CC BY
1Коцарь Е.В.
Ассистент, к. мед. н. кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Харьковского
национального медицинского университета, Харьков, Украина
Кочнева Е.В.
Старший преподаватель, к. мед. н. кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Харьковского национального медицинского университета, Харьков, Украина
Венжега К.А. Ладыка Т.Н.
Сова К.С.
Студенты II курса медицинского факультета Харьковского национального медицинского университета, Харьков, Украина
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ЦЕФТРИАКСОНА И БАКТЕРИОФАГА В ОТНОШЕНИИ ШТАММОВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS
EFFICIENCY ASSESMENT OF COMBINED ACTION CEFTRIACON AND BACTERIOPHAGE ON
STAPHYLOCOCCUS AUREUS STRAINS
Kotsar E. V.
Assistant, PhD in Medicine. Department of microbiology, virology and immunology, Kharkiv
national medical university, Kharkiv, Ukraine
Kochneva E. V.
Senior Lecturer, PhD in Medicine. Department of microbiology, virology and immunology,
Kharkiv national medical university, Kharkiv, Ukraine
Venhzega K.
Ladyka T.
Sova K.
Students II year of Kharkiv national medical university, Kharkiv, Ukraine
АННОТАЦИЯ
Стафилококковая инфекция - одна из важнейших проблем медицинской практики. Staphylococcus aureus занимает ведущее место в структуре кожной патологии, и различных гнойно-воспалительных заболеваний органов и систем человека. На сегодняшний день остается нерешенной проблема высокой степени антибиоткорезистентности этих микроорганизмов. Проведенное исследование показало, что комбинация цефтриаксона и бактериофага имеет высокую антимикробную активность в отношении клинических штаммов S. аигеш. Также в ходе работы было установлено, что данная комбинация эффективна не только на планктонные клетки, но и на микроорганизмы в форме бипленок.
ABSTRACT
Staphylococcal infection is one of the most important problems in medical practice. Staphylococcus aureus takes a leading place in the structure of cutaneous pathology, and various purulent-inflammatory diseases of human organs and systems. To date the problem of the high degree of antibiotic resistance of these microorganisms remains unsolved. The conducted research showed that the combination of ceftriaxone and bacteriophage has a high antimicrobial activity against the clinical strains of S. aureus. Also during the work it was found that this combination is effective not only on plankton cells, but also on microorganisms in the form of biofilms.
Ключевые слова: Staphylococcus aureus, антибиотикорезистентность, цефтриаксон, бактериофаги.
Keywords: Staphylococcus aureus, antibiotic resistance, ceftriaxone, bacteriophages.
Актуальной проблемой современной медицины являются инфекций, вызванных золотистым стафилококком. Этот возбудитель наиболее значимый этиологический фактор в развитие гнойно-воспалительных заболеваний кожи и подкожно-жировой клетчатки [10]. Staphylococcus aureus также является одной из наиболее распространенных причин внутрибольничных инфекций [2]. Способность вырабатывать устойчивость к наиболее часто используемым антибиотикам и антисептикам характеризует особенность данного микроорганизма. Устойчивость бактерий к пенициллину опосредовано выработкой фермента пенициллиназы, относящегося к группе Р-лактамаз [1]. Этот фермент способен разрушать р-лактамное кольцо, которое
является важной частью структуры молекул многочисленных антибиотиков. В настоящее время установлено, что более 80% всех штаммов микроорганизмов, иccледованных в лабораториях, обладают полирезистентностью к антимикробным препаратам [8]. Особое значение имеет распространение стафилококков, резистентных к метициллину (или к оксациллину), и стафилококков со сниженной чувствительностью к ванкомицину [6].
Одним из факторов, повышающих устойчивость бактерий к неблагоприятному действию окружающей среды, является формирование специфически организованных биопленок на поверхности кожи. Биопленка имеет сложную архитектуру,
а патогенные микроорганизмы в ее составе обладают более высокой резистентностью к действию антибактериальных препаратов [9].
