CC BY
3БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 579.89, 579.62
ОЦЕНКА БИОТОКСИЧЕСКОГО ВЛИЯНИЯ КАТИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ НОРМОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА
ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
Клименко О.П., студент группы 15Био(ба)Мб, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: cloud456@mail.ru
Мокина Е.С., студент группы 15Био(ба)Мб, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: huinsaegyeou@yandex.ru
Вельш О.А., студент группы 16Био(ба)-2, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: 73welsh@mail.ru
Косинова М.С., студент группы 16Био(ба)-2, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: snitch957@gmail.com
Сизенцов Я.А., студент группы 17ФПХ(с)АХ, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: asizen@mail.ru
Научный руководитель: Барышева Е.С., д-р мед. наук, доцент, заведующий кафедрой биохимии и микробиологии, Оренбургский государственный университет, Оренбург
В статье представлены данные по исследованию биотоксичности тяжелых металлов в отношении представителей нормофлоры кишечника лабораторных крыс и их влияние на рост популяции исследуемых микроорганизмов
Ключевые слова: E. faecalis, E. cloacae, E. coli, L. acidophilus, тяжелые металлы, минимальные подавляющие концентрации, фазы роста.
В работах, посвященных проблемам загрязнения окружающей среды, на сегодняшний день к тяжелым металлам относят более 40 металлов периодической системы Д.И. Менделеева с атомной массой свыше 50 атомных единиц. При этом немаловажную роль в категорировании тяжелых металлов играют следующие условия: их высокая токсичность для живых организмов в относительно низких концентрациях, а также способность к биоаккумуляции и биомагнификации. По классификации Н.Реймерса, тяжелыми следует считать металлы с плотностью более 8 г/см3. Таким образом, к тяжелым металлам относятся: свинец, цинк, кадмий, ртуть, молибден, хром, марганец, никель, олово, кобальт, титан, медь, ванадий и так далее [1-3].
Ионы металлов являются непременными компонентами природных водоемов. В зависимости от условий среды (pH, окислительно-восстановительный потенциал, наличие лигандов) они существуют в разных степенях окисления и входят в состав разнообразных неорганических и металлорганических соединений, которые могут быть истинно растворенными, коллоидно-дисперсными или входить в состав минеральных и органических взвесей.
Тяжелые металлы обладают высокой способностью к многообразным химическим, физико-химическим и биологическим реакциям. Часть органических соединений, с которыми связываются металлы, представлена продуктами микробиологической
деятельности. Ртуть и другие металлы характеризуется способностью аккумулироваться в звеньях «пищевой цепи». Микроорганизмы почвы могут давать устойчивые к металлам популяции. Некоторые водоросли, грибы и бактерии способны аккумулировать ртуть и другие металлы в клетках, при этом «рекордсменами» по извлечению тяжелых металлов из окружающей среды являются микроорганизмы в том числе и входящие в состав пробиотическизх препаратов [4, 5].
На основании вышеизложенных данных перед нами была поставлена следующая цель: изучить влияние катионов тяжелых металлов на представителей факультативно -анаэробной кишечной нормофлоры крыс в условиях in vitro.
Для достижения поставленной цели были выдвинуты следующие задачи:
1) определить видовой состав микрофлоры лабораторных крыс;
2) определить минимальные подавляющие концентрации тяжелых металлов на рост и изучить их влияние на динамику роста микроорганизмов, входящих в состав нормофлоры кишечника лабораторных животных
В качестве материалов выступала факультативно-анаэробная нормофлора лабораторных крыс: E. faecalis, E. cloacae, E. coli, L. acidophilus. В качестве источника катионов тяжелых металлов использовались соли с высоким уровнем диссоциации в водных растворах: FeSO4 - сульфат железа, ZnSO4 - сульфат цинка, Pb(NO3)2 - нитрат свинца, CdSO4x8H2O - восьмиводный сульфат кадмия, CuSO4x5H2O - пятиводный сульфат меди.
