CC BY
60
Существенное значение в почвенных процессах имеет также разложение целлюлозы. Наибольшие показатели относительной плотности целлюлозоразлагающей микрофлоры обнаружены в почве целинного участка, несколько ниже в почве лесополос. Видимо, это связано с наличием постоянного источника свежего растительного материала.
Таким образом, установлено, что комплексы бактерий и микромицетов в почвах, находящихся в сельскохозяйственном использовании, отличаются от естественных микробоценозов ненарушенных почв той же природной зоны и имеют ряд специфических особенностей. Состав и численность микроорганизмов тесно
связаны с агрохимическими показателями почв, которые накладывают определенный отпечаток на микробиологические и биохимические свойства чернозема обыкновенного.
ЛИТЕРАТУРА
1. Яковлев А.С. Биологическая диагностика и монито -ринг состояния почв // Почвоведение. - 2000. - № 1. - С. 70-79.
2. Биологические основы плодородия почвы / О.А. Бере-степкий, Ю.М. Возняковская, Л.М. Доросинский и др. - М.: Колос, 1984. - 287 с.
Кафедра биохимии и технической микробиологии
Поступила 30.03.05 г.
628.37/.38.002.612
ОЦЕНКА ГЕНОТОКСИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА СТОЧНЫХ ВОД МЯСОПЕРЕРАБА ТЫВАЮЩЕГО ПРЕДПРИЯТИЯ
О.Б. ИВАНЧЕНКО, Р.Э. ХАБИБУЛЛИН
Казанский государственный технологический университет
Основная доля ксенобиотиков поступает в окружающую среду с неочищенными и недостаточно очищенными сточными водами. Сточные воды мясоперерабатывающих предприятий, химический состав которых варьирует, являются мощным источником антропогенного и техногенного воздействия на природные водоемы.
Действующая ныне система контроля за загрязнением окружающей среды основана на комплексе ПДК - предельно допустимых концентраций веществ, содержание которых в среде ограничивается по токсикологическим, органолептическим, общесанитарным признакам. Однако стандартные наборы оценочных показателей не в полной мере отражают опасные, особенно токсикогенетические, последствия загрязнения природных объектов, так как известно, что наибольшую опасность для здоровья настоящего и будущих поколений представляют соединения, обладающие способностью вызывать отдаленные эффекты, т. е. мутагены и канцерогены. Рекомендуемое существующими нормативами определение токсичности не может заменить оценку генотоксичности в специальных тестах, поскольку между этими показателями не существует прямой корреляции
В большинстве случаев безопасность определяется предельно допустимыми нормами, разработанными для отдельных химических соединений. Однако в природе на организм действуют не отдельные вещества, а целый комплекс химических соединений, которые, влияя друг на друга, могут повышать или понижать мутагенный потенциал, поэтому оценка суммарной генотоксической активности представляет собой наибо-
лее перспективный подход к выявлению реального мутагенного потенциала сточных вод [1].
Цель настоящей работы - исследование генотоксических свойств сточных вод мясоперерабатывающего предприятия как с точки зрения их безопасности для окружающей среды, так и с точки зрения безопасности вторичных продуктов для человека.
Исследовали сточные воды Свияжского мясокомбината (пос. Нижние Вязовые, Республика Татарстан), прошедшие локальную механическую очистку и отделение жира в жироловушке.
Изучена как нативная сточная вода, так и ее эфирная и водная фракции. Эфирная фракция была получена экстракцией эфиром 5 мл сточной воды с последующим выпариванием досуха и растворением твердого остатка в диметилсульфоксиде (ДМСО). После растворения органического остатка 1 мл ДМСО содержал экстракт из 5 мл нативной сточной воды. Водная фракция представляла собой нативную сточную воду после выделения эфирной фракции
Стерилизацию сточной воды проводили методом холодной стерилизации путем пропускания проб воды через обеззоленный бумажный фильтр для удаления механических частиц, а затем через мембранный фильтр (8упрог) с диаметром пор 0,45 мкм.
ДНК-повреждающий тест. В суспензионной модификации теста использовали штаммы Е. со/г. м>р 2 ($гр Е), ро/ Л~ (/гр 65, 5м/, та/ В, ро1 Л1), иуг А- (/гр 65, ж/, иуг Л 155), гес Л- (/гр 65, гес Л), полученные из Института общей генетики (Москва): м>р 2 - дикий тип;
ро1 А- - штамм, дефектный по ДНК-полимеразе 1; гес Л- - отсутствует процесс пострепликативной репарации;
иуг Л- - нарушена эксцизионная репарация.
Принцип теста основан на избирательном ингибировании роста штаммов Е. со/1, дефектных по определенным генам, участвующим в репарации, по сравнению с ростом штамма дикого типа [2].
Индикаторные бактерии инкубировали в жидкой среде, содержащей различные концентрации сточной воды. Все посевы инкубировали при 37°С 6 ч. Интенсивность роста культуры определяли по величине оптической плотности микробной суспензии, измеренной при 590 нм на фотоэлектроколориметре.
