ферментов ксантиноксидазы, НАДФ-Н-оксидазы, альдегидоксидазы, дегидрооротатдегидрогеназы, микросомальных монооксигеназ, повреждение электронтранспортной цепи митохондрий, ингибирование и истощение ферментативных и неферментативных звеньев антиоксидантной защиты, избыток металлов переменной валентности или недостаток хелаторов металлов, воспаление и некоторые другие.
Точка зрения об опосредованности генотоксичности наночастиц через окислительный стресс имеет прямые подтверждения. Хорошо известны данные, указывающие, что в наноформе вещества, особенно металлы, истощают антиоксидантную защиту организма, вызывают увеличение выхода маркеров окислительного стресса, в том числе окислительных повреждений ДНК [16-19].
Таким образом, есть все основания полагать, что индукция окислительного стресса является наиболее общим механизмом генотоксичности наночастиц. Единственным подходом, позволяющим выявлять генотоксичность наночастиц, формирующуюся за счет прямых и непрямых механизмов,
являются исследования in vivo. Количество исследований in vivo существенно увеличилось в последние годы по сравнению с первоначальным периодом развития генотоксикологии наночастиц. Полученные результаты приведены ниже.
Оценка генотоксичности наночастиц in vivo
Наночастицы диоксида титана (40 ± 5 нм) при однократном внутривенном применении в дозе 645 мг/кг (ориентировочно
0. 5 среднелетальной дозы) не вызвали увеличения выхода микроядер в клетках костного мозга мышей на 14-й день наблюдения [20]. В экспериментах на мышах C57B1/6J наночастицы диоксида титана (агломераты 10-60 нм со средним размером частиц 21 нм), вводимые ингаляционно пять дней из расчета
4 ч в день в концентрациях 0,8, 7,2 и 28,5 мг/м3, не индуцировали повреждений ДНК в клетках легких, анализируемых немедленно после последней ингаляции, или микроядер в полих-роматофильных эритроцитах при забое животных через 48 ч после последней обработки [21]. При интратрахеальном введении самцам крыс Sprague-Dawley наночастицы (5 нм) этого материала в дозах 1 и 5 мг/кг однократно или повторно, 1 раз в неделю, 5 нед в дозах 0,2 и 1 мг/кг не оказывали влияния на целостность ДНК в клетках легких [22].
Нано- и микрочастицы диоксида титана (33 и 160 нм), вводимые самцам мышей Ft(CBA х С57В1/6) внутрижелудочно в течение 7 дней с забоем через 24 ч после последней обработки, в дозах 40 и 200 мг/кг вызывали увеличение по-врежденности ДНК в клетках костного мозга. Наночастицы в дозе 200 мг/кг поражали также клетки печени. Ни нано-, ни микрочастицы не были активны в клетках головного мозга и не вызывали индукцию микроядер в клетках костного мозга, прямой кишки и желудка. Единственное исключение составили микрочастицы диоксида титана, которые в дозе 40 мг/кг индуцировали микроядра в клетках костного мозга, но были неактивны в других дозах и других перечисленных органах [23]. Генотоксичность микрочастиц титана (160 нм) была подтверждена другими исследованиями, также проведенными при пероральном введении мышам методами ДНК-комет и учета микроядер [24].
При интратрахеальном однократном введении наночастиц диоксида титана мышам в дозах 18, 54, 162 мкг на срок
1, 3 и 28 дней были получены разнородные данные. ДНК-повреждающий эффект, регистрируемый методом ДНК-комет, фиксировался в клетках легочной жидкости и в целом был лучше выражен при длительных сроках экспозиции, но отсутствовал в бронхоальвеолярных клетках [25, 26]. Последний результат был подтвержден в сходном по дизайну исследовании с использованием наночастиц титана размером 50 нм [27].
Наночастицы кристаллического кремния (2-5 нм в виде гранул 1-5 мкм) в дозах 5, 25 и 50 мг/кг вводили однократно внутрибрюшинно мышам Ft(CBA х C57B1/6). Наночастицы не показали цитогенетической активности в клетках костного мозга мышей после 24-часовой, 7- и 14-дневной экспозиции в организме животных. Поврежденность ДНК (метод ДНК-комет) была отмечена при 24-часовом сроке экспозиции наночастиц в дозе 5 мг/кг в клетках костного мозга животных и в дозе 50 мг/кг в клетках костного и головного мозга[28].
Одно- и многостенные углеводные трубки при однократном введении в дозах 0,2 и 1 мг/кг и повторно, 1 раз в неделю,
5 нед в дозах 0,04 и 0,2 мг/кг эксперименте не проявили генотоксической активности [29, 30].
