CC BY
59
№ 1 (31)
январь, 2017 г.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ
ГЕНЕТИКА
ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ИЗУЧЕНИИ ГЕНОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФТОРИСТЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ФТОР ИНДУЦИРОВАННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Сердюкова Екатерина Сергеевна
студент, ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный университет»,
650043, Россия, г. Кемерово, ул. Красная, 6 E-mail: katya.serdyukova. [email protected]
Ларионов Алексей Викторович
доцент кафедры генетики, кандидат биологических наук, ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный университет», 650043, Россия, г. Кемерово, ул. Красная, 6 E-mail: [email protected]
CYTOGENETIC RESEARCH METHODS IN STUDYING GENOTOXIC PROPERTIES OF FLUORIDES AND FLUORO-INDUCED DISEASES
Ekaterina Serdyukova
a student of Kemerovo state University, 650043, Russia, Kemerovo, Krasnaya str., 6
Alexey Larionov
associate Professor of Genetics Chair, Candidate of biological sciences, Kemerovo state University,
650043, Russia, Kemerovo, Krasnaya str., 6
АННОТАЦИЯ
В статье проведён анализ семи литературных источников, описывающих работы по исследованию влияния фтора и его соединений на биологические объекты. Цитотоксические и генотоксичекие эффекты, присущие фтористым соединениям детектировались различными методами, такими как: методика учёта частоты хромосомных аберраций, методика учёта сестринских хроматидных обменов, микроядерный тест и методика ДНК-комет. На основе изученных материалов были сделаны выводы, что фтористые соединения способны вызывать нарушения в жизненном цикле клетки, а также в целостности генетического аппарата. Наблюдая стабильно высокий уровень генетических повреждений, вызываемых фторидами, можно с уверенностью заявить о высокой генотоксичности фтористых соединений.
ABSTRACT
In the article the analysis of seven references describing the research work of the fluorine impact and its compounds on biological objects is carried out. Cytotoxic and genotoxic effects inherent to fluorides are detected by various methods such as the method of accounting frequency of chromosome aberrations, the method of accounting sister chromatid exchanges, the micronucleus test and the DNA comet method. Based on studied materials, it is concluded that fluorides can cause disturbances in the life cycle of a cell as well as the integrity of the genetic apparatus. Watching a consistently high level of genetic damage caused by fluorides, we can confidently declare about high genotoxicity of fluorides.
Ключевые слова: генотоксический и цитотоксический эффект, флюороз, ДНК.
Keywords: genotoxic and cytotoxic effect, fluorosis, DNA.
Библиографическое описание: Сердюкова Е.С., Ларионов А.В. Цитогенетические методы исследования в изучении генотоксических свойств фтористых соединений и фтор индуцированных заболеваний // Universum: Химия и биология: электрон. научн. журн. 2017. № 1(31). URL: http://7universum. com/ru/nature/archive/item/4163
№ 1 (31)
Введение
В соответствии с ГОСТом 2874-82 определена допустимая концентрация фтора в водоисточнике — 1.5 мг/л. При систематическом поступлении соединений фтора в организм человека с питьевой водой, при концентрациях фтора более 1,5 мг/л, в скелетной ткани могут развиваться патологические процессы, приводящие к заболеванию с общепринятым названием - флюороз. Различают два вида флюороза: скелетный и зубной. Зубной флюороз характеризуется пигментацией эмали и эрозией зубной ткани и развивается в первую очередь у детей в процессе формирования коренных зубов. При превышении концентраций фтора в питьевой воде, свыше 6 мг/л, могут происходить изменения в уже сформированных зубах у взрослого населения. При концентрациях фтора в питьевой воде от 1.5 до 2.0 мг/л у 30-40% населения наблюдается патология, а свыше 2.0 мг/л - у 80-90% населения эндемичного по флюорозу района. В случае превышения концентраций фторидов в питьевой воде более 4,5 мг/л или хроническим контактом с большими дозами фторидов на производствах, развивается скелетная форма флюороза, которая характеризуется нарушением баланса между резорбцией и ремоделированием костного матрикса, а, следовательно развитием остеопороза на начальных стадиях заболевания [1] и системными повреждениями и изменениями иммунобиологической реактивности организма на более поздних стадиях.
По характеристикам среды, из которой поступают фториды, флюороз подразделяется на эндемичный и профессиональный. Форма эндемичного флюороза зависит от концентраций фторидов в питьевой воде региона. В целом преобладает зубная форма заболевания, а скелетная форма встречается значительно реже и наиболее специфична для некоторых регионов Китая, Индии [10] и Танзании.