Для определения силы влияния вещества на мутантный штамм использовали формулу
Х=-
м
деф
■1QQ ■ жд
Ждеф !Мдик
На мутантных по репарации штаммах ро/Л-, гес Л-, иуг Л- была изучена способность сточной воды, ее эфирной и водной фракций вызывать повреждения в ДНК. Результаты оценки представлены в таблице.
Таблица
Мутантные
штаммы
Выживаемость, %
Нативный
сток
Эфирная
фракция
Водная
фракция
pol A- 98,8 і 4,0 94,3 і б,3 9б,5 і 3,1
rec A- 98,2 і 1,5 93,б і 5,4 94,3 і 2,б
uvr A- 81,3 і 1,5 95,l і 2,5 98,9 і 1,0
где Одеф, Одик - оптическая плотность микробной суспензии дефектного и дикого штаммов в опыте; Кдик, Кдеф - оптическая плотность микробной суспензии дикого и дефектного штаммов в негативном контроле.
Процент выживаемости 98-100% указывает на отсутствие ДНК-повреждающей активности, 86-98% -активность слабая, менее 85% - наличие ДНК-повреж-дающего действия. В качестве позитивного контроля использовали водный раствор фурациллина (500 мкг/мл) [3].
Тест Salmonella/микросомы. Использовали ауксо-трофный по гистидину тестерный штамм Salmonella typhimurium TA 100 (his G 46, rfa, uvr, bio,pKM 101), регистрирующий мутации типа замены пар оснований. Эксперименты проводили согласно [4] в модификации [5].
Если число колоний-ревертантов в опыте превышает спонтанный фон мутирования в 2,5-10 раз, это говорит о слабой мутагенной активности изучаемого соединения, если в 10-100 раз, то вещество обладает мутагенной активностью средней силы, если в 100 раз и более, то это соединение - сильный мутаген. В качестве позитивного контроля использовали раствор нитро-зометилмочевины (5 мкг/мл).
Микросомную активирующую смесь для метаболической активации in vitro готовили на основе лиофи-лизированных микросомных фракций печени крыс, у которых система Р-450 была предварительно индуцирована фенобарбиталом. Микросомные фракции и тестерный штамм Salmonella typhimurium TA 100 были предоставлены Институтом экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (Пермь).
Определение свободного гистидина в образцах СВ методом тонкослойной хроматографии. Повышенное содержание гистидина в пробах может быть причиной ложноположительных результатов в тесте Эймса. Доза гистидина, необходимая для удвоения ре-вертантов, равна 150 нмоль/чашку (232 мкг/мл) [6]. Количество аминокислоты определяли методом тонкослойной хроматографии [7]. Минимальная обнаруживаемая этим методом концентрация гистидина составляет 7 мкг/мл.
Полученные данные показывают, что исходная сточная вода не влияла на мутантные штаммы рої А-, гес А- (выживаемость находится в интервале
96-100%). Однако на штамме с нарушенной эксцизи-онной репарацией выживаемость составила 81,3% и зарегистрировано ДНК-повреждающее действие.
Эфирная фракция исследованной воды проявила слабую ДНК-повреждающую активность на всех дефектных штаммах. Водная фракция сточной воды не повлияла на штаммы гес А-, тг А-, однако проявила слабую ДНК-повреждаюшую активность в отношении штамма, дефектного по ДНК-полимеразе 1.
Исследовав эфирную и водную фракции, можно заметить, что в отдельности они не проявляют сильного ДНК-повреждающего действия, максимальный эффект зарегистрирован в случае нативного стока. Вероятно, компоненты сточных вод с различными гидрофильно-гидрофобными свойствами проявляют синергизм и усиливают ДНК-повреждающий потенциал стока. Возникают повреждения в ДНК, для исправления которых необходимо полноценное функционирование эксцизионной репарации. Как с биологической, так и с гигиенической точки зрения оптимальным подходом изучения суммарной генотоксической активности сложных смесей-загрязнителей почвы и водоемов является оценка водных экстрактов, поскольку именно водорастворимая фракция представляет реальную угрозу попадания в организм человека в результате транслокации в грунтовые воды, затем в растения и включения в различные трофические цепи.
Методы тестирования мутагенного действия химических соединений с использованием в качестве тест-объекта микроорганизмов довольно широко распространены в мире. Это обусловлено тем, что микроорганизмы размножаются быстро, содержать их достаточно просто и дешево и в короткие сроки можно не только получить результат, но и предположить механизм действия [3, 8]. Тест Эймса в настоящее время широко используется в большинстве лабораторий мира как один из основных методов в просеивающих программах.
Исследование мутагенной активности сточной воды в тесте Эймса 5а1топе11а/микросомы на штамме ТА 100 дало следующие результаты, число коло-ний-ревертантов/чашку:
-S9* (опыты без метаболической активации):
нативный сток эфирная фракция водная фракция негативный контроль позитивный контроль +S9* (опыты с метаболической активацией in vitro):
нативный сток эфирная фракция водная фракция негативный контроль позитивный контроль
45.0 і 1,5
41.5 і 1,5
62.0 і 4,0
42.5 і 2,5 150,0 і 12,0
10.5 і 2,5
4.5 і 0,5
10.5 і 0,5 8,0 і 2,0
120,0 і 9,0
Мутагенной активности сточной воды не выявлено. Число колоний-ревертантов в опыте и контроле достоверно различается менее чем в 2,5 раза.