Эти особенности стафилококков служат причиной существенного ограничения выбора антибактериальных препаратов для лечения инфекций, вызванных этими штаммами микроорганизмов.
В последние годы отмечается тенденция роста антибиотикорезистентных штаммов, и в современной медицине не имеется достаточно средств для сдерживания этого процесса [16].
Возможной альтернативой антибиотикам и хи-миотерапевтическим препаратам на современном этапе представляются лечебные бактериофаги с широким спектром антимикробной активности, подавляющие как чувствительные, так и антибиоти-коустойчивые штаммы бактерий [3, 15].
Следует отметить, что вирусы бактерий, активные в отношении многочисленных возбудителей гнойно-воспалительных процессов, вызывающих респираторные, кишечные и урогенитальные инфекции, известны с начала ХХ века [4, 13]. Циклы репродукции специфических бактериофагов с их накоплением в месте локализации воспалительного процесса являются важной особенностью фаготерапии, отличающей ее от применения этиотропных химиотерапевтических средств, обладающих широким антимикробным спектром и часто затрагивающих нормальную микрофлору организма хозяина [14, 17].
Для лечения стафилококковых инфекций также широко используют антибиотики различных групп. Цефтриаксон - цефалоспориновый антибиотик III поколения, который часто применяют в хирургической, гинекологической практике, а так же для лечения многих гнойно-воспалительных заболеваний кожи и подкожно-жировой клетчатки. Возможно, что комбинированное использование це-фтриаксона и бактериофага повысит эффективность лечения заболеваний, этиологическим фактором которых является золотистый стафилококк.
Цель работы. Изучить комбинированное действие цефтриаксона и бактериофага на планктонные клетки S. aureus и микроорганизмы находящиеся в експериментально смоделированной биопленке в исследованиях in vitro.
Материалы и методы. Исследования проводили на 20 штаммах S. aureus, выделенных от больных с различными проявленими гнойно-воспалительных процессов кожи и подкожно-жировой клет-чаки и 2-х референтных штаммах (АТСС 25923 и АТСС 6538Р) в качестве контрольной группы.
Клинические штаммы стафилококков идентифицировали в соответствии рекомендаций 12-го издания «Определение бактерий Берджи» по комплексу культуральных и биохимических свойств (STAPHY test 16 Lachema, Чехия) [7].
Для изучения комбинированого действия цеф-триаксона и бактериофага на планктонные клетки и биопленки клинических изолятов и референтных штаммов S. aureus использовали полистироловые планшеты для иммуно-ферментного анализа.
Чувствительность штаммов S. aureus определяли к стафилококковому бактериофагу (фармацевтический завод "Биофарм" г. Белая Церковь, Украина).
Разведенную культуру S. aureus в концентрации соответствующей суспензии 0,5 по Мак Фарла-нду, вносили в лунки планшета по 100 мкл. Для отрицательного контроля использовали стерильный МПБ, в качестве положительного использовали бактериальную смесь. В лунки 1 ряда вносили 100 мкл цефтриаксона с концентрацией 257 мкг/мл. В лунки 2 ряда 100 мкл бактериофага, в лунки 3 ряда сначала вносили 100 мкл бактериофага, через 10 минут добавляли 100 мкл цефтриаксона с такой же концентрацией. Планшет инкубировали при температуре 35 °С в течение 24 часов. Жизнеспособность микроорганизмов оценивали по оптической плотности и количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) после соответствующих разведений.
