CC BY
8Ученый XXI века • 2015 • № 7-8 (8-9) Биологические науки
УДК 579.61
К ВОПРОСУ О ВЛИЯНИИ АНТИБИОТИКОВ И ЛЕЧЕБНЫХ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИОФАГОВ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ШТАММОВ ЗОЛОТИСТОГО СТАФИЛОКОККА (STAPHYLOCOCCUS AUREUS)
В.Ю. Басараб1, Е.В. Лазарев2, Д.В. Штиба3, А.Е. Жданкин4, Е.С. Воробей5, О.С. Воронкова6
Аннотация
В результате изучения 13 штаммов Staphylococcus aureus, выделенных из репродуктивного тракта женщин определены их способность формировать биопленки, чувствительность к антибиотикам и коммерческим препаратам бактериофагов. Способные к пленкообразованию штаммы являются менее чувствительными ко всем изученным препаратам. Перспективными являются детальные исследования влияния различных веществ на биопленки этих штаммов, так как такие образования могут помочь в разработке стратегий лечения инфекционных заболеваний человека.
Ключевые слова
Стафилококки, пленкообразование, бактериофаги, антибиотики, инфекция.
Введение. Современные микробиологические отрасли исследований располагают данными, согласно которым известно, что большинство бактериальных агентов сущетсвуют в природе не в форме свободно-живущих, обособленных друг от друга клеток, а представляют собой
1 Басараб Владислав Юрьевич - студент кафедры микробиологии, вирусологии и биотехнологии Днепропетровского национального университета имени Олеся Гончара (Украина).
2 Лазарев Евгений Валерьевич - студент (специалист) кафедры микробиологии, вирусологии и биотехнологии Днепропетровского национального университета имени Олеся Гончара (Украина).
3 Штиба Дмитрий Витальевич - студент кафедры микробиологии, вирусологии и биотехнологии Днепропетровского национального университета имени Олеся Гончара (Украина).
4 Жданкин Антон Евгеньевич - магистрант, Днепропетровский национальный университет имени Олеся Гончара (Украина).
5 Воробей Елизавета Станиславовна - аспирант кафедры микробиологии, вирусологии и биотехнологии Днепропетровского национального университета имени Олеся Гончара (Украина).
6 Воронкова Ольга Сергеевна - кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и биотехнологии Днепропетровского национального университета имени Олеся Гончара (Украина).
специфически агломерированные многоуровневые образования - биопленки. Но сами бактериальные частички составляют лишь 5-35% от сухого веса биопленки. Остальная часть припадает на межклеточный мат-риксный макрокомпартмент (или просто межбактериальный матрикс) [9; 16]. Подобные естественные содружества бактерий тесно функционируют между собой и взаимодействуют с окружающей средой как единое целое, построенное по принципу высококоординированного консорциума (ВК) [10].
ВК как форма сосуществования предоставляет бактериям массу преимуществ. Во-первых, биопленка достаточно устойчива к влиянию спектра неблагоприятных факторов физического, химического и биологического происхождения, нежели свободноживущие бактериальные клетки. Во-вторых, ВК также резистентен к действию иммунной системы организма-хозяина и ряда антибактериальных препаратов [12; 14]. Бактерии в составе биопленок могут долго сохранять свою жизнедеятельность при комбинированном действии антибактериальных соединений в очень высоких концентрациях, которых нельзя достичь в организме человека при стандартных дозированиях [11].
Основным фактором устойчивости и прочности биопленок служит экзополисахаридный матрикс (ЭМ), продуцируемый бактериальными клетками в ходе их прикрепления к субстрату. ЭМ характеризуется довольно сложным химическим строением (экзополисахариды + липопо-лисахариды + гликопротеины + протеогликаны) и способен изменяться в результате комплекса адаптивных реакций бактерий к условиям окружающей среды [3].
Несмотря на все усилия исследователей, проблема антибиотикоре-зистентности условно-патогенной микрофлоры является трудноконт-ролируемой. Поэтому сегодня ведется активный поиск альтернативных средств бактериальной терапии. В этом смысле наибольший интерес питают к себе бактериофаги. Широкий круг ученых считает, что использование фагов для лечения и профилактики бактериальных инфекций -это достаточно перпективное направление медицинской науки, которое с каждым годом приобретает все большую популярность [13; 15]. При этом следует обратить внимание на то, что безапеляционным условием успешного использования препаратов, полученных на основе бактериофагов, служит необходимость проверки выделенной культуры микроорганизмов на чувствительность к соответствующему бактериофагу или антибиотику.
Цель работы - исследовать биологические свойства штаммов зо-лотистогого стафилококка (Staphylococcus aureus), их способность к пленкообразованию; оценить чувствительность данного микроорганизма к действию разных групп антибиотиков и лечебных препаратов бактериофагов.
