CC BY
1679
5. Martusevich A.K., Peretyagin S.P., Peretyagin, P.V. Bioradikaly i antioksidanty, 2015, vol. 2, no.3, p. 50-55.
6. Nihei Y., Asai H., Ukai T., Marimoto H., Nakajima Y., Hanajiri T., Maekawa T. Sensors and actuators, 2008, no. 131, p. 285-289.
7. Sheremetev Y.A., Suslov F.I., Deriugina A.V., Sheremetev A.V. Biophysics, 2000, vol. 45, no. 1, p. 79-82.
8. Stoltz J.F., Donner M. Jurk. j of med. Sciences, 1991, vol. 15, no. 1, p. 26-32.
9. Xie L., Sun D., Yao W., Wen Z. Science in China, 2002, vol. 45, no. 1, p. 50-55.
УДК 616-079.4
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ВЫЯВЛЕНИЯ HELICOBACTER PYLORI В ОБРАЗЦАХ ФЕКАЛИЙ У ПАЦИЕНТОВ С ПАТОЛОГИЕЙ ГАСТРОДУОДЕНАЛЬНОЙ ЗОНЫ
Холявицкая Е.М., Колеватых Е.П.
ФГБОУ ВО «Кировский государственный медицинский университет» Минздрава России, Киров, Россия (610027, г. Киров, ул. К. Маркса, 112), e-mail:[email protected]
В работе приведены материалы по выявлению уровня содержания микроорганизмов Helicobacter pylori в образцах фекалий пациентов с хелико-бактер-ассоциированной патологией гастродуоде-нальной зоны. Проводили методы лабораторной диагностики: морфологический (цитологический и гистологический), микробиологический (культу-ральный, бактериологический), молекулярно-ге-нетический (полимеразная цепная реакция), иммунологический (иммунохроматографический CITO TEST H. pylori Ag, иммуноферментный анализ). В качестве контрольной группы (n=37) использовали клинический материал Hp-отрицательных пациентов. Всего было получено и проанализировано 156 биопроб от 78 человек. Установлено, что в кале больных можно обнаружить некультивируемые штаммы Helicobacter pylori, а также их антигены и ДНК. Показана вариабельность факторов патоген-ности хеликобактерий.
Ключевые слова: Helicobacter pylori, гастродуоде-нальная зона, эрадикация, иммунохроматография, иммуноферментный анализ, полимеразная цепная реакция.
EVALUATION OF EFFICIENCY OF DETECTION HELICOBACTER PYLORI IN SAMPLES OF FAECES IN PATIENTS WITH GASTRODUODENAL PATHOLOGY
Kholyavitskaya E.M., Kolevatykh E.P.
Kirov State Medical University, Kirov, Russia (610027, Kirov, K. Marx Street, 112), e-mail: [email protected]
The article presents the materials of identification of Helicobacter pylori in fecal samples of patients with gastroduodenal zone diseases associated with Helicobacter pylori. Were conducted The following laboratory examination have been conducted: morphological (cytological and histological), microbiological (cultural, bacteriological), molecular genetic (polymerase chain reaction), immunologic (immunochromotographic CITO TEST H. pylori Ag, immunofermentative analysis). Hp-negative patients are a control group (n=37). 156 bioassays from 78 people have been received and tested. Uncultured Helicobacter pylori strains as well as antigens and DNA can be detected in fecal samples of patients,. The variability of pathogenic factors of Helicobacter pylori has been described.
Key words: Helicobacter pylori, gastroduodenal zone, eradication, immunechromatography, an enzyme immunoassay, polymerase chain reaction.