С целью изучения эффективности литического действия бактериофагов и антибиотика на штаммы S. aureus в биопленках было проведено моделирование биопленок (с учетом рекомендаций Тец Г. В. и Романовой Ю. М.) [11, 12]. Для изучения действия бактериофагов на биопленку вносили культуру S. aureus с концентрацией, соответствующей стандарту мутности 0,5 по Мак Фарланду. Лунки пластикового планшета оставляли на 24 часа при 35 °С. На следующий день отбирали содержимое лунок, промывали трехкратно фосфатным буфером. В лунки 1 ряда к образовавшейся биопленке вносили 100 мкл цефтриаксона с концентрацией 257 мкг/мл, в лунки 2 ряда - 100 мкл бактериофага, в лунки 3 ряда сначала вносили 100 мкл бактериофага, затем добавляли 100 мкл цефтриаксона с концентрацией 257 мкг/мл. Планшет инкубировали при температуре 35 °С в течение 24 часов. После действия препаратов биопленки отмывали фосфатным буфером, добавляли 50 мкл мясо-пептонного бульона (МПБ) и гомогенезировали их. Полученные результаты оценивали по количеству КОЕ/мл и показателям средней оптической плотности.
Оптическую плотность измеряли с помощью микропланшетного ридера «Multiskan EX» (тип 355) при длине волны 540 нм. Полученные значения выражали в единицах оптической плотности (ед. ОП.)
Результаты исследований обрабатывали методом вариационной статистики с помощью программы MS Excel 2003 [5].
Результаты исследования. По результатам проведенного исследования было установлено, что действие противомикробных средств на планктонные клетки S. aureus отличалась. Так, референтные штаммы были более (р<0,05) чувствительными, чем клинические в связи с утратой их патогенных свойств.
Концентрации веществ, которые использовали для определения противомикробного действия на планктонные клетки и биопленки являются минимальными терапевтическими дозами, которые известны из источников литературы [7].
При изучении антимикробного действия цеф-триаксона на планктонные клетки 5". аигеш' средняя оптическая плотность составила (0,497±0,04) ед. ОП., что показывает его высокую эффективность по сравнению с показателями в конторольных образцах - (0,835±0,06) ед. ОП. Также отмечалось снижение количества КОЕ в исследуемых образцах по сравнению с конторолем. Достаточно высокое литическое действие в отношении клинических штаммов 5. аигеш' проявлялось к действию бактериофагов. Так, показатели средней оптической плотности были на уровне (0,548±0,03) ед. ОП., что является значительно меньшими значениями в срав-нени с контролем - (0,940±0,08) ед. ОП. Также
Таблица 1
Определение противомикробного действия цефтриаксона и бактериофага на планктонные клетки
наблюдалось снижение количества КОЕ в исследуемых образцах.
Наиболее высокую антимикробную эффективность в отношении штаммов золотистого стафилококка проявляла комбинация цефтриаксона и бактериофага. Показатели средней оптической плотности составили (0,312±0,06) ед. ОП., что практически в 2,6 раза ниже, чем значения контрольных образцов - (0,820±0,04) ед. ОП. При определении количества КОЕ после комбинированного действия цефтриаксона и бактериофага рост микроорганизмов не определялся (табл. 1).
Противомик-роб- Средняя оптиче- КОЕ Контроль (пита- КУО
ные действую- ская плотность на 1 мл питательной тельная среда + на 1 мл питатель-
щие вещества клинических среды при посеве 5. аигеш) ной среды при по-
(мкг/мл) штаммов исслед. образцов с (ед. ОП.) севе с конт-
5". аигеш' с проти- противомик. вещес- 1 = 540 нм рольных образцов
вомик. веществом твом без противомик-
(ед. ОП.) робных веществ
1 = 540 нм
Цефтриаксон 0,497±0,04 (2,6±0,1)х103* 0,835±0,06 (3,3±0,1)х106
Бактериофаг 0,548±0,03 (3,2±0,1)х103* 0,940±0,08 (3,6±0,2)х106
Цефтриаксон + Бактериофаг 0,312±0,06 рост отсутствует* 0,820±0,04 (3,2±0,3)х106
Примечание. * - разница достоверная (р<0,05) с контролем; представлено результаты исследования 3-х повторов.
Из литературных данных известно, что концентрация антибиотиков для воздействия на бактерии в форме биопленки в отдельных случаях может быть в 10-100 раз выше, чем для планктонных форм [11]. В ходе исследования для определения антимикробного действия цефтриаксона на микроорга-
низмы в форме биопленки использовали концентрацию превышающую минимальную ингибирую-щую в 10 раз.
