CC BY
77
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ Ветеринарно-санитарная экспертиза ♦
УДК 619:576.807.9
Оценка эффективности схем бактериологического исследования на наличие сальмонелл
Е.М. Ленченко1, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры ветеринарной медицины (lenchenko-ekaterina@yandex.ru), Фан Ван Кхай2, аспирант департамента ветеринарной медицины (khuyennonggb@gmail.com), Ю.А. Ватников2, доктор ветеринарных наук, профессор, директор департамента ветеринарной медицины (Vatnikov@yandex.ru)
1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет пищевых производств» (109316, Москва, ул. Талалихина, д. 33).
2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов» (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8/2).
Цель исследования—провести индикацию и идентификацию сальмонелл, выделенных из сырья животного происхождения, приобретенного в сети розничной торговли во Вьетнаме в 2015 году.
Объектом исследования являлись пробы мяса птицы (n=115), говядины (n=115); свинины (n=115) (всего n=345). После культивирования образцов на среде неселективного обогащения проводили пересевы на селективные среды. Отбирали типичные колонии на средахXLD-agar, Rambach-agar для изучения ферментативных свойств на среде Клиглера, цитратном агаре, бульоне с мочевиной, лизиновом бульоне. Серотипы выделенных бактерий определяли с использованием антисывороток («BioRad»,Франция), («Sifin»,Германия). Вирулентные свойства изучали путем внутрибрюшинного заражения белых мышей в дозе 0,2 мл.
На основе апробации и подбора эффективных дифференциально-диагностических сред и тест-систем установлено, что из 345 проб 106 (30,7%) контаминированы бактериями рода Salmonella, в том числе 19 проб говядины (16,5 %); 35 проб свинины (30,4 %); 52 пробы мяса птицы (45,2 %). Идентифицированные бактерии были отнесены к сероварам: Salmonella albany— 62,3 %; S. enteritdis — 11,3 %; S. typhimurium — 9,4 %. При экспериментальном сальмонеллезе мышей выявлены точечные и пятнистые кровоизлияния на эпи- и эндокарде, наличие лобулярной пневмонии, катаральный или катарально-геморрагический гастроэнтерит, очаги некроза в печени, увеличенные желчный пузырь и селезенка, в почках под капсулой точечные кровоизлияния. Целесообразно исследовать контаминацию сырья продуктов животного происхождения на основе многоуровневых алгоритмов диагностики, в том числе биохимических, иммунохимических тестов, применяемых в виде микроанализа.
Ключевые слова: сальмонеллы, говядина, свинина, мясо птицы, дифференциальные среды Сокращения: ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, HACCP — Hazard Analysis and Critical Control Points (анализ рисков и критических контрольных точек), MSRV — Modified Semi-Solid Rappaport-Vassiliadis Medium (Среда модифицированная полужидкая Раппапор-та-Вассилиадиса), XLD-agar — Xylose-Lysine Deoxy-cholate Agar (ксилоза-лизин-деоксихолатный агар)
Введение
Сальмонеллезы, получившие название «болезни цивилизации», распространены настолько широко, что во многих странах мира приоритетной задачей является снижение заболеваемости и ограничение распространения возбудителя инфекции среди основных источников [3, 4, 6]. В рамках реализации «Плана пищевого мониторинга» проведено 45212 исследований, в том числе 3421 — по идентификации рисков; из числа положительных результатов 48,8 % приходится на микробиологические показатели, наиболее контаминированной является говядина — 33,6 % [2]. При бактериологических исследованиях продуктов животного происхождения, приобретенных на рынках и продовольственных предприятиях, установлено, что контаминация бактериями Salmonella spp. составила, %: говядины — 19,0; свинины — 27,3; мяса птицы — 47,1 [8.. .10].
Мониторинг безопасности пищевого сырья связан с разработкой показателей объективной оценки качества сырья и продукции на основе аналитических методов, соответствующих международным требованиям. Интег-
рация стран в мировое экономическое пространство, увеличивающийся экспортный потенциал обусловливают целесообразность гармонизации нормативной правовой базы, что позволит вступать в торговые отношения, обеспечивая высокий уровень безопасности и качества пищевых продуктов при импорте и экспорте [4, 6, 7]. Учитывая, что антигенная вариабельность и множественность факторов вирулентности бактерий значительно снижают эффективность диагностических исследований, приоритетным направлением научных изысканий следует считать стандартизацию мониторинга безопасности пищевого сырья и продуктов. Это неразрывно связано с разработкой комплекса показателей объективной и надежной оценки качества сырья и готовой продукции, что и определило актуальность темы исследований.