Для определения минимальных подавляющих концентраций (МПК) тяжелых металлов мы использовали метод последовательных разведений, что позволило нам получить различные концентрации начального 0,02 М/л раствора солей исследуемых металлов.
Получение ряда разведений растворов тяжелых металлов (таблица 1), было необходимо с целью определения ингибирующих и субингибирующих концентраций, в отношении исследуемых микроорганизм, а также концентраций, которые не оказывают влияния на рост популяции. Это позволило создать оптимальные условия для культивирования исследуемых микроорганизмов в присутствии солей тяжелых металлов.
Из таблицы 1 следует, что концентрации солей свинца расположенные в анализируемом диапазоне до концентрации 0,005 М/л оказывали бактерицидный эффект на E. coli и E. faecalis. Такой же эффект оказывали концентрации солей железа, меди и цинка расположенные в анализируемом диапазоне до концентрации 0,0025 МУл (в случае E. faecalis до концентрации 0,0025, 0,0003 и 0,0006 М/л соответственно), концентрации кадмия до концентрации 0,0003 МУл (в случае E. faecalis до 0,00001 М/л).
Так же представленные данные следуют, что бактерицидный эффект на L. acidophilus оказывали концентрации солей железа и свинца, расположенные в диапазоне до концентрации 0,0025 М/л. Концентрации солей цинка оказывали бактерицидный эффект на L. acidophilus до концентрации 0,00125 М/л, концентрации солей меди и кадмия до 0,0003 М/л. Концентрации находящиеся ниже перечисленных значений не оказывали негативного влияния на рост популяции данного микроорганизма.
Бактерицидный эффект на E. cloacea оказывали концентрации солей железа и свинца, расположенные в диапазоне до 0,005 М/л. Концентрации солей цинка и меди оказывали бактерицидный эффект до 0,00125 М/л, концентрации солей кадмия до концентрации 0,0003 М/л. При меньших концентрациях наблюдался обильный рост данной культуры.
Концентрации солей металлов, располагающиеся между бактерицидными и концентрациями при которых наблюдался рост исследуемых микроорганизмов, являлись бактериостатическими или оказывали субингибирующее действие. Определение данных концентраций позволяло судить о степени биотоксичности катионов исследуемых металлов.
Обобщая и интерпретируя полученные данные можно констатировать, что из всех исследуемых микроорганизмов наиболее чувствительным штаммом по отношению ко всем используемым металлам является L. acidophilus. Металлами, проявляющими наименьшую
токсичность в отношении E.coli являлись железо, цинк, свинец и медь, в отношении E. faecium, E. cloaceae и L. acidophilus только свинец и железо. Наиболее токсичным металлом в отношении исследуемых микроорганизмов является кадмий.
Таблица 1 - Минимальные подавляющие концентрации тяжелых металлов, влияющие на рост исследуемых микроорганизмов, молях на литр
Штамм Соли металлов Концентрация
0,02 0,01 0,005 0,0025 0,00125 0,000625 0,0003 0,0001
E.coli FeSO^O - - - ± + + + +
ZnSO4 - - - ± + + + +
Pb(NO3)2 - - ± + + + + +
CdSO4- 8H2O - - - - - - ± +
CuSO4-5H2O - - - ± + + + +
E.faecalis FeSO4-H2O - - - ± + + + +
ZnSO4 - - - - - ± + +
Pb(NO3)2 - - ± + + + + +
CdSO4- 8H2O - - - - - - - -
CuSO4-5H2O - - - - - - ± +
E. cloacae FeSO4-H2O - - ± + + + + +
ZnSO4 - - - - ± + + +
Pb(NO3)2 - - ± + + + + +
CdSO4- 8H2O - - - - - - + +
CuSO4-5H2O - - - - ± + + +
L. FeSO4-H2O - - - ± + + + +
acidophilus ZnSO4 - - - - ± + + +
Pb(NO3)2 - - - ± + + + +
CdSO4- 8H2O - - - - - - ± +
CuSO45H2O - - - - - - ± +
«-» - ингибирующие концентрации «±» - субингибирующие концентрации
«+» - концентрации не оказывающие ингибирующего действия на рост популяции
Процесс аккумуляции катионов металлов бактериальными штаммами происходит в стационарной фазе роста. Данный процесс связан с тем, что в данной фазе происходит истощение субстрата и аккумуляция токсичных продуктов, что в свою очередь вынуждает микроорганизмы к поиску других источников энергии, а так же детоксикации среды обитания. На основании изложенного следующим этапом нашей работы являлось изучение роста популяций, с целью выявления оптимального времени роста в периодической культуре, и оценка влияние катионов тяжелых металлов на динамику роста исследуемых микроорганизмов.