Модификация теста Эймса с метаболической активацией in vitro используется для определения генотоксического действия промутагенов, которые проявляют свой мутагенный эффект после биотрансформации в организме млекопитающих.
Большинство химических мутагенов являются веществами, чужеродными для живых организмов (ксенобиотиками), и при проникновении в макроорганизм они претерпевают ряд превращений под влиянием ферментов - монооксигеназ смешанных функций, в результате чего могут образовываться реакционноспособные структуры, взаимодействующие с белками и нуклеиновыми кислотами [9]. Чтобы учесть этот процесс, в среду культивирования микроорганизмов вносят микросомную фракцию (S9), полученную из клеток печени крыс.
Метаболическая активация in vitro ферментами клеток печени крыс также не выявила мутагенной активности исследуемой сточной воды.
Методом тонкослойной хроматографии определено количество гистидина в пробах сточной воды. Обнаруженная его концентрация - 15 мкг/мл - не влияет на результаты, полученные в тесте Эймса.
Сточные воды пищевых и мясоперерабатывающих предприятий характеризуются высоким содержанием органического вещества, что позволяет их использовать как удобрение, они также являются потенциальными источниками дешевых вторичных ресурсов -технического жира и белковых концентратов. Разработка технологий очистки сточных вод и утилизации промышленных отходов немыслима без использования экспресс-методик оценки генотоксических и мутагенных характеристик получаемых продуктов.
В настоящее время в странах СНГ и за рубежом проводятся подобные исследования, направленные на изучение генотоксической опасности стоков промышленных предприятий в тест-системах разного уровня организации. Они направлены на практическое обос-
нование необходимости введения контроля геноток-сичности в комплексную программу безопасности сточных вод и оценки природных комплексов [10-15].
Научно-обоснованный компромисс между необходимостью эффективной утилизации сточных вод и оптимизацией методов их анализа с целью ограничения опасных последствий антропогенного воздействия, включая риск увеличения мутационного груза популяций, должен стать залогом их безопасного применения и защиты окружающей среды.
ЛИТЕРАТУРА
1. Saffiotti V. Evaluation of mixed exposure to carcinogens and correlation of in vivo and in vitro systems // Environ. Health Perspect.
- 1983. - V. 47. - P. 319-324.
2. Mc Carol N.E., Piper C.E., Keech B.H. An Escherichia coli microsuspension assay for the detection of DNA damage induced by direct acting agents and promutagens // Environ. Mutagen. - 1981. -№ 3.
- P. 607-617.
3. Абилев С.К., Порошенко Г.Г. Ускоренные методы про -гнозирования мутагенных и бластомогенных свойств химических соединений // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Токсикология. -1986. - 14. - 171 с.
4. Maron D.M., Ames B.N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test // Mutat. Res. - 1983. -№ 113. - P. 174210.
5. Методы первичного выявления генетической активно -сти загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем / Л.М. Фонштейн, С.К. Абилев, Е.В. Бобринев и др. - М., 1985. - 34 с.
6. Nylund L., Einisto P. Mutagenicity testing of protein-containing and biological samples using the AmeSalmonella plate incorporation test and the fluctuation test // Mutat. Res. - 1992. -V. 272, № 3. - P. 205-214.
7. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. Т. 1. - М.: Мир, 1981. - С. 482.
8. Quillardet P. and Hofnung M. The SOS-chromotest, a colorimetric bacterial assay for genotoxins: procedures // Mutat. Research. - 1985. - V. 147. - P. 65-78.
9. Мишин В.М., Ляхович В.В. Множественные формы цитохрома Р-450. - М.: Наука, 1985. - 180 с.
10. Waters L.C., Schenley R.L., Owen B.A. Biotesting of wastewater: a comparative study using the Salmonella and CHO assay systems // Environ. Mol. Mutagen. - 1989. - 123 p.
11. Tang F., Huang Z., Ouyand D.Q. Study on mutagenicity and identification of organic pollutants in wastewater of industrial area // J Tongji Med Univ. - 1991. - 187 p.
12. Abe A., Urano K. Influence of chemicals commonly found in a water environment on the Salmonella mutagenicity test // Sci Tjtal Environ. - 1994. - 169 p.
13. Nielsen M.H., Rank J. Screening of toxicity and genotoxicity in wastewater by the use of the Allium test // Hereditas. -1994. - 121 p.
14. Гольд З.Г., Глущенко Л.А., Морозова И.И., Шадрин И.А. Оценка токсичности природных вод пруда Бугач по био -тестам // Токсиколог. вестн. - 2000. - № 5. - С. 28-33.
15. Авчинников А.В., Журков В.С., Михайлова Р.И.
Оценка мутагенной активности питьевой воды, кондиционирован -ной по электроимпульсной технологии // Токсиколог. вестн. - 2001.
- № 2. - С. 7-9.
Кафедра технологии пищевых производств
Поступила 28.09.04 г.