Наночастицы оксида цинка (93,35 ± 14,53 нм), вводимые внутрижелудочно в дозах 1,25; 2,5; 5 г/кг, не вызывали увеличения выхода микроядер в полихроматофильных эритроцитах при 24-, 48- и 72-часовой экспозиции [31]. Этот результат был подтвержден при оценке наночастиц этого вещества (30А200 нм) в стандартном тесте по учету микроядер в клетках костного мозга мышей после однократного внутрибрюшинного введения в дозах 15, 30, 60 мг/кг [27]. Однако V. Sharma и соавт. [32] показали, что наночастицы оксида цинка (30 нм), вводимые перорально ежедневно 14 дней в дозах 300
79
[гиена и санитария 2/2014
и 500 мг/кг, проявляют эффекты в тесте ДНК-комет, увеличивая соответственно «момент хвоста» и «% ДНК в хвосте».
Наночастицы Al2O3 (30 и 40 нм), испытанные при пероральном введении в дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг, оказались способны дозозависимо увеличивать поврежденность ДНК и выход микроядер в клетках костного мозга и периферической крови самок крыс Вистар [33, 34].
Квантовые точки CdSe per se или лигированные кобальтом (5,0 ± 0,2 нм) перорально вводили мышам в дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг. Уже через 2 дня после обработки легированные квантовые точки в максимальной дозе увеличивали поврежденность ДНК, количество микроядер и уровни специфически окисленного основания ДНК — 8-гидрокси-2-диоксигуанозина в клетках печени и костного мозга. А на 7-й день аналогичный эффект демонстрировали легированные (1000 и 2000 мг/кг) и нелегированные (2000 мг/кг) наночастицы [35].
Наночастицы Ni(OH)2 размером 5 нм использовали для ингаляционной обработки мышей ApoE-/- в концентрации 79 мкг Ni/м3 по 5 ч в день 1 нед или по 5 ч 5 дней в неделю на протяжении 5 мес. По окончании пятимесячной обработки у животных методом ПЦР были выявлены повреждения митохондриальной ДНК в клетках аорты, явления окислительного стресса и воспаления легких [36].
Генотоксичность наночастицы Fe2O3 (30 нм) при пероральном однократном введении крысам в дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг была оценена методами учета повреждений ДНК в лейкоцитах при 6-, 24-, 48- и 72-часовой экспозиции, учета микроядер в периферической крови при 48- и 72-часовой экспозиции и в клетках костного мозга методами учета хромосомных аберраций при 18- и 24-часовой экспозиции и методом учета микроядер при 24- и 48-часовой экспозиции. Ни в одном варианте эксперимента не было зафиксировано генотоксических эффектов [37].
Наночастицы аморфного кремния (15 и 55 нм) в максимально переносимой дозе (50 мг/кг) при трехкратном внутривенном введении крысам Вистар за 48, 24 и 4 ч до забоя проявили слабый генотоксический эффект, выражающийся в увеличении поврежденности ДНК и выхода микроядер в клетках крови. В той же дозе исследуемые наночастицы не вызывали повреждений ДНК в клетках печени и легких. При использовании наночастиц в меньших дозах генотоксичность не проявлялась ни в одних клетках, также она отсутствовала при анализе микроядер in vitro [38].
В той же работе [38] при аналогичных экспериментальных условиях показано отсутствие генотоксических эффектов нано- и микрочастиц золота (2, 20, и 200 нм), применяемого из расчета 0,03 мг/кг. Отсутствие способности наночастиц золота тех же размеров индуцировать повреждения ДНК и микроядрер в клетках легких крыс было отмечено также при их интратрахеальном введении крысам на срок 72 ч в дозе 18 мкг/кг [39]. В противовес, при пероральном ежедневном введении наночастиц золота (15 нм) в течение 7 и 14 дней в дозе 320 мг/кг наблюдали увеличение выхода микроядер в клетках костного мозга мышей. Эффект отсутствовал при использовании наночастиц в дозах 80 и 160 мг/кг. Сходные наблюдения, но в более широком дозовом диапазоне (160 и 320 мг/кг), сделаны теми же авторами при использовании золотокобальтовых наночастиц (15 нм). Примечательно, что наблюдаемый генотоксический эффект сопрягался с увеличением уровней 8-гидрокси-2-диоксигуанозина в геноме печеночных клеток и уменьшением глутатионпероксидазной активности, что явно указывает на вовлеченность в генотоксический процесс окислительного стресса [40].
Фулерены С60 были оценены методом ДНК-комет при интратрахеальном введении крысам однократно в дозах 0,5 и 2,5 мг/кг или повторно еженедельно на протяжении 5 нед в дозах 0,1 и 0,5 мг/кг. Клеточный материал легких фиксировали через 3 и 24 ч после однократного введения и через 3 ч после последнего введения в субхроническом эксперименте.