Определение оптимального времени роста на периодической культуре осуществлялось путем культивирования исследуемых штаммов в периодической культуре на жидкой питательной среде с измерением оптической плотности каждые 3 часа. Измерения велись до получения не менее трех одинаковых значений оптической плотности, что свидетельствовало о наступлении стационарной фазы роста. По полученным результатам для каждого штамма были выстроены кривые роста.
Исходя из полученных данных следует, что лаг-фаза E. coli (рисунок 1) длилась около 3 часов, E. faecium 9 часов, а у L. acidophilus - 12 часов. Продолжительность эспоненциальной фазы роста составляла для E. coli и E.faecalis 6 часов, для L. acidophilus 12 часов. Время наступления стационарной фазы происходило у E.coli через 24 часа культивирования, у E. faecium через 27 часов, у L. acidophilus через 36 часов.
Изучение влияния солей тяжелых металлов на динамику роста исследуемых бактерий проводилось аналогично, для этого в среду культивирования вносилась рабочая концентрация исследуемого металла и осуществлялось культивирование до наступления стационарной фазы роста.
Анализ полученных данных свидетельствует, что влияние солей тяжелых металлов на время наступление и продолжительность фаз роста неоднозначно, при этом стимулирующее действие на рост Е.еоМ оказывали ионы свинца и железа (рисунок 1). При этом продолжительность лаг-фазы составляла 2 часа, экспоненциальной фазы - 13 часов, фазы замедленного роста - 3 часа. Стационарная фаза наступала через 18 часов культивирования.
,,,--,--,--*------------
........
^ ___^ д I ~ *М-■ —■— Контроль роста
" " " —»— FeSO4fl2O
_ " " " - -•— - -•— - -• —•- ZnSO4 / Pb(NO3)2
' CdSO48H2O
- *- CuSO4-5H2O
3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39
время исследования, часы
Рисунок 1 - Влияние катионов солей тяжелых металлов на рост E.coli
Выводы. Наиболее чувствительным представителем нормофлоры кишечника по отношению ко всем используемым металлам является L. acidophilus. Металлами, проявляющими наименьшую токсичность в отношении E.coli являлись железо, цинк, свинец и медь, в отношении E. faecium, E. cloaceae и L. acidophilus только свинец и железо. Наиболее токсичным металлом в отношении исследуемых микроорганизмов является кадмий.
Литература
1. Северин, Е.С. Биохимия: учебник / Е.С. Северин. - Москва: Гэо-тар-мед, 2004. -
784 с.
2. Quigley, J.G. Identification of a human heme exporter that is essential for erythropoiesis. / J.G. Quigley, Z. Yang, Mark T. Worthington // Cell. - 2004. - Vol. 118. - № 6. - pp. 757-766.
3. Портал фундаментального химического образования России [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.chem.msu.ru/ - (дата обращения: 15.02.17).
4. Collins, M.D. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approach for modulating the microbial ecology of the gut / M.D. Collins, G.R. Gibson // Am.J.Clin.Nutr. - 2003. - Vol. 69. -№ 5. - pp. 1052-1057.
5. Сизенцов, А.Н. Способность пробиотических препаратов на основе бактерий рода bacillus к биоаккумуляции ионов тяжелых металлов в организме лабораторных животных / А.Н. Сизенцов, Е.С. Барышева, А.Е. Бабушкина // Российский иммунологический журнал. -2015. - Т. 9. - № 2(1) (18). - С. 753-755.
