CC BY
110
УДК 614.7(517.3)
Б. Доржханд Ч. Батцэцэг 2, Ж. Купул 1
ОЦЕНКА МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПОЧВ Г. ЭРДЭНЭТ
1 Институт общественного здоровья (Улаанбаатар, Монголия) 2 Монгольский государственный университет (Улаанбаатар, Монголия)
Оценка мутагенной активности почвы, представленная в данной работе, является первым шагом характеристики окружающей среды, и генотоксического потенциала территории г.Эрдэнэт. Установлено, что как водные так и. органические экстракты, почв г.Эрдэнэт. проявляют, мутагенные действия на штаммах E.coli и S.typhimurium.
Ключевые слова: почва, мутагенность, токсичность, эффект
ASSESSMENT OF SOILS MUTAGENIC ACTIVITY IN ERDENET
B. Dorjhand 1, Ch. Battsetseg 2, J. Kupul 1
1 Public Health Institute1, Ulaanbaatar, Mongolia
2 National University of Mongolia, Ulaanbaatar, Mongolia
A soils mutagenic activity assessment, represented, in this paper, is the first step to describe environment and genotoxic potential of the territory of Erdenet. It is hereby established, that both aqueous and organic extracts of Erdenet's soils give mutagenic action on E.coli and. S.typhimurium. strains.
Key words: soil, mutagenic, genotoxic, effect
Глобальное загрязнение среды обитания человека чужеродными химическими соединениями приводит к значительному их накоплению в окружающей среде. Особую опасность представляют собой соединения, обладающие способностью вызывать отдаленные эффекты — мутагены, канцерогены и вещества, отрицательно влияющие на репродуктивные функции организма. Именно на них следует в первую очередь обратить внимание при разработке ведущих показателей загрязнения окружающей среды. В связи с этим представляется важным использование фактора генотоксичности как интегрального показателя экологического прогнозирования.
В большинстве случаев на мутагенность исследуются отдельные химические соединения. Однако в природе на организм действуют чаще всего не индивидуальные соединения, а целый комплекс. В природных объектах, таких, как вода, почва, воздух, отдельные химические соединения, относящиеся к различным классам, влияя друг на друга, модифицируют суммарный мутагенный потенциал, усиливая либо уменьшая его. Действующая ныне система контроля за состоянием природных комплексов, в частности, почвы, основана на оценке агрохимических, микробиологических и общебиологических показателей, а также системы предельно допустимых концентраций. Одним из основных критериев оценки степени загрязнения является показатель предельно допустимых концентраций отдельных химических веществ. Но существующий ныне подход оценки предельно допустимых концентраций отдельных компонентов далеко не в полной мере отражает неблагоприятные последствия загрязнения природных объектов. Известно немало примеров проявления мутагенных и канцерогенных свойств как отдельных химических
соединений, так и образцов природных комплексов в нетоксичных дозах, что свидетельствует о более опасных, а именно затрагивающих наследственность. Эффекты осознания правомочности и необходимости такого подхода в последние годы получают все более широкое распространение и практическую реализацию [1, 2, 11].
Целью работы является изучение мутагенной активности почв г. Эрдэнэт (Монголия).
Материалы и методы
Исследуемые образцы почв отобраны в г. Эрдэнэт, в августе 2008 г:
1. Почва вдоль городской автострады.
2. Почва на территории горно-обогатительного комбината г. Эрдэнэт.
3. Ил городских очистных сооружений.
4. Территория рынка стройтельных материалов.
5. Почва на пищевом рынке «Хулуг».
В тестах на токсичность и мутагенность исследовали водные и эфирные вытяжки отобранных проб. Исследуемые образцы почв обезвоживали до воздушно-сухого состояния при температуре 105 °С [3]. Для приготовления водной вытяжки (неорганическая составляющая) 1 г воздушно-сухой почвы экстрагировали 10 мл дистиллированной воды в течение 12 ч при комнатной температуре. Стерилизация проб проводилась путем фильтрации через стерильные мембранные фильтры Synpor.
Эфирная вытяжка (органическая составляющая) была получена экстракцией эфиром 5 г почвы. Экстракт при температуре 50 °С испаряли досуха, а органический остаток растворяли в С^4
Токсичность по отношению к микроорганизмам
Токсические свойства экстрактов были определены путем сравнения степени угнетения роста
штамма на полноценной питательной среде в присутствии исследуемого экстракта с таковым в контроле.
Тест Salmonella / микросомы В работе использовали ауксотрофный по гистидину тестерный штамм Salmonella typhimurium: TA100 (his G46, rfa, uvr, bio, pKM101) полученный из Института по биологическим испытаниям химических соединений (г. Казань). Штамм ТА100 регистрирует мутации типа замены пар оснований. Эксперименты проводили согласно Магоп and Ames [8] в модификации Фонштейна с соавт. [4].