Полученные данные продемонстрировали отсутствие ДНК-повреждающего действия частиц даже в том случае, когда они были использованы в дозах, вызывающих воспаление (2,5 и 0,5 мг/кг) [41]. Тот же агент в дозах 22, 45, 88 мг/кг внутрижелудочно в экспериментах на ICR-мышах не индуцировал микроядер в полихроматофильных эритроцитах при 48-часовой экспозиции [42].
Наночастицы «Carbon black Printex 90» после однократного интратрахеального закапывания в дозах 0,018, 0,054 и 0,162 мг/мышь продемонстрировали способность вызывать разрывы ДНК в клетках бронхоальвеолярного лаважа, легких и печени и вызывать окислительные повреждения ДНК, оцениваемые по числу участков, чувствительных к формами-допиримидин ДНК-гликозилазе. Регистрируемые эффекты нарастали с дозой и временем экспозиции частиц в организме [43].
Наночастицы серебра размером 18 нм испытывали на самцам крыс Sprague-Dawley при 90-дневной ингаляции по 6 ч в день из расчета 0,7 • 106, 1,4 • 106 и 2,9 • 106 частиц/см3 и размером 60 нм при 28-дневном пероральном введении в дозах 30, 300 и 1000 мг/кг Оценка микроядер в клетках костного мозга не выявила признаков, указывающих на генотоксичность исследованного агента [44, 45]. На крысах Вистар были испытаны наночастицы серебра 15 40 нм, вводимые
внутривенно в дозах 1, 10, 20, 40 мг/кг с 5- дневным интервалом и забоем на 32-й день эксперимента. В этом исследовании было выявлено увеличение поврежденности ДНК в клетках крови при использовании наночастиц в максимальной дозе [46]. Существенно, что имеются многочисленные свидетельства индукции окислительного стресса под действием наночастиц серебра, они обобщены в недавнем обзоре [47].
По существу, первым исследованием, посвященным сравнительной оценке генотоксичности наночастиц при их длительном введении, является работа Б.А. Кацнельсон и соавт. [48]. В качестве показателя генотоксичности авторы использовали полиморфизм длин амплифицированных фрагментов геномной ДНК. В результате 20-дневного ежедневного внутрибрюшинного введения крысам наночастиц золота и серебра одинакового размера (50 нм) в дозе 10 мг/кг усиление фрагментации ДНК было отмечено в клетках крови, костного мозга, селезенки, печени, почек и отсутствовало в клетках поперечнополосатых мышц. Эффект был более выражен у наночастиц серебра.
Многие наночастицы не исследовались in vivo. Например, отсутствуют данные литературы о наночастицах никеля, меди, а также полимерных, липосомных наночастицах и других потенциальных наноносителях лекарственных средств. Однако многие из них проявили генотоксические свойства in vitro [49].
Окончательные заключения о генотоксичности тех или иных частиц на основании единичных экспериментов явно преждевременны. Полученные результаты только подчеркивают необходимость проведения развернутых комплексных исследований генотоксичности наночастиц и актуализируют усилия по разработке подходов к экспертной оценке их генотоксичности.
Практические соображения по генотоксической оценке наночастиц в соматических клетках in vivo
Выделение окислительного стресса в качестве общего механизма генотоксичности наночастиц имеет важные следствия как для стратегии генотоксического тестирования, так и для анализа имеющихся данных по генотоксичности наночастиц.
Окислительный стресс - результирующие событие на уровне организма, отсюда наиболее адекватной моделью исследования генотоксичности наночастиц являются млекопитающие in vivo. К аналогичному заключению приходят и другие авторы [50]. Более того, выбор в пользу систем in vivo делает все больше исследователей, поскольку, при всех отдельных преимуществах тест-систем in vitro, только экс-
80
перименты in vivo позволяют всесторонне оценить эффект. При условии выявления закономерностей проявления генотоксических эффектов в зависимости от дозы, пути введения и срока экспозиции в организме они позволяют получить данные, которые возможно экстраполировать на человека.
A priory очевидно, что при испытании наночастиц срок экспозиции в 24 ч, обычно принятый при оценке генотоксичности химических соединений, недостаточен. Минимальный срок между введением наночастиц и фиксацией клеточного материала должен быть достаточным для развития и становления окислительного стресса и связанных генотоксических событий. Из вышеприведенных данных следует, что увеличение сроков экспозиции наночастиц в организме до нескольких недель - общая тенденция в исследованиях их генотоксичности in vivo. Представляется, что оптимальный подход - это многократное повторное введение на протяжении недель или месяцев. Частицы, не подверженные биодеградации, могут аккумулироваться в организме, что должно учитываться при проведении генотоксикологических экспериментов, предусматривающих длительные повторные введения.