Профессиональный флюороз развивается у работников производств, которые в ходе своей профессиональной деятельности вынуждены работать с фторидами и вдыхать пары фтористых соединений (чаще всего в электролизных производствах алюминиевых заводов [2]; при производстве фтороводород-ной кислоты) и характеризуется тем, что существует только в скелетной форме. Заболевание преимущественно поражающее опорно-двигательный аппарат, развивается постепенно, и достигает финальной формы своего развития в течение 10-15 лет. По мере развития заболевания фтор образует устойчивые химические связи с ферментами и угнетает их активность, что в итоге приводит к нарушениям во многих органах и системах. Обычно страдают слизистые органов дыхания, появляется боль в горле и кашель, также пациенты отмечают боль в желудке и правом подреберье, появляются боли в суставах и слабость в мышцах. Для профессионального флюороза характерны 3 стадии: I (докостная) - сопровождается функциональными изменениями в органах и тканях, появлением боли в костях, суставах, мышцах, верхней части живота и правом подреберье; во II стадии выявляются изменения костной ткани в виде симмет-
январь, 2017 г.
ричных периостальных наслоений на трубчатых костях голеней, нарастает мышечная слабость, нарушаются функции печени и желудочно-кишечного тракта; на III стадии кроме изменений в костях, выявляются сужения костно-мозговых каналов, обызвествление связок, повышается плотность костной ткани, характерен генерализованный (распространенный) системный остеосклероз [3].
По мере изучения явлений, связанных с фтористой интоксикаций, была выявлена способность фторидов и фтор индуцированных заболеваний оказывать значительное генотоксическое действие. Повреждения ДНК при хронической фтористой интоксикации изучались различными методиками и на различных объектах, изучению всего спектра которых и посвящена данная обзорная работа.
Методы поиска исследований
Поиск исследований проводился в базах данных PubMed и Российского индекса научного цитирования (РИНЦ). Запросы проводились по следующим темам: micronucleus test, chromosomal aberrations associated with fluoride, skeletal and dental fluorosis, Sister chromatid exchange with disease fluorosis.
В ходе выполнения обзора использовались 7 литературных источников. В них описаны генотоксиче-ские аспекты заболевания зубным и скелетным флюорозом разных групп людей, животных и клеточных линий. Изучается эта болезнь по всему миру, в том числе в Индии (в ней зафиксированы самые частые её проявления).
Анализ данных литературы
Manivannan Jothiramajayam с соавторами (2014) изучал генотоксические эффекты фторида натрия (NaF), исследуя мононуклеарные лимфоциты пере-ферической крови людей (20-25лет), проживающих в условиях повышенной экспозиции фтористыми соединениями. Акцент в исследовании сделан на мито-хондриальной функции, уровне окислительного стресса, прогрессии клеточного цикла и апоптозе клеток. Проводился микроядерный тест согласно общепринятой методике (Fenech M., 2007) с небольшими изменениями и метод ДНК-комет. Культивируемые клеточные культуры обрабатывали 0, 0.1, 0.5, 1, 5, и 10 мкг/мл концентрациями NaF. Данные показали, что NaF при исследуемых концентрациях обладает цитотоксическими и генотоксическими эффектами. При концентрациях NaF более 1 мкг/л был увеличен индекс апоптоза, что вероятно объясняется индукцией окислительного стресса, который в свою очередь вызывает повреждения ДНК и способен активизировать гены отвечающие за клеточную гибель [8].
В другой работе Manivannan J. изучал генотокси-ческий потенциал фторида натрия в клетках костного мозга мышей с помощью микроядерного теста, метода хромосомных аберраций и метода ДНК-комет. Кроме того, был оценён окислительный ущерб нанесённый организму в области мягких тканей и некоторых органов, таких как селезенка, клетки печени и почек. Окислительное повреждение оценивали с помощью селективных биохимических показателей пу-
№ 1 (31)
тем измерения перекисного окисления липидов, снижение уровня глутатиона (GSH), глутатиона S-транс-феразы (GST) и активность каталазы в печени (CAT). Взрослых мышей породы швейцарский альбинос подвергали воздействию фторида натрия в через питьевую воде в концентрациях 4, 12 и 20 мг / л в течение 30 дней подряд. Костный мозг и образцы мягких тканей собирали и подвергали серии анализов. Наблюдали, что NaF, при различных концентрациях, у испытуемых вызвал значительное увеличение частоты микроядер (MN) в полихроматофильных эритроцитах. Повреждение ДНК наблюдалось в клетках костного мозга, а в клетках селезёнки, почках и печени повреждений не обнаружено. Кроме того обнаружено увеличение перекисного окисления липидов и каталазной активности, а также снижение активности глутатионов (GSH и GST) в печени мышей экспонированных фтором. Таким образом мыши, подвергшиеся воздействию фторида натрия, явились наглядными объектами, на которых была доказана генотоксическая и оксидативная активность фтористых соединений [7].