Если число колоний-ревертантов в опыте превышает спонтанный фон мутирования в 2,5—10 раз, это говорит о слабой мутагенной активности изучаемого соединения, если в 10—100 раз — то вещество обладает мутагенной активностью средней силы, если в 100 и более раз, то это соединение — сильное мутагенное.
Микросомную активирующую смесь (MAC) для метаболической активации in vitro готовили на основе лиофилизированных микросомных фракций печени крыс, у которых система Р-450 была предварительно индуцирована фенобарбиталом. Микросомные фракции были предоставлены Институтом экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН (г. Пермь).
ДНК-повреждающий тест Оценку генотоксичности проводили в ДНК-повреждающем тесте на мутантных штаммах E. coli, в которых подавлено функционирование одной из систем репараций:
WP-trp E, дикий тип uvrA- — trp 65, sul, uvr A 155. recA- — trp 65, rec A polA- — trp 65, sul, mal B, pol A-1 Возможность исследуемого экстракта вызывать повреждения ДНК определялась как величина зоны ингибиции роста тестерного штамма E. coli, образуемой при внесении 0,05 мл экстракта на целлюлозный фильтр (d = 20 мм), помещенного в центр чашки Петри с питательной средой.
Определение свободного гистидина в образцах осадков сточных вод методом тонкослойной хроматографии
Повышенное содержание гистидина в пробах может быть причиной ложноположительных результатов в тесте Эймса. Доза гистидина, необходимая для удвоения ревертантов, равна 150 нмоль/чашку (232 мкг/мл) [10]. Количество гистидина определяли методом тонкослой хроматографии (ТСХ). Минимальная обнаруживаемая этим методом концентрация гистидина составляет 7 мкг/мл.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Токсичность почвенных образцов г. Эрдэнэт по отношению к Salmonella typhimurium
Тестирование образцов почв Эрдэнэт на гено-токсичность в бактериальных тестах предполагает предварительную оценку токсичности исследуемых веществ по отношению к тестерным штаммам бактерий.
Результаты такой оценки для образцов почв Эр-дэнэт представлены на рисунке 1. Полученные данные свидетельствуют, что токсичность экстрактов почв Эрдэнэт зависит от вида растворителя. Токсический эффект органических экстрактов более выражен по сравнению с водными вытяжками. Из водных экстрактов образец 5 обладал наибольшей токсичностью. Из органических экстрактов (CCL4) значительный токсический эффект проявили почвы вдоль городской автострады (образец 1), почвы на территории ГОК г. Эрдэнэт (образец 2) и почвы на территории пищевого рынка (образец 5).
ДНК-повреждающий эффект образцов почв г. Эрдэнэт
Известно, что не всякое повреждение ДНК реализуется в мутацию в виде клеточных систем репарации. В связи с этим, выяснение потенциальной возможности ДНК-повреждающего действия соединения и вклада систем репарации в их исправление проводили на штаммах микро-
&
Е
га
ю
70
60
50
40
§ 30
Si
1 20 Ä 10 0
ÜH2O
0CCL4
Образцы почв
Рис. 1. Токсичность почвенных образцов г. Эрдэнэт по отношению к Salmonella typhimurium ТА 100. За 100 % принят штамм с растворителем. Образцы почв: 1 - почва вдоль городской автострады; 2 - почва на территории ГОК г. Эрдэнэт; 3 - ил городских очистных сооружений; 4 - территория рынка стройтельного материала, 5 - почва на пищевом рынке «Хулуг».
организмов, несущих мутации в генах, ответственных за различные пути репарации ДНК. В данной работе использован тест на ДНК-повреждающую активность почвенных экстрактов в чашечной модификации.
Из результатов, представленных в таблицах 1 и 2, видно, что все образцы ингибировали рост дикого типа E. coli wp2, т. е. обладали токсическим эффектом.
Результаты тестирования водных вытяжек почв показывают, что наибольшую ДНК-повреждающую активность проявил образец 1. Все водные экстракты, за исключением пробы
4, обладали генотоксичностью. Большинство генотоксических эффекто было установлено на штамме uvr- (для образцов 2, 3, 5).
Таблица 1
Зона ингибиции роста (мм) мутантных штаммов Escherichia coli под воздействием водных экстрактов почв г. Эрдэнэт
Примечание: * - значительно отличается от зоны ингибиции роста E. coli wp2. Представлены средные значения трех экспериментов 5 < 18 %. Образцы почв: 1 - почва вдоль городской автострады; 2 - почва на территории горнообогатительного комбината г. Эрдэнэт; 3 -ил городских очистных сооружений; 4 - территория рынка стройтельного материала; 5 - почва на пищевом рынке «Хулуг».