В рамках международной программы, реализуемой научными и учебными организациями Российской Федерации в области подготовки научно-педагогических ветеринарных кадров, актуальное направление — это исследование безопасности пищевого сырья, основой чего является признание эквивалентности аналитических методов, применяемых в разных странах.
Цель исследования
Провести индикацию и идентификацию сальмонелл, выделенных из сырья животного происхождения.
Материалы и методы
Объектом исследования являлись пробы мяса (п=345), приобретенного в сети розничной торговли во Вьетнаме: говядина (п=115); свинина (п=115); мясо птицы (п=115). Указан-
Е.М. Ленченко, Фан Ван Кхай, Ю.А. Ватников
ные образцы мяса массой 25,0 г, не консервируя и не замораживая, помещали в стерильные пакеты, добавляли 225,0 мл пептонной воды, гомогенизировали в течение 1 мин и культивировали при 37 °C в течение 24 ч.
После культивирования образцов на среде неселективного обогащения проводили пересевы на селективные среды: Мюллера-Кауфмана, тетратионатный бульон, MSRV-agar («Biokar Diagnostic», Франция). По 1,0 мл неселективной среды пересевали в 10,0 мл среды Мюллера-Кауфмана и тетратионатного бульона и равномерно наносили по 3 капли на поверхность MSRV-agar, культивировали при 41,5 °С в течение 24.. .48 ч. Через 24 ч по 0,1 мл со сред Мюллера-Кауфмана и тетратионатного бульона производили пересев на XLD-agar («Merck», Германия) и культивировали при 37 °С в течение 24 ч.
Типичные по морфологии колонии бактерий на среде MSRV-agar пересевали на Rambach-аgar («Merck», Германия), культивировали при 37 °С 24 ч. Отбирали типичные колонии на средах XLD-agar, Rambach-agar для изучения ферментативных свойств на среде Клиглера, цит-ратном агаре, бульоне с мочевиной, лизиновом бульоне. Серотип выделенных бактерий определяли с использованием антисывороток («BioRad»,Франция), (<^Шп»,Гер-мания). Вирулентные свойства изучали путем внутри-брюшинного заражения белых мышей в дозе 0,2 мл.
Результаты и обсуждение
Бактерии рода Salmonella характеризовались подвижностью, на среде MSRV-agar образовывали светлые зоны роста; на XLD-agar формировали колонии с черным центром и слегка прозрачной зоной красноватого цвета вокруг, на среде Rambach-agar — розово-красные колонии. Использование среды MSRV-agar позволяло дифференцировать сальмонеллы и другие подвижные микроорганизмы, рост которых ингибируется входящими в состав среды селективными агентами (хлорид магния, малахитовый зеленый, новобиоцин). Индикация сальмонелл на среде XLD-agar проводится по черной окраске колоний, обусловленной продукцией сероводорода при ферментации лизина, и отсутствием или малой интенсивностью ферментации ксилозы, лактозы, сахарозы (рис. 1).
Дифференцирующее действие среды Rambach-agar основано на ферментации сальмонеллами пропилен-гликоля до кислоты, которая, воздействуя на pH-инди-каторы, окрашивает колонии в красный цвет. Использование среды позволяло дифференцировать розово-красные колонии сальмонелл от сине-зеленых колоний эшерихий и оранжево-желтых колоний протея. Входящий в состав среды дезоксихолат натрия ингибиро-вал «роение» протея и рост бактерий S. aureus.
При серологической идентификации бактерий в реакции агглютинации помещали каплю физиологического раствора на тщательно очищенное предметное стекло и в течение 30.60 с диспергировали культуры микроорганизмов так, чтобы получилась гомогенная густая суспензия. При склеивании бактерий считали, что тестируемые штаммы обладают аутоагглютинацией. Штаммы, у которых не было выявлено аутоагглютинации, испытывали в реакции агглютинации с агглютинирующими адсорбированными поливалентными сальмонеллезными О-сыворотками.
Установлено, что из 345 проб 106 (30,7 %) контамини-рованы бактериями рода Salmonella, в том числе 19 проб говядины (16,5 %); 35 проб свинины (30,4 %); 52 пробы мя-
са птицы (45,2 %). Выявлены значительные различия в частоте выявления сальмонелл в трех категориях мяса: мясо птицы — 45,2 %; свинина — 30,4 %; говядина — 16,5 %.