Введение
Исследования последних лет показали, что хроническая инфекция Helicobacter pylori (Hp) является одной из самых распространенных, инфицируя до 50% человеческой популяции в развитых странах и до 90% - в развивающихся [2, 4, 13]. Установлено, что Hp является возбудителем хронического гастрита (ХГ), язвенной болезни желудка (ЯБЖ) и двенадцатиперстной кишки (ДПК), функциональной диспепсии, MALT-лимфомы, рака желудка [5, 10]. Для определения тактики лечения пациентов с вышеперечисленными заболеваниями важной диагностической задачей является подтверждение или исключение наличия инфицирования Hp. Диагностика проводится различными методами, которые отличаются чувствительностью и специфичностью и имеют свои показания к применению [1, 3, 11]. Используют морфологический, бактериологический, серологический, молекулярно-генетический, биохимический (дыхательный и уреазный тесты) методы определения Нр. В настоящее время приоритетными являются неинва-зивные методы обнаружения патогена [1, 6, 12].
Цель исследования: оценка специфичности им-мунохроматографической тест-системы CITO TEST H. pylori Ag для определения антигенов Нр в кале у больных с хеликобактер-ассоциированными заболеваниями гастродуоденальной зоны.
Материал и методы
Объектом исследования служили микроорганизмы Нр, выделенные из биоптатов желудка и двенадцатиперстной кишки человека при эндоскопическом исследовании, антиген Нр в кале человека. В исследование было включено 78 больных (44 мужчины и 34 женщины) в возрасте от 22 до 56 лет. У 41 пациента (первая группа) диагностировано одно из заболеваний, ассоциированных с Нр: 14 пациентов с пепти-ческими язвами двенадцатиперстной кишки, 15 - с хроническим атрофическим гастритом, 12 - с поверхностным гастритом антрального отдела желудка. В группу сравнения - вторая группа (n=37) вошли больные с патологическими процессами в гастродуоде-нальной зоне, не связанными с Hp-инфицированием. Всем пациентам было проведено эзофагогастродуо-деноскопическое исследование с взятием биоптатов слизистой оболочки желудка и ДПК; уреазный тест;
изучение морфологии биоптата; экспресс-определение антигенов Нр в кале с использованием имму-нохроматографической тест-системы CITO TEST H. ру1оп Ag, полимеразная цепная реакция (ПЦР). Биоптаты желудка и двенадцатиперстной кишки изолировали при эндоскопическом исследовании с помощью аппарата «Olympus GIF-Q150» (Япония). Образцы помещали в транспортную среду Керри-Блэр, проводили уреазный метод выявления Нр (пробу Закса). Изменение цвета среды считали положительным результатом (присутствие микроорганизма Helicobacter pylori). Затем биопробы доставляли в микробиологическую лабораторию, где проводили ориентировочную микроскопию, культивирование. Высев осуществляли на Кампилобак Агар (HiMedia, Индия), помещали в микроанаэростат с газогенераторными пакетами GasPack (Япония) с целью создания оптимальной микроаэрофильной атмосферы. Культивировали 3-5-7 дней, изучали колонии, идентифицировали с помощью биохимических тестов API Campy (bio Meriux, Франция). У выделенных штаммов Hp определяли факторы патогенности: токсигенность методом ПЦР, гемолитическую активность при росте бактерий на кровяном агаре. ПЦР проводили с помощью ПЦР-амплификатора в режиме real-time с использованием тест-наборов (НПФ «Литех», Россия), который позволяет выявить несколько бактериальных геномов как вегетативных, так и кокковых форм, в исследуемом материале (слизистая оболочка желудка и ДПК, кал). При выявлении антигенов Hp в кале соблюдали правила подготовки к исследованию: исключение из пищи продуктов с клетчаткой, красящих веществ, неорганических солей, медицинских препаратов, усиливающих перистальтику кишечника. Экспресс-определение антигенов H. ру^п в кале методом иммунохроматографии осуществлялось по схеме: экстракт образца вносили в тест-кассету, где он смешивался с конъюгатом (моноклональные антитела к антигенам меченные частицами коллоидного золота). При наличии антигенов происходило образование комплекса в виде окрашенной полосы.