Из данных, представленных в таблице 2 видно, что вытяжки СС14 содержат более токсические вещества, чем водные экстракты. В пробах 1 и 3 выявлена генотоксическая активность на штамме E. coli, мутантном по ДНК-полимеразе. Экстракты
1 ингибировал рост штаммов rec , образец 2 ингибировал рост мутантных штаммов uvr-.
Таблица 2
Зона ингибиции роста (мм) мутантных штаммов Escherichia coli под воздействием органических экстрактов почв г. Эрдэнэт (ttIJ
Образец ' wp2 rec por uvr
1 1,9 3* 3,2* 2,9
2 2,2 3,1 1,5 4,25*
3 3 3,5 4* 3,5
4 1,3 2,3 2 1,9
б 2,2 3 3 2,7
Примечание: * - значительно отличается от зоны ингибиции роста E. coli wp2. Представлены средные значения трех экспериментов 5 < 18 %. Образцы почв: 1 - почва вдоль городской автострады;
2 - почва на территории ГОК г. Эрдэнэт;
3 - ил городских очистных сооружений;
4 - территория рынка стройтельного материала; 5 - почва на пищевом рынке «Хулуг».
Подводя итоги, следует заключить, что из 5 образцов г. Эрдэнэт 3 (образцы 1, 2 и 3) обладали ДНК-повреждающей активностью как в водных, так и органических вариантах тестов.
Мутагенная активность образцов почв г. Эрдэнэт в микробных тест-системах
Способность изученных образцов почв г. Эрдэнэт индуцировать генные мутации была изучена на S. typhimurium ТА100. На рисунках 2 и 3 представлены результаты исследований мутагенной активности образцов почв.
Было показано, что водные вытяжки исследуемых образцов почв 1, 2 и 3 проявили мутагенную активность слабой и средней силы без и с метаболической активацией, причем активация ферментами печени крыс снижает мутагенную активность перечисленных образцов почв (рис. 2).
Образцы 4 и 5 не обладали генотоксической активностью, не проявили ее и при метаболической активации.
Образец ' wp2 rec por uvr
1 0 1* 1* 0,9
2 0,1 0,7 0,75 1,5*
3 0 0,6 0 2,25*
4 0,1 0,2 0,6 0,85
5 0,35 0,35 0,9 2,1*
14
1 2 3 4 5
Образцы почв
Вбез метаболической активации Е1с метаболической активацией
Рис. 2. Мутагенная активность водных экстрактов почв г. Эрдэнэт на штамме Salmonella typhimurium ТА 100 без и с метаболической активацией. Мутагенность выражалась в превышении числа ревертантов над спонтанным фоном (число раз, единицы). Образцы почв: 1 - почва вдоль городской автострады, 2 - почва на территории ГОК г. Эрдэнэт, 3 -ил городских очистных сооружений, 4 - территория рынка стройтельного материала, 5 - почва на пищевом рынке «Хулуг».
SF
л'
Ез
£
4
3.5 3
2.5 2
1.5 1
0,5
0
Образцы почв
метаболической активации 0с метаболической активацией
Рис. 3. Мутагенная активность органических экстрактов (СС14) почв г. Эрдэнэт на штамме Salmonella typhimurium ТА 100 без и с метаболической активацией. Мутагенность выражалась в превышении числа ревертантов над спонтанным фоном (число раз, единицы). Образцы почв: 1 - почва вдоль городской автострады; 2 - почва на территории горнообогатительного комбината г. Эрдэнэт; 3 - ил городских очистных сооружений; 4 - территория рынка стройтельного материала; 5 - почва на пищевом рынке «Хулуг».
Органические экстракты исследуемых почв г. Эрдэнэт не проявили генотоксическую активность на тестерном штамме бес метаболической активации. С метаболической активацией зарегистрировано слабое мутагенное действие лишь для образца 3 (рис. 3).
Анализ результатов определения гистидина в экстрактах почв Эрдэнэт показал, что концентрация гистидина в пробах составляет менее 7 мкг/мл. Следовательно, мутагенность водных экстрактов, зарегистрированная в тесте Эймса, не является артефактом.
Представленные результаты показывают всю опасность загрязнения почвы, т.к. именно в составе водной фракции потенциально опасные водорастворимые соединения, обладающие биологической и генетической активностью могут передаваться по пищевым цепям экосистемы, проникать и аккумулироваться в клетках растений и животных.
Несмотря на определенную целесообразность выделения и исследования на мутагенность отдельных химических соединений, содержающихся в почве, изучение суммарной мутагенной активности позволяет более реально оценить опасность загрязнения.