Для обоснованного выбора сроков экспозиции важно располагать сведениями о биодоступности, биодеградации, распределении и кинетике наночастиц в организме. Представляется, что в отсутствие этих данных невозможны ни правильное построение генотоксикологического эксперимента, ни адекватная трактовка полученных результатов.
Очевидно, что эти параметры могут существенно варьировать в зависимости от пути введения наночастиц. В качестве основных путей поступления наночастиц в организм человека рассматривают пероральный, трансдермальный и ингаляционный, для наночастиц медицинского назначения очевиден внутривенный. Именно такими путями наночастицы вводили в экспериментах, описанных выше. Недостаточность данных не позволяет провести сравнительный анализ генотоксичности в зависимости от путей введения наночастиц. Это вынуждает рекомендовать применение в эксперименте того пути введения, который наиболее реален при экспозиции человека.
Особого рассмотрения требует вопрос доз. Общепринято в качестве меры дозы использовать массу, реже - объем вводимого агента (в мг/кг, мл/кг). Главное отличие наночастиц заключается в том, что их свойства определяет поверхность, которая зависит от количества и формы частиц. Поэтому логично выражать дозу не в единицах массы, а в единицах вводимых частиц. Не менее важно определение пределов доз, используемых в биологических испытаниях наночастиц. С нашей точки зрения, они должны выражаться в частях от величины среднелетальной дозы для животных избранного вида при соответствующем пути введения, но во избежание получения ложноположительных результатов не превышать 1/2 LD50 . Дозировка наночастиц медицинского назначения должна осуществляться с учетом терапевтической широты.
Отдельного рассмотрения требует вопрос о тканеспецифичности возможного генотоксического действия наночастиц. В качестве основных органов-мишеней для наночастиц определены сердце, головной мозг, легкие и печень [14]. С нашей точки зрения, этот список может быть дополнен почками. Понятно, что фармакокинетические исследования позволят выделить какие-то мишени, специфические для каждого вида наночастиц при соответствующем пути введения. Однако каждая ткань a priory имеет свой профиль антиоксидантной защиты, а следовательно, разные ткани будут характеризоваться различной чувствительностью к генотоксическому действию наночастиц, опосредуемому окислительным стрессом. Тканеспецифичность действия отчетливо прослеживается для многих наночастиц, описанных выше. В условиях ограниченного круга тканей (костный мозг, кровь, при использовании нежелательной в генотоксическом эксперименте частичной эктомии — печень и селезенка), позволяющих фиксировать классические генотоксические маркеры
(микроядра, хромосомные аберрации), возникает вероятность получения ложноотрицательных результатов из-за недоучета эффектов во «вторичных тканях».
Одним из первых авторов, обративших внимание на возможную тканеспецифичность действия наночастиц, была Л.П. Сычева [51]. Она предложила использовать полиорганный кариологический анализ. Это надежный, но весьма трудоемкий метод. Он вряд ли пригоден для массового скрининга наночастиц на генотоксичность, поскольку не получил широкого распространения, вследствие чего его применение не может обеспечить сопоставимость результатов исследований. Нам представляется, что более пригоден метод учета ДНК-комет in vivo [52], тем более что он весьма часто применяется при оценке генотоксичности наночастиц, а следовательно, обеспечит сравнимость исследований. Однако при трактовке данных не следует забывать, что при использовании этого метода регистрируются предмутационные изменения, патогенетическая роль которых не до конца понятна. Отсюда очевидна этапность: скрининг с помощью ДНК-комет и подтверждение эффектов полиорганным ка-риологическим анализом.
Особого внимания при испытании наночастиц требует пробоподготовка, которая, как следует из материалов по фул-леренам [53], может быть самостоятельной задачей исследования и должна проводиться с учетом физико-химических особенностей каждого исследуемого образца. Естественным требованием является также подробное описание методов получения наночастиц, определения их размеров и иных характеристик.
Конструктивной мерой, способной снизить количество противоречивых и/или неопределенных результатов, может стать использование в экспериментах стандартизированных образцов и положительного контроля, подобно тому, как это принято при выполнении теста Эймса [54]. В качестве таких контролей логично использовать стандартные наночастицы с установленными генотоксическими свойствами.