По данным быстрого уреазного теста и гистологического исследования все больные первой группы (n=41) были инфицированы Н. pylori. Степень обсеменения слизистой желудка оценивали: + (I степень), ++ (II степень), +++ (III степень). Больным был назначен курс антихеликобактерной терапии, включающий ингибитор протонной помпы рабепразол и антибиотики (амоксициллин и кларитромицин) согласно рекомендациям Маастрихтского консенсуса-3 (2005). По окончании курса эрадикационной терапии, через 4-6 недель после прекращения приема лекарственных препаратов пациентам проводилось контрольное эндоскопическое исследование с биопсией и последующим гистологическим изучением биоптата слизистой желудка, а также определение антигенов ^ в кале при помощи CITO TEST H. руЬп Ag.
Анализ результатов исследования проводился с помощью прикладных программ Excel for Windows и Statistica 6.0. Проверка на нормальность распределения количественных данных осуществлялась с использованием критерия «хи-квадрат» для малых выборок (до 30 наблюдений). Результаты описательной статистики для количественных данных, подчиняющихся закону нормального распределения представлялись в виде средней арифметической (М) и стандартной ошибки средней (±m). С целью определения
достоверности отличия применяли критерий t Стью-дента для несвязанных выборок. Итоги описательной статистики с использованием качественных данных обозначались в виде доли и стандартной ошибки доли При выявлении достоверности отличия
применяли непараметрический критерий Манна-Уитни (малый объем выборок). В качестве критерия статистической значимости была выбрана вероятность случайной ошибки 0,1% (р<0,001).
Результаты и их обсуждение
Согласно литературным данным, имеются исследования, в которых указывается о 90% инфицировании хеликобактериями слизистых оболочек желудка и ДПК [8, 10, 11, 12]. В результате нашего исследования частота вегетации хеликобактерий на слизистых оболочках желудка и ДПК составила 90,3100% в зависимости от метода диагностики (рис. 1). Причем отбор биоптатов для бактериологического, молекулярно-генетического метода проводили после уреазного и гистологического методов. Поэтому показатели пробы Закса были идентичны итогам ПЦР
■ II (п-37) I I (п-41)
метод ПЦР
Рис.1. Частота вегетации Helicobacter pylori в биоптатах желудка и двенадцатиперстной кишки
Следует отметить, что показатели уреазного и гистологического метода в контрольной группе были слабоположительными и не имели диагностического значения (16,2-21,6%). Бактериологический анализ показал наличие малого микробного очага на слизистых оболочках желудка и ДПК представителей второй группы. Известно, что хеликобактерии могут переходить в некультивируемые покоящиеся формы жизни. Поэтому показатели ПЦР выше результатов бактериологического исследования в изолятах обеих групп.
Представляло интерес определение Нр в кале ввиду неинвазивности взятия биопроб (рис. 2).
Рис.2. Частота обнаружения Helicobacte гру1оп в кале
Констатируя факты изучения образцов фекалий, следует указать на отсутствие положительных микробиологических результатов среди пациентов
второй группы, в которой ПЦР улавливались сигналы копирования ДНК Нр у 11 представителей. ПЦР позволяет установить наличие вегетативных и покоящихся форм хеликобактерий. Антигены микроорганизмов могут быть выявлены у жизнеспособных и недавно погибших клеток.
Оценка состояния уровня микробного очага на слизистых оболочках желудка (СОЖ) и двенадцатиперстной кишки (СОДПК) показала интенсивность обсемененности среди больных первой группы (табл.). Необходимо указать у них преобладание Нр-колонизации средней и высокой степени распространения (43,2 и 56,8%) (табл.)
Таблица
Степень обсемененности Нр слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки
Группы Слабая Средняя Высокая
(+) (++) (+++)
I (n-37) 0 16 (43,2%) 21 (56,8%)
II (n-41) 8 (100%) 0 0
Всего было выделено 52 штамма Нр из проб желудка и ДПК: 40 - в первой группе, 12 - во второй. Изучение факторов патогенности показало их вариабельность в зависимости от локализации микроорганизмов в биотопах (рис. 3).