Подобные исследования по оценке суммарной мутагенной активности почв широко проводятся в мире. Так, в США проанализирована суммарная мутагенная активность городских почв и установлено возрастание мутагенной автивности в направлении от пригородов, а в городских районах — к промышленным зонам; наибольшая концентрация мутагенов была выявлена в 4—10 см от поверхности почв [6]. Канадские исследователи изучали суммарную мутагенную активность образцов почв в области Hamilton Harbour (Западный район Онтарио) с помощью теста Эймса [9]. Генотоксичность загрязненных почв в трех городах Италии оценивалась методом Эймса. Во всех образцах установлено постоянное, хотя невысокое содержание прямых и потенциальных мутагенов [7]. В Майнце (Германия)
оценивали суммарную мутагенную активность почв на штаммах S. typhimurium TA98 и TA100 и выявили большую концентрацию мутагенов в летний период и меньшую — в весенний, осенний и зимний периоды [5].
ВЫВОДЫ
1. Водные и органические вытяжки образцов почв г. Эрдэнэт обладают токсическим эффектом, зарегистрированным по ингибированию роста бактерий. Наиболее высокая величина эффекта определена в почвах вблизи городской автострады.
2. Как водные так и органические экстракты почв Эрдэнэт проявляют ДНК-повреждающее действие на штаммах E. coli, дефектных по различным типам репарации, величина которого наиболее выражена в почвах территорий, связанных с автотранспортом, а также в илах городских очистных сооружений.
3. На территории г. Эрдэнэт органические экстракты почв обнаруживали мутагенность лишь после метаболической активации микросомной фракцией печени крыс. Индукция генных мутаций водными вытяжками почв была гораздо выше. Для ряда образов почв г. Эрдэнэт (автострада, территория фабрики) количество индуцированных ревертантов S. typhimurium ТА 100 в 6—12 раз превышало спонтанный фон мутирования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Журков В.С. Оценка мутагенной активности химических факторов окружающей среды при их гигиеническом регламентировании // Медикобиологические исследования в гигиене. — М., 1986. - С. 222-251.
2. Куринный А.И. Эколого-генетическая оценка территории Украины по мутагенному фону // 6 съезд Украинского об-ва генетиков и селекционеров им. Вавилова, Полтава : тез. докл. — Киев, 1992. — Т. 3. — С. 179.
// Ecotoxicol. Environ. Saf. — 1996. — Vol. 33, N 3. —
3. Пристер Б.С. и др. Биотестирование почв в зоне промышленного предприятия // Основы биологического контроля загрязнения окружающей среды : сб. статей. — М. : Гидрометеоиздат, 1988. - С. 98-108.
4. Фонштейн Л.М. и др. Тест-система оценки мутагенной активности загрязнителей среды на Salmonella. - M., 1977. - C. 52.
5. Edenharder R. et al. Soil mutagens are airborne mutagens: varation of mutagenic activities induced in Salmonella typhimurium TA98 and TA100 by organic extract of agricultural and forest soils in dependence on location and season // Mutat. Rec. - 2000. -Vol. 472, N 1-2. - Р. 23-36.
6. Knize M.G. et al. The characterization of the mutagenic activity of soil / // Mutat. Rec. - 1987. -Vol. 192, N 1. - P. 23-30.
7. La Rocca C. et al. PAH content and mutagenicity of marine sediments from the Venice Lagoon
P. 236-245.
8. Maron D.M., Ames B.N. Revised metods for the Salmonella mutagenicity test // Mutat. Rec. — 1983. — N 113. — P. 174 — 210.
9. Marvin C.H. et al. Chemico/biological investigation of contaiminated sediment from the Hamilton Harbour area of western Lake Ontario // Environ. Mol. Mutagen. — 1993. — Vol. 22, N 2. — P. 61—70.
10. Nylund L., Einisto P. Mutagenicity testing of protein-containing and biological samples using the Ames/Salmonella plate incorporation test and the fluctuation test // Mutat. Res. — 1992. — Vol. 272, N 3. — P. 205 — 214.
11. Watanable T., Goto S., Matsumoto Y. Mutagenic activity of surface soil and guantification of 1,3-1,6,- and 1,8-dinitropyrene isomers in soil in Japan // Chem. Rec.Toxicol. — 2000. — N 4. — P. 281—286.
Сведения об авторах
Балдандорж Доржханд - магистр биологических наук, научный сотрудник Института общественного здоровья (210349, г. Улаанбаатар, Монголия, п/я 49/52; тел.: 8 (976) 11-451-911, 8 (976) 99-273-009).
Чойдаш Батцэцэг - кандидат биологических наук, старший преподователь Монгольского государственного университета.
Жалхаа Купул - кандидат медицинских наук, передовой научный сотрудник, заведующий сектором Института общественного здоровья (210349, г. Улаанбаатар, Монголия, п/я 49/52; тел.: 8 (976) 11-451-911, 8 (976) 99-273-009).