Анализ литературы показывает, что нерешенными задачами в области оценки генотоксичности наночастиц in vivo остаются учет генных мутаций у млекопитающих и учет генотоксических событий в эмбриональных и зародышевых клетках, а также в митохондриальном геноме. Первая задача остается открытой несколько десятков лет. С массой оговорок она может решаться на основе регистрации предмутационных событий с помощью метода ДНК-комет и использования специально сконструированных трансгенных животных, например мышей Muta™Mouse и Big Blue®. Вторая задача, также с некоторыми оговорками, принципиально может быть решена с использованием метода ДНК-комет; имеется опыт его применения для оценки целостности ДНК-клеток эмбрионов [55]. Кроме того, разработан новый модифицированный метод цитогенетического анализа ооцитов [56]. Третья задача (учет генотоксических событий в митохондриальном геноме) на настоящий момент не имеет удовлетворительного методического решения.
Наконец, необходимы сравнительные исследования, призванные определить свойства наночастиц и характеристики эксперимента, от которых зависит генотоксичность, подобные цитированной выше работе [48], но выполненные на основе стандартных, хорошо верифицированных генотоксикологических методов.
Заключение
Оценка генотоксичности наночастиц носит фрагментарный характер, противоречива и не обеспечивает прогнозирование генотоксических рисков воздействия наноматериалов на человека. На современном этапе можно сделать два заключения. Первое: наночастицы могут проявлять генотоксические свойства in vivo, а следовательно, потенциально опасны для здоровья человека. Второе: главные вопросы — от каких свойств наночастиц зависит проявление геноток-
81
[гиена и санитария 2/2014
сичности и каким образом параметры эксперимента (доза, путь введения, срок экспозиции и пр.) сказываются на манифестации эффектов, какие методические приемы должны использоваться при оценке их генотоксичности, каким образом показатели генотоксичности должны учитываться при санитарно-гигиеническом нормировании наночастиц - остаются открытыми.
С точки зрения чисто генотоксикологических задач усилия должны быть направлены на методическое обеспечение комплексности исследований, обоснование некой батареи тестов, с одной стороны, обеспечивающей всесторонность генотоксикологической оценки, а с другой - позволяющей избежать получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов и обеспечивающей сходимость результатов независимых исследований.
Эти усилия будут успешны только при наличии исследований общих закономерностей проявления биологических и токсических эффектов наночастиц в зависимости от их формы, размера, исходного материала, площади поверхности, заряда и других особенностей, а также дозы, пути введения, концентрации в области органа-мишени и продолжительности воздействия. Это наиболее важные фундаментальные вопросы токсикологии и, в частности, генотоксикологии наночастиц.
Литература (пп. 1, 2, 4, 6, 8-47, 49, 50, 54 - см. References)
3. Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Шредер О.В., Середенина В.С. Генотоксические поражения и болезни. Молекулярная медицина. 2013; 3: 3-19.
5. Дурнев А.Д. Анализ и значение мутаций в зародышевых клетках. Медицинская генетика. 2011; 10(2): 3-11.
7. Онищенко Г.Г., Арчаков А.И., Бессонов В.В., Бокитько Б.Г., Гинцбург А.Л., Измеров Н.Ф. и др. Методические подходы к оценке безопасности наноматериалов. Гигиена и санитария. 2007; 6: 3-10.
48. Кацнельсон Б.А., Макеев О.Г., Привалова Л.И., Гурвич В.Б., Сутункова М.П., Киреева Е.П. и др. О сравнительной генотоксичности наносеребра и нанозолота и возможности её снижения комплексом биопротекторов. Токсикологический вестник. 2013; 2: 20-5.
51. Сычева Л.П. Оценка мутагенных свойств наноматериалов. Гигиена и санитария. 2008; 6: 26-8.
52. Жанатаев А.К., Никитина В.А., Воронина Е.С., Дурнев А.Д. Методические аспекты оценки ДНК-повреждений методом ДНК-комет. Прикладная токсикология. 2011; 2(2): 28-37.
53. Пиотровский Л.Б., Еропкин М.Ю., Еропкина Е.М., Думпис М.А., Киселев О.И. Механизмы биологического действия фуллеренов - зависимость от агрегатного состояния. Психофармакология и биологическая наркология. 2007; 7(2): 1548-53.
55. Шредер О.В., Шредер Е.Д., Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Сопряженность генотоксических и тератогенных эффектов, вызываемых циклофосфамидом, и их модификация афобазолом. Гигиена и санитария. 2011; 5: 64-8.
56. Плигина К.Л., Жанатаев А.К., Чайка З.В., Дурнев А.Д. Методика цитогенетического анализа ооцитов мышей. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2013; 156(7): 128-32.
References
1. Oberdorster G., Oberdorster E., Oberdorster J. Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles. Environ. Health Perspect. 2005; 113(7): 823-39.