В работе, которую проводили японские учёные DQ Wu and Y Wu описываются жители города Хух-Хото во Внутренней Монголии, из которых 73 взрослых человека в течении жизни, употребляли питьевую воду с высоким содержанием фтора (4-15 мг/л), 53 из них страдали скелетной формой флюороза, а у 20 человек признаков заболевания выявлено не было. Контрольная группа составила 30 здоровых человек проживающих в районе находящемся в непосредственной близости от Хух-Хото, содержание фторидов в грунтовых водах которого не превышает 1 мг/л. Для исследования забиралась периферическая венозная кровь из которой выделялась культура лимфоцитов. В зафиксированных препаратах измеряли частоту микроядер и сестринских хроматидных обменов (СХО). В результате эксперимента было установлено, что у лиц с флюорозом и у здоровых, но проживающих в неблагополучном по содержанию фторидов районе, наблюдалась значимое увеличение частоты встречаемости СХО и микроядер, чем в контрольной группе, что может свидетельствовать о ге-нотоксичности фтора, содержащегося в воде. Значимых отличий по уровню микроядер и СХО между людьми страдающими флюорозом и группой здоровых людей, но проживающих на той же территории выявлено не было [11].
Anusha C Pawar с соавторами проводили изучение генотоксических свойств фтористых соединений содержащихся в питьевой воде города Налгонда. Для проведения исследования отбирали пробы периферической венозной крови у 73 мужчин, которые были выбраны случайным образом из лиц страдающих флюорозом и проживающих в административном центре района Андхра - Прадеш (Индия), в рацион которых входила вода со средней концентрацией фтора 4,13 ± 0,55 мг/л и диапазоном от 1.56 до 8.36 мг/л. В состав контрольной группы вошли 80 здоровых мужчин схожего возраста, проживающих вблизи загрязнённого района, но с уровнем содержания фтора в повседневно употребляемой питьевой воде <1 мг/л.
январь, 2017 г.
Наибольшая частота ХА наблюдалась в группе людей, страдающих флюорозом (3.57±0.27%), в сравнении с контрольной группой, где данный показатель снижается почти в 6 раз (0.68±0.09%) при р<0,01. Прослеживались следующие типы аббераций: на контрольную выборку в 80 человек приходится 4 ди-центрика (0,05%), 2 ацентрических фрагмента (0,02%), 16 пробелов (0,20%), 2 ацентрических кольца (0,02%), разрывов в хроматиде 28(0,35%), обменов не обнаружено. У 73 людей с заболеваниями показатели ХА увеличивается в 7 и более раз: 32 дицентрика (0,43%), ацентрических фрагментов 36 (0,49%), 8 ацентрических колец (0,10%), 72 пробела (0,98%), 105 разрывов в хроматиде (1,43%), обменов 8 (0,10%). В тех же группах изучали частоту СХО, которая в исследуемой группе составила 8.96 ± 0.68 хроматидных обменов на клетку, в контроле же показатель значительно ниже и составил 3.58 ± 0.67(р<0,001). [5]
В работе, представленной R.Albanese исследовали кластогенный потенциал фторида натрия in vitro (с использованием культивированных человеческих лимфоцитов периферической крови человека, полученные от здоровых доноров-добровольцев) и в естественных условиях (с использованием костного мозга крысы методом микроядерного теста). Частота ХА в культурах человеческих лимфоцитов подверженных воздействию 20 или 40 мкг/мл концентраций натрия фторида (3 и 9 % раствор соответственно) были значительно увеличены по сравнению с контрольными культурами. В то же время частота микроядер в полихроматофильных эритроцитах самцов крыс линии AP, подвергшихся внутрибрюшинной инъекции раствора NaF в дозировке 1000 мг/кг и 500 мг/кг NaF, была сопоставима с частотой микроядер у животных, которым вводили дистиллированную воду. Авторы исследования делают вывод что: фторид натрия вызывает кластогенные эффекты invi-tro, но не в естественных условиях [4].
В дальнейшем лабораторные животные так же использовались для изучения генотоксических и ци-тотоксических свойств фтористых соединений. Так Guo Hua Song и др., изучали почечно-клеточный апоптоз и повреждению ДНК у крыс мужского пола, которые были разделены на четыре группы по концентрации фторидов в потребляемой ими в течении 120 дней питьевой воде (контроль - 0 мг/л, низкое -50 мг/л, среднее 100 мг/л, и высокое 200 мг/лсодер-жание фторидов. Апоптоз в клетках почек исследовали с помощью проточной цитометрии, а повреждение ДНК обнаруживали с использованием метода ДНК-комет. Результаты исследования показали, что NaF зависимо повышает апоптоз и увеличивает повреждения ДНК [6].