Объект и методы исследования. Представленная работа - это часть НИР «Теоретические и практические основы жизнедеятельности микробиоценозов, форм взаимоотношений с животными и растениями» («Те-оретичш та практичш основи життeдiяльностi мiкробiоценозiв, форм взаемовщносин з тваринами i рослинами»), № гос. регистрации 0112U000192, тема № 1-262-12.
В работе исследованы свойства 13 штаммов S. aureus, выделенных из репродуктивного тракта женщин, с коллекции культур кафедры микробиологии, вирусологии и биотехнологии Днепропетровского национального университета им. О. Гончара. Идентификацию бактериальных
агентов проводили по перечню признаков, приведенных в Определителе бактерий Берджи [4], с помощью тест-системы ApiStaph, производства BioMerieux (Франция).
Способность к пленкообразованию определяли с помощью 96-луночных планшетов. Для этого суточную культуру разводили в 0,5%-м физиологическом растворе по стандарту мутности 1*109 микробных клеток в 1 мл раствора. Полученную суспензию в количестве 50 мкл вносили в лунки 96-луночного планшета, содержащие 150 мкл мясопептон-ного бульйона. Инкубацию проводили при 37°С в течении 72 часов. Образованные биопленки аккуратно снимали бактериологической петлей, локализовали на обезжиренном предметном стекле и окрашивали кристаллическим фиолетовым с целью визуализации бактериальных клеток в составе биопленок.
Сходные исследования, связанные с оценкой степени пленкообра-зования, проводили на пластиковых чашках Петри диаметром 4,5 см. Для этого 0,4 мл суспензии исследуемого штамма, отвечающей показателю 1*109 клеток/мл согласно стандарту мутности, засевали в 1,6 мл мясопептонного бульйона. Инкубацию проводили в аналогичных условиях. После завершения инкубации остатки питательной среды бережно отбирали, трижды промывая буферным раствором для удаления планктонных клеток, затем окрашивали кристаллическим фиолетовым.
Чувствительность исследуемых штаммов к антибиотикам определяли диск-диффузионным методом согласно наказу Министерства здравоохранения Украины № 167 «Про затвердження методичних вказiвок «Визначення чутливост мiкроорганiзмiв до антибактерiальних препара™» [«Об утверждении методических указаний «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»] [6] с использованием стандартных дисков. При этом изучали чувствительность штаммов к пенициллинам (бензилпенициллин 10 ЕД), цефа-лоспоринам (цефазолин 30 мкг, цефуроксим 10 мкг, цефтриаксон 30 мкг), карбапенемам (имипенем 10 мкг), макролидам (эритромицин 15 мкг), тетрациклинам (доксициклин 30 мкг), аминогликозидам (не-тилмицин 30 мкг), линкозамидам (клиндамицин 2 мкг), фторхинолонам (офлоксацин 5 мкг), оксазолидонам (линезолид 30 мкг) (ЗАО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии», РФ). Чувствительность штаммов к фагам из лечебных препаратов «Бактериофаг стафилококковый жидкий» (БСЖ), «Пиобактериофаг поливалентный (ПП)» и «Инте-сти-бактериофаг жидкий (ИБЖ)» (НПО «Микроген», РФ) определяли капельным методом [7].
Усредненные данные всех проведенных исследований изображены на приведенных в тексте рисунках.
Результаты и их обсуждение. В соответствии с целью работы авторами изучены свойсства 13 штаммов S. aureus. При изучении пленкобра-зования исследуемых культур наличие пленок отмечено у 8 штаммов (61,5%). При микроскопии биопленок выявлены отдельные группы клеток золотистого стафилококка. При определении чувствительности к антибиотикам показано, что штаммы оказались наиболее чувствительными к цефазолину, имипенему, доксициклину, нетилмицину, клинда-мицину, офлоксацину и линезолиду. Чувствительность к ним колебалась в пределах 84,6-100%. Низкая чувствительность отмечена по отношению к бензилпенициллину и эритромицину (23,1%).
При распределении штаммов по способности к пленкообразова-нию выявлено различия между чувствительностью к антибиотикам у
пленкообразующих и непленкообразующих штаммов. Результаты чувствительности этих штаммов представлены на рис. 1.
Существенно отличается чувствительность этих групп штаммов к цефуроксиму. Среди пленкообразующих штаммов чувствительность не превышала 25%, тогда как среди непленкообразующих этот показатель был намного выше (80%). Чувствительность к клиндамицину хаактери-зовалась меньшей вариацией: 75% у пленкообразующих штаммов и 100% у непленкообразующих. В случае с линезолидом отмечалась обратная тенденция. Чувствительность пленкообразующих штаммов была выше, чем у непленкообразующих (100% и 80% соответственно) (см. рис. 1).