2. Hubbs A.F., Mercer R.R., Benkovic S.A., Harkema J., Sriram K., Schwegler-Berry D. et al. Nanotoxicology - a pathologist’s perspective. Toxicol. Pathol. 2011; 39(2): 301-24.
3. Durnev A.D., Zhanataev A.K., Shreder O.V., Seredenina V.S. Geno-toxic events and diseases. Molekulyarnaya meditsina. 2013; 11(3): 3-19. (in Russian)
4. Eastmond D.A., Hartwig A., Anderson D., Anwar W.A., Cimino M.C., Dobrev I. et al. Mutagenicity testing for chemical risk assessment: update of the WHO/IPCS Harmonized Scheme. Mutagenesis. 2009; 24(4): 341-9.
5. Durnev A.D. The analysis and the importance of mutations in germ cell. Meditsinskaya genetika. 2011; 10(2): 3-11. (in Russian)
6. Borm P.J., Robbins D., Haubold S., Kuhlbusch T., Fissan H., Donaldson K. et al. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part. Fibre Toxicol. 2006; 3: 11.
7. Onishchenko G.G., Archakov A.I., Bessonov V.V., Bokit’ko B.G., Gintsburg A.L. et al. Guidelines for evaluation of the safety of nanomaterials. Gigiena i sanitariya. 2007; 6: 3-10. (in Russian)
8. Sayes C.M., Warheit D.B. Characterization of nanomaterials for toxicity assessment. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2009; 1(6): 660-70.
9. Landsiedel R., Kapp M.D., Schulz M., Wiench K., Oesch F. Genotoxicity investigations on nanomaterials: methods, preparation and characterization of test material, potential artifacts and limitations-many questions, some answers. Mutat. Res. 2009; 681(2-3): 241-58.
10. Oesch F., Landsiedel R. Genotoxicity investigations on nanomaterials. Arch. Toxicol. 2012; 86(7): 985-94.
11. Donaldson K., Poland C.A., Schins R.P. Possible genotoxic mechanisms of nanoparticles: criteria for improved test strategies. Nanotoxicology. 2010; 4: 414-20.
12. AshaRani P.V., Low Kah Mun G., Hande M.P.,Valiyaveettil S. Cytotoxicity and genotoxicity of silver nanoparticles in human cells. ACS Nano. 2009; 3(2): 279-90.
13. Chen M., von Mikecz A. Formation of nucleoplasmic protein aggregates impairs nuclear function in response to SiO2 nanoparticles. Exp. Cell Res. 2005; 305: 51-62.
14. Elsaesser A., Howard C.V Toxicology of nanoparticles. Adv. Drug Deliv. Rev. 2012; 64(2): 129-37.
15. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine. 4th ed. Oxford: Oxford University Press; 2007.
16. M0ller P., Jacobsen N.R., Folkmann J.K., Danielsen P.H., Mikkelsen L., Hemmingsen J.G. et al. Role of oxidative damage in toxicity of particulates. Free Radic. Res. 2010; 44(1): 1-46.
17. Trpkovic A., Todorovic-Markovic B., Trajkovic V Toxicity of pristine versus functionalized fullerenes: mechanisms of cell damage and the role of oxidative stress. Arch. Toxicol. 2012; 86(12): 1809-27.
18. Shvedova A.A., Pietroiusti A., Fadeel B., Kagan V.E. Mechanisms of carbon nanotube-induced toxicity: focus on oxidative stress. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2012; 261(2): 121-33.
19. Schrand A.M., Dai L., Schlager J.J., Hussain S.M. Toxicity testing of nanomaterials. Adv. Exp. Med. Biol. 2012; 745: 58-75.
20. Xu J., Shi H., Ruth M., Yu H., Lazar L., Zou B. et al. Acute toxicity of intravenously administered titanium dioxide nanoparticles in mice. PLoS One. 2013; 8(8). Available at: http://www.plosone.org/article/ info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone. 0070618. (Accepted: June 20, 2013).
21. Lindberg H.K., Falck G.C., Catalan J., Koivisto A.J., Suhonen S., Jarventaus H. et al. Genotoxicity of inhaled nanosized TiO(2) in mice. Mutat. Res. 2012; 745(1-2): 58-64.
22. Naya M., Kobayashi N., Ema M., Kasamoto S., Fukumuro M., Taka-mi S. et al. In vivo genotoxicity study of titanium dioxide nanoparticles using comet assay following intratracheal instillation in rats. Regul. Toxicol. Pharmacol. 2012; 62(1): 1-6.
23. Sycheva L.P., Zhurkov V.S., Iurchenko V.V., Daugel-Dauge N.O., Kovalenko M.A., Krivtsova E.K., Durnev A.D. Investigation of genotoxic and cytotoxic effects of micro- and nanosized titanium dioxide in six organs of mice in vivo. Mutat. Res. 2011; 726(1): 8-14.