Результаты серологической идентификации выделенных штаммов приведены в таблице 1.
1. Результаты серологической идентификации сальмонелл 1. The results of the serological identification of Salmonella
КатегориЯ Число S. albany S. typhimurium S. enteritidis Другие серовары
мяса проб n % n % n % n %
Говядина 19 11 57,9 3 15,8 2 10,5 3 15,8
Свинина 35 23 65,7 4 11,4 3 8,6 5 14,3
Мясо птицы 52 32 61,6 5 9,6 5 9,6 10 19,2
Всего 106 66 62,3 12 11,3 10 9,4 18 17,0
На основании результатов серологической идентификации к числу наиболее распространенных сероваров отнесены Salmonella albany — 62,3 %, выделенные из всех типов образцов; S. enteritdis — 11,3 %; S. typhimurium — 9,4 %. Учитывая, что бактерии S. typhimurium и S. enteritdis являются возбудителями токсикоинфекций человека, в рамках данного исследования мы изучали вирулентные свойства указанных штаммов. Исследованиями установлено, что внутрибрюшинное введение 0,2 мл суспензии бактерий S. typhimurium и S. enteritidis вызывает гибель 100,0 % мышей, при заражении бактериями S. typhimurium в первые 24 ч погибло 10 из 15 (66,67 %) мышей; бактериями S. enteritidis — 3 из 15 (20,0 %). При бактериологическом исследовании сальмонеллы были выделены из патологического материала в 100,0 % случаев (табл. 2).
2. Результаты изучения вирулентных свойств S. typhimurium и S. enteritdis 2. The results of the study of S. typhimurium and S. enteritdis virulent characteristics
Штаммы бактерий Число мышей Число павших мышей Летальность, % Выделение бактерий
За первые 0...24 ч В течние >24 ч Всего
ST1 5 3 2 5 100 +
ST2 5 4 1 5 100 +
ST3 5 3 2 5 100 +
SEI 5 1 4 5 100 +
SE2 5 0 5 5 100 +
SE3 5 2 3 5 100 +
Контроль 5 0 0 0 0 _
Примечание: вТ1 ...вТ3: 5. typhimurium, выделенные из говядины, свинины, мяса птицы, соответственно; вЕ1...вЕ3: 5. е^егШ^в, выделенные из говядины, свинины, мяса птицы, соответственно.
При патолого-анатомическом исследовании павших мышей отмечали точечные и пятнистые кровоизлияния на эпи- и эндокарде, селезенка увеличена, с точечными кровоизлияниями. Легкие имели мраморный рисунок с наличием лобулярной пневмонии. Выявляли очаги некроза в печени, желчный пузырь увеличен, в почках под капсулой точечные кровоизлияния. Поражения органов пищеварения характеризовались катаральным или катарально-геморрагическим гастроэнтеритом, в брюшной полости содержался серозный экссудат светло-желтого цвета, иногда с примесью крови (рис. 2).
На основании результатов проведенных исследований установлено, что бактерии 5. ЬурЫтигшт, S. епЬепи^э выделены из 11,3 % и 9,4 % проб мяса, соответственно; в связи с наличием токсигенных свойств указанные бактерии при недостаточной термической обработке продуктов животного происхождения способны вызвать токсикоинфекции человека, что объясняет вспышки пищевых отравлений.
Оценка эффективности схем бактериологического исследования на наличие сальмонелл
Рис. 1. Дифференциально-диагностические свойства среды XLD-agar: черные колонии — сальмонеллы, бесцветные — эшерихии
Img. 1. Differential diagnostic properties of the medium XLD-agar: black colonies — Salmonella, colorless — Escherichia
Рис. 2. Патолого-анатомические признаки сальмо-неллеза при экспериментальном заражении мыши Img. 2. Pathological signs of salmonella infection in experimental mice
Контаминация бактериями пищевого сырья при бессимптомной персистенции сальмонелл обусловливает социальную значимость профилактических мероприятий в начале «пищевой цепи» [2...7, 11, 12]. Установлено, что сальмонеллы, получившие генетическую информацию с определенным опероном, способны ферментировать лактозу, что не позволяет дифференцировать лактозопозитив-ные энтеробактерии [1]. Применение хромогенных сред, визуальной иммунохроматографии, полимеразной цепной реакции позволяет идентифицировать ДНК патогенных штаммов в течение 24 ч, при пороговой чувствительности 250 бактериальных клеток в исследуемом образце.