100
90
80-
70-
60
50-
40
30-
20-
10
пленкообразующие штаммы □ непленкообразующие штаммы
0
Рис. 1. Сравнительная характеристика чувствительности к антибиотикам пленкообразующих и непленкообразующих штаммов S. aureus (n = 13)
В каждом из вышеупомянутых случаев резистентность стафилококков коррелирует с нарушением взаимодействия антибиотика и его биомишени. Согласно литературным данным выделяют пять классических механизмов антибиотикорезистентности: модификация биомишени; инактивация антибиотика; активное выведение антибиотика с микробной клетки (эфлюкс); синтез ферментов, принимающих участие в формировании специфического метаболического пути («шунта»), активирующегося при попадании антибиотика внутрь бактериальной клетки [5]. Для клеток, входящих в состав биопленок, характерны все типы антибиотикорезистентности, а также ряд дополнительных вариаций, возникающих в процессе построения межклеточного матрикса пленки [8]. Так, например, к таким дополнительным механизмам устойчивости относится предотвращение попадания антибиотиков в глубокие слои
биопленок и блокировка их непосредственного контакта с клетками бактерий [8].
Авторами изучено чувствительность 13 штаммов S. aureus к «Пио-бактериофагу поливалентному» (ПП), «Интести-бактериофагу жидкому» (ИБЖ), «Бактериофагу стафилококковому жидкому» (БСЖ). Наибольшая чувствительность наблюдалась к БСЖ (46,2%), наименьшая - к ПП (23,1%).
Результаты чувствительности некоторых штаммов к действию фагов представлены на рис. 2.
БСЖ ИБЖ ПП
■ пленкообразующие штаммыы штаммы S непленкообразующие штаммы
Рис. 2. Сравнительная характеристика чувствительности к лечебным препаратам бактериофагов пленкообразующих и непленкообразующих штаммов S. aureus (n = 13):
БСЖ - «Бактериофаг стафилококковый жидкий», ИБЖ - «Интести-бактериофаг жидкий», ПП - «Пиобактериофаг поливалентный»
Согласно рис. 2. чувствительность к препаратам бактериофагов существенно отличалась у пленко- и непленкообразующих штаммов. Так, чувствительность к препарату БСЖ у пленкообразующих штаммов составила 37,5%, тогда как у непленкообразующих - 60%. Аналогичная картина наблюдалась для ИБЖ и ПП: чувствительность непленкообразующих штаммов выше (60% и 40% соответственно), чем пленкообразующих (25% и 12,5% соответственно).
Сравнительный анализ полученных данных с данными других исследователей [1; 2] показал, что чувствительность штаммов S. aureus к ПП составляет 81,3%, к БСЖ - 65,6%, а общая фагочувствительность стафилококков - 69%. У исследованных авторами штаммов показатели чувствительности ниже. При этом способные к пленкообразованию штаммы менее всего чувствительны ко всем изученным препаратам. У непленкообразующих штаммов, наоборот, наиболее высокие показатели чувствительности характерны для препаратов БСЖ и ИБЖ.
Таким образом, исследованиями авторов продемонстрировано, что штаммы S. aureus, способные к пленкообразованию, имеют высокую резистентность к элиминирующемму действию антибактериальных средств и лечебных препаратов бактериофагов, что, в свою очередь, усложняет борьбу с такими инфекционными агентами.
Заключение. Резюмируя выжеизложенный материал, следует заключить следующее:
1.Способность к пленкообразованию отмечена у 8 штаммов из 13-ти, что составило 61,5% от их общего числа.
2.При изучении чувствительности к антибиотикам показано, что пленкообразующие штаммы проявили наибольшую чувствительность к цефазолину, имипенему, доксициклину, нетилмицину, офлоксацину и линезолиду (свыше 87,5%); непленкообразующие штаммы характеризовались исключительной чувствительностью ко всем антибиотикам, исключая бензилпенициллин и эритромицин. Низкая чуствительность среди штаммов обеих групп наблюдалась к бензилпенициллину и эритромицину (23,1%).
3.При изучении чувствительности выделенных штаммов стаафи-лококка к лечебным препаратам бактериофагов выявлено, что наибольшая чувствительность бактерий наблюдалась к препарату «Бактериофаг стафилококковый жидкий» (46,2%). К «Пиобактериофагу поливалентному» стафилококки, наоборот, оказались резистентны (23,1%).
Полученные результаты свидетельствуют, что пленкообразующие штаммы бактерий являются более устойчивыми к действию антибактериальных средств и лечебных препаратов бактериофагов, что усложняет борьбу с ними. Поэтому перспективным направлением медико-микробиологических исследований служит проведение более детальных исследований влияния на планктонные культуры и уже сформированные биопленки этих штаммов разных веществ, что в будущем предоставит возможность разработать стратегии их использования для борьбы с заболеваниями человека, опосредованными пленкообразующими штаммами бактерий.