24. Trouiller B., Reliene R., Westbrook A., Solaimani P., Schiestl R.H. Titanium dioxide nanoparticles induce DNA damage and genetic instability in vivo in mice. Cancer Res. 2009; 69(22): 8784-9.
25. Saber A.T., Jacobsen N.R., Mortensen A., Szarek J., Jackson P.,
Madsen A.M. et al. Nanotitanium dioxide toxicity in mouse lung is reduced in sanding dust from paint. Part. Fibre Toxicol. 2012; 9: 4. Available at: http://www.particleandfibretoxicology.com/
content/9/1/4 (Accepted 2 Febuary 2012).
26. Saber A.T., Jensen K.A., Jacobsen N.R., Birkedal R., Mikkelsen L., M0ller P. et al. Inflammatory and genotoxic effects of nanoparticles designed for inclusion in paints and lacquers. Nanotoxicology. 2012; 6(5): 453-71.
27. Landsiedel R., Ma-Hock L., Van Ravenzwaay B., Schulz M., Wiench K., Champ S. et al. Gene toxicity studies on titanium dioxide and zinc oxide nanomaterials used for UV-protection in cosmetic formulations. Nanotoxicology. 2010; 4: 364-81.
28. Durnev A.D., Solomina A.S., Daugel-Dauge N.O., Zhanataev A.K., Shreder E.D., Nemova E.P. et al. Evaluation of genotoxicity and
82
reproductive toxicity of silicon nanocrystals. Bull. Exp. Biol. Med. 2010; 149(4): 445-9.
29. Naya M., Kobayashi N., Endoh S., Maru J., Honda K., Ema M. et al. In vivo genotoxicity study of single-wall carbon nanotubes using comet assay following intratracheal instillation in rats. Regul. Toxicol. Pharmacol. 2012; 64(1): 124-9.
30. Ema M., Masumori S., Kobayashi N., Naya M., Endoh S., Maru J. et al. In vivo comet assay of multi-walled carbon nanotubes using lung cells of rats intratracheally instilled. J. Appl. Toxicol. 2013; 33(10): 1053-60.
31. Li C.H., Shen C.C., Cheng Y.W., Huang S.H., Wu C.C., Kao C.C. et al. Organ biodistribution, clearance, and genotoxicity of orally administered zinc oxide nanoparticles in mice. Nanotoxicology. 2012; 6(7): 746-56.
32. Sharma V, Singh P., Pandey A.K., Dhawan A. Induction of oxidative stress, DNA damage and apoptosis in mouse liver after sub-acute oral exposure to zinc oxide nanoparticles. Mutat. Res. 2012; 745: 84-91.
33. Balasubramanyam A., Sailaja N., Mahboob M., Rahman M.F., Misra S., Hussain S.M., Grover P. Evaluation of genotoxic effects of oral exposure to aluminum oxide nanomaterials in rat bone marrow. Mu-tat. Res. 2009; 676: 41-7.
34. Balasubramanyam A., Sailaja N., Mahboob M., Rahman M.F., Hussain S.M., Grover P. In vivo genotoxicity assessment of aluminium oxide nanomaterials in rat peripheral blood cells using the comet assay and micronucleus test. Mutagenesis. 2009; 24: 245-51.
35. Khalil W.K., Girgis E., Emam A.N., Mohamed M.B., Rao K.V. Genotoxicity evaluation of nanomaterials: DNA damage, micronuclei, and 8-hydroxy-2-deoxyguanosine induced by magnetic doped CdSe quantum dots in male mice. Chem. Res. Toxicol. 2011; 24(5): 640-50.
36. Kang G.S., Gillespie P.A., Gunnison A., Moreira A.L., Tchou-Wong K.M., Chen L.C. Long-term inhalation exposure to nickel nanoparticles exacerbated atherosclerosis in a susceptible mouse model. Environ. Health Perspect. 2011; 119(2): 176-81.
37. Singh S.P., Rahman M.F., Murty U.S., Mahboob M., Grover P. Comparative study of genotoxicity and tissue distribution of nano and micron sized iron oxide in rats after acute oral treatment. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2013; 266(1): 56-66.
38. Downs T.R., Crosby M.E., Hu T., Kumar S., Sullivan A., Sarlo K. et al. Silica nanoparticles administered at the maximum tolerated dose induce genotoxic effects through an inflammatory reaction while gold nanoparticles do not. Mutat. Res. 2012; 745(1-2): 38-50.
39. Schulz M., Ma-Hock L., Brill S., Strauss V., Treumann S., Groters S. et al. Investigation on the genotoxicity of different sizes of gold nanoparticles administered to the lungs of rats. Mutat. Res. 2012; 745(1-2): 51-7.