Заключение
Результаты исследований и анализ данных литературы свидетельствуют, что сальмонеллез является актуальной проблемой. Для разработки комплекса показателей объективной и надежной оценки качества сырья и готовой продукции, соответствующих требованиям передового уровня науки и технологии, международным стандартам, целесообразно продолжать исследования по оценке методов выявления возбудителей инфекционных болезней, в том числе по наличию сальмонелл. При разработке в соответствии с концепцией анализа риска в критических контрольных точках HACCP, предусматривающей систематическую идентификацию, оценку и управление опасными факторами, влияющими на безопасность продукции, целесообразно исследовать контаминацию сырья продуктов животного происхождения на основе многоуровневых алгоритмов диагностики, в том числе биохимических, иммунохимичес-ких тестов, применяемых в виде микроанализа.
Библиография
1. Афонюшкин, В.Н. Влияние дезинфицирующих средств на генетический материал патогенов, встречающихся в мясной промышленности / В.Н. Афонюшкин, К.А. Табанюхов, В.С. Черепушкина и др. // Российский ветеринарный журнал. СХЖ. — 2016. — №1. — С. 17-19.
2. Быков, Т.Г. Результаты государственного мониторинга безопасности продуктов животного происхождения и кормов за 2015 год / Т.Г. Быков, В.И. Белоусов, М.В. Оськина, С.Б. Базарбаев // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. — 2016. — № 2 (18). — С. 11-23.
3. Козак, С.С. Научное обоснование обеспечения микробиологической безопасности продукции птицеводства / С.С. Козак: автореф. дис. ... д-ра биол. наук (защищена 10.10.2013). — М.: кМб ГНУ ВНИ-ИПП, 2013. — 40 с.
4. Куликовский, А.В. Профилактика пищевых токсикоинфекций человека и концепция ХАССП / А.В. Куликовский // Ветеринария. — 2011. — № 1. — С. 19-21.
5. Ленченко, Е.М. Сравнительная характеристика дифференциально-диагностических питательных сред для индикации возбудителей сальмонеллеза птиц // Е.М. Ленченко, И.С. Плитов // Аграрная наука. — 2011. — Ns3. — С. 26-28.
6. Ленченко, Е.М. Сравнительная оценка методов контроля производства и выделения патогенных бактерий из мяса птицы / E.M. Ленченко, С.С. Козак, Д.И. Скородумов, О.Д. Скляров, Д. Диксон, Б. Шел-дон // Материалы IV Международного ветеринарного конгресса по птицеводству, 8-11 апреля 2008, Москва. — С. 76-83.
7. Субботин, В.В. Сальмонеллезы—актуальная проблема ветеринарной медицины / В.В. Субботин, М.Н. Лощи-нин, НА Соколова, СА Коломьщев // Ветеринария и кормление.—2013.—№4. — С. 59-61.
8. Hanh, T.T. Prevalence of Salmonella spp. slaughter pigs In Industrial and crafts / T.T. Hanh, N.T. Thanh, N.V. Bac, T.T. Huong Giang, T.T. Quy Duong // Journal of Engineering Science and Veterinary Medicine. — 2009. — Vol. 16. — No. 2. — pp. 51-56.
9. Kelly, L.A. Microbiological safety of poultry meat: risk assessment as a way forward / L.A. Kelly, E. Hartnett G. Gettynby // World's poultry science journal. — 2003. — Vol. 59. — No. 12. — pp. 495-508.
10. Ngoc, P.T. The prevalence of Salmonella in chicken meat production chain in several districts of the Hanoi city / P.T. Ngoc, T.T Quy Duong, T.T. Huong Giang, L.T.H. Quynh, T.T. Nhat, D.T. Thanh Son, L.V. Ba // Journal of Engineering Science and Veterinary Medicine. — 2016.—Vol. 5. — No. 18—pp. 35-42.
11. The Ministry of Agriculture and Rural Development: Anthology of Vietnamese agriculture standards.—2002.—Vol. 5. raising standards. pp. 2.
12. Thuy, D.N. Assessing the situation of some kind of infection pathogens in raw meat in Hanoi / D.N. Thuy, C.H. Phu, D.T. Hao, N.X. Huyen, N.B. Hue // Journal of Engineering Science and Veterinary Medicine. — 2006. — Vol. 13. — No. 3. — pp. 48-54.
References
1. Afonjushkin V.N., Tabanjuhov K.A., Cherepushkina V.S. et al. Rossijskijveterinarnyj zhurnal. SHZh., 2016, No.1, pp. 17-19.