Гемолитической активностью обладали штаммы Нр, изолированные из биопроб пациентов первой группы (40 и 0%). Подвижность бактерий была выраженной у микробов, выделенных из желудка и ДПК. Штаммы из фекалий отличались отсутствием двигательной активности в нативном препарате «висячая капля». Причем в вязкой среде таксис бактерий усиливался у штаммов Нр первой группы. Кроме того, формы сферопластов и протопластов также чаще обнаруживали в фекалиях пациентов с заболеваниями гастродуоденальной области. Установлено, что геном Нр состоит из 1,6-1,7 млн. пар оснований, поэтому представляло интерес изучение токсигенности возбудителей по наличию генов островов патогенности cagPAI [3, 12]. Способность синтезировать токсины выявлена среди штаммов хеликобактерий из наблюдаемой группы пациентов (45 и 0%). Внутривидовое разнообразие Н. ру1оп обусловлено токсигенностью [4, 11]. Наши исследования показали отличия штаммов бактерий по гемолитической активности, токсичности. Вероятно, в перспективе научной деятельности, можно разделить хеликобактерии как группы гастропатогенных, гастротоксигенных, гастрогемо-литических штаммов.
По данным гистологического исследования биоптатов эффективность эрадикации возбудителя составила 89,7% случаев, а по экспресс-методике определения антигенов Нр в кале - 84,6%. Специфичность иммунохроматографического метода определения антигенов Нр в кале при сравнении с морфологическим - 94,3%. Способ определения антигена Нр в кале с помощью CITO TEST H. pylori Ag дает возможность выявлять больных с Н. ру1оп-инфекцией, позволяя успешно проводить курацию пациентов, контролируя ход терапии и эффективность применяемых схем лечения. Важным преимуществом данного метода является исключение возможного инструментального заражения другими инфекциями (СПИД, гепатиты и т. д.) [1, 9]. Выявление антигена Н. pylori в кале не представляет технических трудностей и позволяет получать результаты в краткие сроки. Указанные возможности метода могут обеспечить массовый контроль эрадикационной терапии как необходимое условие правильной терапии пациентов с Н. ру1оп-ассоциированными заболеваниями.
Выводы
1. Экспресс-определение антигенов Нр в кале с использованием иммунохроматографической тест-системы CITO TEST H. ру1оп Ag является чувствительным и специфичным методом для определения эффективности антихеликобактерной терапии.
2. У пациентов первой группы (n=41) выявлены гастротоксигенные, гастропатогенные, гастрогемо-литические штаммы H. pylori.
3. На слизистых оболочках желудка и ДПК в контрольной группе (n=37) вегетируют непатогенные штаммы H. pylori (бактерии-комменсалы).
Таким образом, комплексная диагностика хе-ликобактер-ассоциированных заболеваний, включающая молекулярно-генетические методы исследования (ПЦР) позволяет выявить некультивируемые формы Helicobacter pylori и факторы токсигенности.
Список литературы
1. Говорун В.М., Гущин А.Е., Кудрявцева Л.В., Дурова О.М., Иваников И.О., Исаков В.А. Диагностика Н. pylori молекулярным методом и с помощью количественного ИФА анализа концентрации антигена Н. pylori в кале: результаты сравнительного исследования // Генодиагностика в современной медицине: сб. тезисов докладов 3-й Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 2000. С. 295-296.
2. Грачева Н.М., Бондаренко В.М., Леонтьева Н.И., Малышев Н.А., Щербаков И.Т., Партин О. С., Хренников Б.Н. Хеликобактериоз: клиника, диагностика, лечение. Методические рекомендации. Москва, 2009. С. 25.