В работе Ming Zhanga описаны механизмы, лежащие в основе нейротоксичности во время флюороза. Для того, чтобы исследовать индуцированное фторидами повреждение ДНК, распределение клеточного цикла и экспрессию ядерного фактора каппа В (NF-B), первичные нейроны гиппокампа крысы инкубировали с различными концентрациями (20 мг / л, 40 мг / л, и 80 мг / л) фторида натрия в течение 24 ч invitro. Результаты показали, что момент хвоста по
№ 1 (31)
Оливе (OTMS) был значительно повышен во всех фторид-обработанных группах по сравнению с контролем, в то время как значительное увеличение процентного содержания ДНК в хвосте соответственно наблюдали при уровнях фторида 40 мг/л и 80 мг/л. Увеличение доли клеток в S-фазе наблюдалось в ответ на дозу в 40 мг/л и 80 мг/л фтора, при данных дозах также была повышена экспрессия генов ядерного фактора каппа В. Результаты показали, что экспозиция фторидом натрия может вызвать остановку клеточного цикла в S фазе за счет повышения экспрессии регуляторного №-Б и приводить к повреждению ДНК в первичных нейронах гиппокампа крысы [9].
январь, 2017 г.
Заключение
В результате, проведённого анализа литературы сделаны выводы: что фторсодержащие соединения, действуя на биологические системы оказывают гено-токсическое и цитотоксическое воздействия, выражающиеся в наличие эффектов как в жизненном цикле клетки, так и непосредственно в её генетическом аппарате. Кроме того, было определено что на данный момент времени не существует единого мнения о генотоксических аспектах фтористой интоксикации, и как следствие данная проблема является актуальной и нуждается в дальнейшем изучении.
Список литературы:
1. Гажва С.И., Гадаева М.В. Этиопатогенетические механизмы развития флюороза зубов // Фундаментальные исследования. - Пенза. - 2014. - № 7. - С. 181-186.
2. Рослая Н.А., Лихачева Е.И., Оранский И.Е., Одинокая В.А. // Клинико-патогенетические особенности хронической профессиональной интоксикации соединениями фтора в современных условиях. - М. - Медицина труда и промышленная экология. - 2011. - №11. - С. 17-22.
3. Шалина Т. И., Васильева Л. С. Общие вопросы токсического действия фтора // Сибирский медицинский журнал. - Иркутск. - 2009. - Т.88. - №5. - С. 5-8.
4. Albanese R. Sodium fluoride and chromosome damage (in vitro human lymphocyte and in vivo micronucleus assays // Mutagenesis. - 1997. - T.2. - №6. - Р.497.
5. Anusha C Pawar, a S Jithender Kumar Naik, S Anitha Kumari Hyderabad, Andhra Pradesh. Cytogenetic analysis of human lymphocytes of fluorosis-affected men from the endemic fluorosis region in Nalgonda district of Andhra Pradesh // Research report Fluoride. - January-March 2014. - P.78-84.
6. Guo Hua Song , Ji Ping Gao, Chun Fang Wang , Chao Yang Chen , Xiao Yan Yan ,Min Guo ,Yu Wang, Fu Bing Huang. Sodium fluoride induces apoptosis in the kidney of rats through caspase-mediated pathways and DNA damage // Journal of Physiology and Biochemistry. - 2014.- Isssue 3. - Vol. 70. - P. 857-868.
7. Manivannan J, Sonali Sinha, Manosij Ghosh, Anita Mukherjee. Evaluation of multi-endpoint assay to detect geno-toxicity and oxidative stress in mice exposed to sodium fluoride // Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. - 2013. - Vol. 751. - Issue 1. - P. 59-65.
8. Manivannan J., Sonali Sinha, Manosij Ghosh, Anish Nag, Aditi Jana, Anita Mukherjee. Sodium Fluoride Promotes Apoptosis by Generation of Reactive Oxygen Species in Human Lymphocytes // Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A: Current Issues. - 2014. - Vol. 77. - P. 1269-80.
9. Ming Zhanga, Aiguo Wanga, Tao Xia, Ping Hea, Effects of fluoride on DNA damage, S-phase cell-cycle arrest and the expression of NF-B in primary cultured rat hippocampal neurons // Toxicol Lett. - 2008. - Vol. 179. - P.1-5.
10. Rao S.M., Sherlin H.J., Anuja N., Pratibha R. Morphometry of buccal mucosal cells in fluorosis - а new paradigm // Human and experimental toxicology. - 2011. - Т.30. - №11. - Р.1761-1768.
11. Wu D Q and Hohhot Y Wu, Inner Mongolia. Micronucleus and sister chromatid exchange frequency in endemic fluorosis // Fluoride Journal. - 1995. - Vol.28. - P. 125-27.