2. Bykov T.G., Belousov V.I., Os'kina M.V., Bazarbaev S.B., Problemy veterinarnoj sanitarii, gigieny i jekologii., 2016, No. 2 (18), pp. 11-23.
3. Kozak, S.S. Nauchnoe obosnovanie obespechenija mikrobiologicheskoj bezopasnosti produkcii pticevod-stva (Scientific substantiation of providing microbiological safety of the production of the poultry raising), Extended abstract of Doctor's thesis in veterinary sciences (it is protected 10.10.2013). — M.: KMB GNU VNIIPP, 2013, 40 p.
4. Kulikovskij A.V., Veterinarija, 2011, No. 1, pp. 19-21.
5. Lenchenko E.M., Plitov I.S., Agrarnaja nauka, 2011, No. 3, pp. 26-28.
6. Lenchenko E.M., Kozak S.S., Skorodumov D.I., Skljarov O.D., Dikson D., Sheldon B., IV Mezhdunaro-dny veterinarny kongress po pticevodstvu (IV International Veterinary Congress for the poultry raising) Proceedings of the IV International Veterinary Congress for the poultry raising, April 8-11, 2008, Moscow, 2008, pp. 76-83.
7. Subbotin V.V., Loshhinin M.N., Sokolova N.A., Kolom'shhev S.A. Veterinarija ikormlenie, 2013, No. 4, pp. 59-61.
8. Hanh T.T., Thanh N.T., Bac N.V., Huong Giang T.T., Quy Duong T.T., Journal of Engineering Science and Veterinary Medicine, 2009, Vol. 16, No. 2, pp. 51-56.
9. Kelly L.A., Hartnett E., Gettynby G., World's poultry science journal, 2003, Vol. 59, No. 12, pp. 495-508.
10. Ngoc P.T., Quy Duong T.T, Huong Giang T.T., Quynh L.T.H., Nhat T.T., Thanh Son D.T., Ba L.V. Journal of Engineering Science and Veterinary Medicine, 2016, Vol. 5, No. 18, pp. 35-42.
11. The Ministry of Agriculture and Rural Development: Anthology of Vietnamese agriculture standards, 2002, Vol. 5, raising standards, pp. 2.
12. Thuy D.N., Phu C.H., Hao D.T., Huyen N.X., Hue N.B. Journal of Engineering Science and Veterinary Medicine, 2006, Vol. 13, No. 3, pp. 48-54
ABSRACT
E.M. Lenchenko1, Phan Van Khai2, Y.A. Vatnikov2
1 Moscow State University of Food Production (33, Talalikhina str., 109316, Moscow.
Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education "Russian Peoples' Friendship University", 117198, Moscow, Str. Miklukho-Maklaya. 8/2. People's Friendship University of Russian (115093, Moscow, Miklukho-Maklaya str., 8/2).
Evaluation of the Effectiveness of the Bacteriological Analysis Schemes for the Presence of Salmonella. The purpose of the study is to carry out the indication and identification of salmonellae isolated from animal raw materials purchased in retailers in Vietnam in 2015.
The object of investigation were samples of meat (n=345): beef (n=115); pork (n=115); poultry meat (n=115). After cultivation of samples on non-selective enrichment carried out reseeding on a selective medium. Selected typical colonies on XLD media-agar Rambach-agar for the study of enzymatic properties among Kligler, citrate agar; urea broth, a lysine broth. The serotypes isolated bacteria was determined using antisera ("BioRad", USA), ("Sifin",Germany). A virulent properties were studied by intraperitoneal infection of white mice in a dose of 0.2 ml.
Based on the testing and selection of effective differential diagnostic environments and test systems we found that from the 345 samples 106 (30,7 %) were contaminated with bacteria of the genus Salmonella, including 19 samples of beef (16,5 %); 35 samples of pork (30,4 %); 52 samples of poultry meat (45.2 %). Identified bacteria were related to serovars: Salmonella albany of 62.3 %; S. enteritidis — 11,3 %; S. typhimurium — 9.4 %. In experimental salmonellosis of mice we revealed a point and spotty hemorrhages in the epi- and endocardium, the presence of lobular pneumonia, catarrhal or catarrhal-hemorrhagic gastroenteritis, foci of necrosis in the liver, gall bladder enlarged; the spleen was increased, petechial hemorrhages were in the kidney under the capsule. It is advisable to investigate the contamination of raw foods of animal origin on the basis of structured diagnostic algorithms, including biochemical, immunochemical tests that are used in microanalysis.
Keywords: salmonella, beef, pork, poultry, differential culture medium.