3. Исаева Г.Ш., Ефимова Н.Г., Абузарова Э.Р. Эффективность различных методов диагностики Helicobacter pylori-инфекции у больных хроническим холециститом // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. 2010. № 2-3. С. 38.
4. Кудрявцева Л.В., Щербаков П.Л., Иваников И.О, Говорун В.М. Helicobacter pylori-инфекция: современные аспекты диагностики и терапии. Москва, 2004. 145 c.
5. Лазебник Л.Б., Морозов И.А., Ильченко А.А., Хомерики С.Г. Проблемы и перспективы исследований инфекции Helicobacter pylori // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. Москва, 2006. № 1. С. 4-14.
Рис. 3 Характеристика факторов патогенности штаммов Helicobacter pylori
6. Леонтьева Н.И., Грачева Н.М., Щербаков И.Т., Хренников Б.Н. Результаты применения экспресс-методов лабораторной диагностики хелико-бактериоза // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. Москва. 2012. С. 10-12.
7. Леонтьева Н.И., Щербаков И.Т., Новикова Л.И., Грачева Н.М., Хренников Б.Н., Щербакова Э.Г., Потехин П.П. Оценка инвазивных и неинвазивных методов диагностика хеликобактерной инфекции // Современные технологии в медицине. Москва, 2011. С. 57-60.
8. Щербаков И.Т., Леонтьева Н.И., Грачева Н.М., Щербакова Э.Г., Хренников Б.Н., Партин О.С. Диагностика хеликобактерной инфекции гистологическим и уреазными экспресс-методами. Материалы VI Научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства». Москва, 2008. С. 66-67.
9. Adiloglu A.K., Isler M., Goren I., Candir O., Senol A., Onal S., Karahan N. Quantitative correlation of Helicobacter pylori stool antigen (HpSA) test with the severity of H. pylori-related gastritis // J. Exp. Med. 2007. Vol. 212, № 2. P. 159-167.
10. Babic T., Basic H., Miljkovic B., Kocic B., Tasic G. Detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy and resection specimens // Vojnosanit Pregl. 2005. Jan, Vol. 62, № 1. P. 39-43.
11. Bak-Romaniszyn L., Smolarz B., Kulig A., Planeta-Malecka I., Zeman K., Malecka-Panas E. Comparable evaluation of usefulness of traditional methods and polymerase chain reaction technique in detection of Helicobacter pylori infection // Pol. Merkur. Lekarski. 2007. May, Vol. 22, № 131. P. 350-353.
12. Bilal R. B. Khaar, Qureshi T.Z., Mirza S.A., Ahmad T., Latif Z., Jaffery I., Omar M. Accuracy of noninvasive 13c - urea breath test compared to invasive tests for helicobacter pylori detection // J. Coll. Physicians Surg. 2007. Feb, Vol. 17, № 2. P. 84-88.
13. Feldman R. Epidemiological observation and open questions about disease and infection caused by Helicobacter pylori. Helicobacter pylori: molecular and cellular biology // Horizon. Scientific Press. Wymondhamm. 2011. P. 86-92.
14. Garza-Gonzalez E., Bosques- Padilla F., Tijerina- Menchaca R., Flores-Gutierrez J., Maldonado-Garza H., Perez-Perez G. Comparision of endoscopy-based and serum-based methods for the diagnosis of Helicobacter pylori // Can. J. Gastroenterol. 2003. Vol. 17. P. 101-106.
References
1. Govorun VM., Gushchin A.E., Kudryavtseva L.V., Durova O.M., Ivanikov I.O., Isakov V.A. Diagnostika H. pylori molekulyarnym metodom i s pomoshch'yu kolichestvennogo IFA analiza kontsentratsii antigena N. pylori v kale: rezul'taty sravnitel'nogo issledovaniya [Diagnostics H. pylori molecular method and using quantitative ELISA analysis of antigen concentration N. pylori in feces: a comparative study]. The gene diagnostics in modern medicine: collection of abstracts of the 3rd all-Russian scientific-practical conference. Moscow, 2000, pp. 295-296.