Анализ результатов исследования показал, что действие антимикробных препаратов на микроорганизмы в форме биопленок менее эффективно, чем на планктонные клетки (табл. 2).
Таблица 2
Определение противомикробного действия цефтриаксона и бактериофага на биопленки клиниче-
Противомик-роб- Средняя оптиче- КОЕ Контроль (пита- КУО
ные действую- ская плотность на 1 мл питательной тельная среда + на 1 мл питатель-
щие вещества клинических среды при посеве 5. аигеш) ной среды при по-
(мкг/мл) штаммов исслед. образцов с (ед. ОП.) севе с конт-
5. аигеш с проти- противомик. вещес- 1 = 540 нм рольных образцов
вомик. веществом твом без противомик-
(ед. ОП.) робных веществ
1 = 540 нм
Цефтриаксон 0,815±0,07 (3,9±0,2)х107* 1,193±0,05 (3,4±0,2)х109
Бактериофаг 1,008±0,05 (4,1±0,3)х107* 1,186±0,06 (3,6±0,1)х109
Цефтриаксон + 0,926±0,06 (2,5±0,1)х107* 1,198±0,14 (3,2±0,3)х109
Бактериофаг
Примечание. * - разница достоверная (р<0,05) с контролем; представлено результаты исследования 3 -х повторов.
В ходе проведеного исследования установлено, что комбинированное действие цефтриаксона и бактериофага на микроорганизмы находящиеся в биопленке приводило к снижению показателей средней оптической плотности, а также количеству
КОЕ в исследуемых образцах по сравнению с контролем.
Выводы. Результаты проведеного исследования показали, что антибиотик цефалоспоринового
ряда цефтриаксон имеет выраженное антимикробное действие в отношении клинических штаммов S. aureus, о чем свидетельствует снижение оптической плотности и количества КОЕ в исследуемых образцах по сравнение с контролем. Также, высокой литической активностью обладал бактериофаг.
Наибольший противомикробный эффект наблюдался при комбинированном воздействии це-фтриаксона и бактериофага на клинические штаммы золотистого стафилококка. Отмечалось снижение показателей средней оптической плотности в сравнении с контрольными образцами, при определении количества КОЕ в исследуемых образцах признаки роста микроорганизмов не наблюдались.
Кроме того, было установлено, что комбинация цефтриаксона и бактериофага оказывет проти-вомикробное действие не только на планктонные формы золотистого стафилококка, но и на микроорганизмы мобилизированные в биопленке. Проведенный анализ результатов показал достоверное (р<0,05) снижение показателей средней оптической плотности и количества КОЕ по сравнению с конт-рольними образцами.
Перспективой данного исследования может стать комбинированное использование цефтриак-сона и бактериофага для местного лечения гнойно-воспалительных заболеваний кожи и подкожно-жировой клетчатки этиологическим фактором, которых является золотистый стафилококк.
Список литературы
1. Бабушкина И. В. Изучение антибактериального действия наночастиц меди и железа на клинические штаммы S. aureus / И. В. Бабушкина, В. В. Бородулин, Г. В. Коршунов, Д. М. Пучиньян // Саратовский медицинский журнал. - 2010. - Т. 6. -№1. - С.9-14.
2. Калшченко С. В. Розповсюдження антибю-тикорезистентних штаммiв в л^вальних устано-вах м. Харкова / С. В. Калжченко, Т. I. Антушева, С. Ю. Швненко, О. В. Голубка, Т. О. Антушева // Матерiали науково- практично1 конференцп «Здо-бутки та перспективи у боротьбi з шфекцшними за-хворюваннями». - Харшв. - 2017. - С. 91.
3. Красильников И. В. Препараты бактериофагов: краткий обзор современного состояния и перспектив развития / И. В. Красильников, К. А. Лыско, Е. В. Отрашевская, А. К. Лабастова // Сибирский медицинский журнал. - 2011. - Т. 26, №2(2). - С. 33-37.