Список литературы:
1. Габриэлян Н.И. Исследование антибиотико- и фагочувствительности нозоко-миальных штаммов микробов, выделенных от пациентов трансплантологиче-ской клиники I Н.И. Габриэлян, Е.М. Горская, Т. С. Спирина [и др.] II Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2011. - Т. XIII, № 3. - С. 26-32.
2. Мидленко В.И. Чувствительность к препаратам бактериофагов возбудителей осложнений у больных после травм и оперативных вмешательств на опорно-двигательном аппарате I В.И. Мидленко, Г.А. Шевалаев, И.М. Ефремов II Фундаментальные исследования. - 2013. - № 9. - С. 871-874.
3. Немцева Н.В. Регуляция симбиотических взаимодействий в альгобактериаль-ных ассоциациях I Н.В. Немцева, Е.А. Селиванова, А.О. Плотников [и др.] II Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - № 4. -С. 62-66.
4. Определитель бактерий Берджи в 2-х т: пер. с англ. I под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. - М.: Мир, 1997. - Т. 2. - 368 с.
5. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии I [под ред. Л.С. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С. Н. Козлова]. - Смоленск: НИИАХ СГМА, 2002. - 586 с.
6. Про затвердження методичних вказiвок «Визначення чутливосп мiкроорганiзмiв до антибактерiальних препарата»: наказ Мшютерства охоро-ни здоров'я Укра'ни № 167 вщ 05. 04. 2007 р. - К.: МОЗ Укра'ни, 2007. - 63 с.
7. Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. - Кн. 1 I Колл. авторов I Под ред. А.С. Лабинской, Е.Г. Волиной. - М.: БИНОМ, 2008. - 1080 с.
8. Чеботарь И.В. Антибиотикорезистентность биопленочных бактерий I И.В. Чеботарь, А.Н. Маянский, Е. Д. Кончакова [и др.] II Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2012. - Том 14, № 1. - С. 51-58.
9. Costerton J.W. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections / J.W. Cos-terton, P.S. Stewart, E.P. Greenberg // Science. - 1999. - Vol. 284, № 5418. - P. 13181322.
10. Costerton J.W. Microbial biofilms / J.W. Costerton, Z. Lewandowski, D. E. Caldwell [et al.] // Annual Review of Microbiology. - 1995. - Vol. 49. - Р. 711-745.
11. Donlan R.M. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms / R.M. Donlan, J.W. Costerton // Clinical Microbiology Reviews. - 2002. - Vol. 15, № 2. - P. 167-193.
12. Fedtke I. Bacterial evasion of innate host defenses - the Staphylococcus aureus lesson / I. Fedtke, F. Gotz, A. Peschel // International Journal of Medical Microbiology. - 2004. - Vol. 294, № 1-2. - P. 189-194.
13. Kutateladze M. Bacteriophages as potential new therapeutics to replace or antibiotics / M. Kutateladze, R. Adamia // Trends in Biotechnology. - 2010. - Vol. 28, № 12. -P. 591-595.
14. Mah T.F. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents / T.F. Mah, G.A. O'Toole // Trends in Microbiology. - 2001. - Vol. 9. - P. 34-39.
15. Monk A. B. Bacteriophage applications: where are we now? / A.B. Monk, C.D. Rees, P.Barrov [et al.] // Letters in Applied Microbiology. - 2010. - Vol. 51. - P. 363-369.
16. Watnick P. Biofilm, city of microbes / P. Watnick, R. Kolter // Journal of Bacteriology. - 2000. - Vol. 182, № 10. - P. 2675-2679.
© В.Ю. Басараб, Е.В. Лазарев, Д.В. Штиба, А.Е. Жданкин, Е.С. Воробей, О.С. Воронкова
UDC 579.61
ON THE EFFECT OF ANTIBIOTICS AND MEDICAL BACTERIOPHAGE PREPARATIONS ON SENSIVITY OF THE STRAINS OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS
V.Yu. Basarab, Ye.V. Lazarev, D.V. Shtiba, A.Ye. Zhdankin, Ye.S. Vorobey, O.S. Voronkova
Abstract. As a result of the study of S. aureus 13 strains isolated from the reproductive tract of women, their ability to form biofilm, susceptibility to antibiotics and commercial preparations bacteriophages drugs were defined. Our results indicate that the film-forming strains of bacteria more resistant to action of antibiotic and bacteriophages drugs make troublesin fighting with them. Perspective is a detailed study of the influence of various substances on biofilm of these strains; as such education can help in developing strategies for the treatment of human infectious diseases.
Keywords: staphylococci, filmformation, bacteriophages, antibiotics, infection.