2. Gracheva N.M., Bondarenko V.M., Leont'eva N.I., Malyshev N.A., Shcherbakov I.T., Partin O. S., Khrennikov B.N. Khelikobakterioz: klinika, diagnostika, lechenie. Metodicheskie rekomendatsii. [Helicobacter pylori infection: clinical features, diagnosis, treatment]. Methodical recommendations. Moscow, 2009, p.25.
3. Isaeva G.Sh., Efimova N.G., Abuzarova E.R. Gastroenterologiya Sankt-Peterburga, 2010, no 2-3, p. 38.
4. Kudryavtseva L.V., Shcherbakov P.L., Ivanikov I.O, Govorun VM. Helicobacterpylori-infektsiya: sovremennye aspekty diagnostiki i terapii [Helicobacterpylori infection: modern aspects of diagnosis and therapy]. Moscow, 2004. 145 p.
5. Lazebnik L.B., Morozov I.A., Il'chenko A.A., Khomeriki S.G. Eksperimental'naya i klinicheskaya gastroenterologiya, Moscow, 2006, no 1, pp. 4-14.
6. Leont'eva N.I., Gracheva N.M., Shcherbakov I.T., Khrennikov B.N. Epidemiologiya i infektsionnye bolezni. Aktual'nye voprosy, Moscow, 2012, pp. 10-12.
7. Leont'eva N.I., Shcherbakov I.T., Novikova L.I., Gracheva N.M., Khrennikov B.N., Shcherbakova E.G., Potekhin P.P. Sovremennye tekhnologii v meditsine, Moscow, 2011, pp. 57-60.
8. Shcherbakov I.T., Leont'eva N.I., Gracheva N.M., Shcherbakova E.G., Khrennikov B.N., Partin O.S. Materialy VI Nauchno- prakticheskoy konferentsii «Infektsionnye bolezni i antimikrobnye sredstva». Proc. of the VI Scientific and practical conference «Infectious diseases and antibacterial remedies». Moscow, 2008, pp. 66-67.
9. Adiloglu A.K., Isler M., Goren I., Candir O., Senol A., Onal S., Karahan N. Quantitative correlation of Helicobacter pylori stool antigen (HpSA) test with the severity of H. pylori-related gastritis. J. Exp. Med. 2007. Vol. 212, no 2. P. 159-167.
10. Babic T., Basic H., Miljkovic B., Kocic B., Tasic G. Detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy and resection specimens. Vojnosanit Pregl. 2005. Jan, vol. 62, no 1. P. 39-43.
11. Bak-Romaniszyn L., Smolarz B., Kulig A., Planeta-Malecka I., Zeman K., Malecka-Panas E. Comparable evaluation of usefulness of traditional methods and polymerase chain reaction technique in detection of Helicobacter pylori infection. Pol. Merkur. Lekarski. 2007. May, Vol. 22, no 131. P. 350-353.
12. Bilal R. B. Khaar, Qureshi T.Z., Mirza S.A., Ahmad T., Latif Z., Jaffery I., Omar M. Accuracy of non-invasive 13c - urea breath test compared to invasive tests for helicobacter pylori detection. J. Coll. Physicians Surg. 2007. Feb, Vol. 17, no 2. P. 84-88.
13. Feldman R. Epidemiological observation and open questions about disease and infection caused by Helicobacter pylori. Helicobacter pylori: molecular and cellular biology. Horizon. Scientific Press. Wymondhamm. 2011. P. 86-92.
14. Garza-Gonzalez E., Bosques- Padilla F., Tijerina- Menchaca R., Flores-Gutierrez J., Maldonado-Garza H., Perez-Perez G. Comparision of endoscopy-based and serum-based methods for the diagnosis of Helicobacter pylori. Can. J. Gastroenterol. 2003. Vol. 17. P. 101-106.