4. Крылов В. Н. Фаготерапия с точки зрения генетики бактериофага: надежды, перспективы, проблемы безопасности, ограничения / В. Н. Крылов // Генетика. - 2001. - № 7. - C. 869-87.
5. Лапач С. Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel / С. Н. Лапач, А. В. Чубенко, П. Н. Бабич. - К.: МОРИОН, 2000. - 320 с.
6. Локальный мониторинг антибиотикочув-ствительности / О. И. Мангуренко, Е. А. Федчун, П. В. Левчук, В. Ф. Грицай // Актуальш питання фар-мацевтично1 i медично1 науки та практики. - 2011.
- Вип. XXIV, №1. - С. 126-128.
7. Наказ МОЗ Украши ввд 05.04.07 № 167 «Про затвердження методичних вказiвок «Визна-чення чутливосп мiкроорганiзмiв до антибак-терiальних препарапв». - [Електронний ресурс]. -Режим доступу: http ://mozdocs.kiev.ua.
8. Никулин А. А. Обзор Британского общества по антимикробной химиотерапии (BSAC) по диагностике и лечению инфекций, вызванных ме-тицилинорезистентными штамамми Staphylococcus aureus (MRSA) во внебольничных условиях / А. А. Никулин, А. В. Дехнич // Клиническая микробиологическая антимикробная химиотерапия. - 2010. -Т.12, №1. - С. 4-22.
9. Осолодченко Т. П. Вивчення впливу нових бюлопчно активних речовин на швидшсть фор-мування резистентносп S. аигеш до антибак-терiальних препарапв / Т. П. Осолодченко, I. Д. Андреева, I. С. Рябова, Г. М. Козубова, О. В. Порт // Матерiали науково-практично1 конференцп «Здо-бутки та перспективи у боротьбi з шфекцшними за-хворюваннями». - Харшв. - 2017. - С. 97.
10. Стукова Е. И. Патогенетическое значение золотистого стафилококка при атопическом дерматите / Е. И. Стукова, Ю. В. Кенисфект // Fundamental research. - 2013. - № 7. - С. 680-685.
11. Тец Г. В. Роль внеклеточной ДНК и липи-дов матрикса во взаимодействии бактерий биопленок с антибиотиками : автореф. дис. ... канд. мед. наук : 03.00.07 / Тец Георгий Викторович. - К., 2007. - 22 с.
12. Тец Г. В. Совместное действие антибиотиков и дезоксирибонуклеазы на бактерии / Г. В. Тец, К. Л. Артеменко // Антибиотики и химиотерапия. -2006. - Т.51, №6. - С. 3-6.
13. André M. C. Phage-antibiotic synergy (PAS): P-Lactam and quinolone antibiotics stimulate virulent phage growth / M. C. André, F. Tétart, S. N. Trojet, M. F. Prère, H. M. Krisch // Published: August 29, 2007. -[Електронний ресурс]. - Режим доступа: https://doi.org/10.1371/journal.pone.00 00799.
14. Matsuzaki S. Bacteriophage therapy: a revitalized therapy against bacterial infectious diseases / S. Matsuzaki, M. Rashel, J. Uchiyama et al. // J. Infect. Chemother. - 2005. - № 11(5). - Р. 211-19.
15. Richard M. Carlton Phage therapy: past history and future prospects / M. Carlton Richard // Ar-chivum immunologiae et therapiae experementalis. -1999. - № 47. - P. 267-274.
16. Volyanskiy Y. L. Studying the specific activity of antimicrobial drugs / Y. L. Volyanskiy, V. P. Shi-robokov, S. V. Biryukov // Guidelines. - Kyiv. - 2004.
- 38 с.
17. Young R. Bacteriophage lysis: mechanism and regulation / R. Young // Microbiol Rev. - 1992. -№ 56(3). - P. 430-81.