40. Girgis E., Khalil W.K., Emam A.N., Mohamed M.B., Rao K.V. Nanotoxicity of gold and gold-cobalt nanoalloy. Chem. Res. Toxicol. 2012; 25: 1086-98.
41. Ema M., Tanaka J., Kobayashi N., Naya M., Endoh S., Maru J. et al. Genotoxicity evaluation of fullerene C60 nanoparticles in a comet assay using lung cells of intratracheally instilled rats. Regul. Toxicol. Pharmacol. 2012; 62(3): 419-24.
42. Shinohara N., Matsumoto K., Endoh S., Maru J., Nakanishi J. In
vitro and in vivo genotoxicity tests on fullerene C60 nanoparticles. Toxicol. Lett. 2009; 191(2-3): 289-96.
43. Bourdon J.A., Saber A.T., Jacobsen N.R., Jensen K.A., Madsen A.M., Lamson J.S. et al. Carbon black nanoparticle instillation induces sustained inflammation and genotoxicity in mouse lung and liver. Part. Fibre Toxicol. 2012; 9: 5. Available at: http://www.particleandfibret-oxicology.com/content/9/1/5/ Accepted: 2 February 2012).
44. Kim Y.S., Kim J.S., Cho H.S., Rha D.S., Kim J.M., Park J.D. et al. Twenty-eight-day oral toxicity, genotoxicity, and gender-related tissue distribution of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats. In-hal. Toxicol. 2008; 20: 575-83.
45. Kim J.S., Sung J.H., Ji J.H., Song K.S., Lee J.H., Kang C.S., Yu I.J. In vivo genotoxicity of silver nanoparticles after 90-day silver nanoparticle inhalation exposure. Saf. Health Work. 2011; 2: 34-8.
46. Tiwari D.K., Jin T., Behari J. Dose-dependent in vivo toxicity assessment of silver nanoparticle in Wistar rats. Toxicol. Mech. Methods. 2011; 21: 13-24.
47. Kim S., Ryu D.Y. Silver nanoparticle-induced oxidative stress, genotoxicity and apoptosis in cultured cells and animal tissues. J. Appl. Toxicol. 2013; 33(2): 78-89.
48. Katsnel’son B.A., Makeev O.G., Privalova L.I., Gurvich V.B., Su-tunkova M.P., Kireeva E.P. et al. On the comparative genotoxicity of nanosilver and nanogold and the possibility of its reduction bioprotectors complex. Toksikologicheskiy vestnik. 2013; 2: 20-5. (in Russian)
49. Shah V., Taratula O., Garbuzenko O.B., Patil M.L., Savla R., Zhang M., Minko T. Genotoxicity of different nanocarriers: possible modifications for the delivery of nucleic acids. Curr. Drug Discov. Technol. 2013; 10(1): 8-15.
50. Klien K., Godnic-Cvar J. Genotoxicity of metal nanoparticles: focus on in vivo studies. Arh. Hig. Rada Toksikol. 2012; 63(2): 133-45.
51. Sycheva L.P. Evaluation of mutagenic properties of nanomaterials. Gigiena i sanitariya. 2008; 6: 26-8. (in Russian)
52. Zhanataev A.K., Nikitina V.A., Voronina E.S., Durnev A.D. Methodological aspects of the evaluation of DNA damage by comet assay. Prikladnaya toksikologiya. 2011; 2(2): 28-37. (in Russian)
53. Piotrovskiy L.B., Eropkin M.Yu., Eropkina E.M., Dumpis M.A., Kiselev O.I. The mechanisms of biological action of fullerenes - dependent on the state of aggregation. Psikhofarmakologiya i biolog-icheskaya narkologiya. 2007; 7(2): 1548-53. (in Russian)
54. Pfuhler S., Elespuru R., Aardema M.J., Doak S.H., Maria Donner E., Honma M. et al. Genotoxicity of nanomaterials: refining strategies and tests for hazard identification. Environ. Mol. Mutagen. 2013; 54(4): 229-39.
55. Shreder O.V., Shreder E.D., Durnev A.D., Seredenin S.B. Association of genotoxic and teratogenic effects induced by cyclophosphamide and their modification with afobazole. Gigiena i sanitariya. 2011; 5: 64-8. (in Russian)
56. Pligina K.L., Zhanataev A.K., Chayka Z.V., Durnev A.D. Methods of cytogenetic analysis of mouse oocytes. Byulleten’ eksperimental’noy biologii i meditsiny. 2013; 156(7): 128-32. (in Russian)
Поступила 23.09.13 Received 23.09.13
83
