CC BY
9evaluation ofdifferent criteria for triggering individual-donation nucleic acid testing. Transfusion. 2009, 49 (6): 1160-1170.
9. Murray K.O., Mertens E., Despres P. West Nile virus and its emergence in the United States of America. Vet. Res. 2010, 41 (6): 67-81
10. Petersen L.R., Busch M.P. Transfusion-transmitted arboviruses. Vox Sanguinis. 2010, 98 (4): 495-503.
11. Pezzotti P., Piovesan C., Barzon L. et al. Prevalence of IgM and IgG antibodies to West Nile virus among blood donors in an affected area of north-eastern Italy, summer 2009. Euro Surveillance. 2011, S16 (10): pii: 19814.
12. Prince H.E., Tobler L.H., Yeh C. et al. Persistence of West Nile virus-specific antibodies in viremic blood donors. Clin. Vac. Immunol. 2007, 14 (9): 1228-1230.
13. Vamvakas E.C., Kleinman S., Hume H. et al. The development of West Nile virus safety policies by Canadian blood services: guiding principles and a comparison between Canada and the United States. Transfusion Med. Rev. 2006, 20 (2): 97-109.
14. West Nile virus and blood safety introduction to a preparedness plan in Europe. Based on the EU Satellite Meeting of the Working Group on Blood Safety and WNV, Thessaloniki, 25-26 January 2011 and on the teleconference, 18 January 2012, Final Working Document 2012 v.2.1.
15. Zou S., Foster G.A., Dodd R.Y. et al. West Nile fever characteristics among viremic persons identified through blood donor screening. J. Infect. Dis. 2010, 202 (9): 1354-1361.
Поступила 20.05.14
Контактная информация: Карань Л.С.
111123, Москва, Новогиреевская, 3а, р.т. (495)305-54-24
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
А.В.Касатов1,3, Э.С.Горовиц1, М.В.Кузнецова1,2, О.А.Тимашева2, С.Г.Суханов1,4
ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA, ИЗОЛИРОВАННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ ОСТЕОМИЕЛИТОМ ГРУДИНЫ И РЕБЕР
1Пермская государственная медицинская академия, 2Институт экологии и генетики микроорганизмов, Пермь; 3Пермская краевая клиническая больница; 4Федеральный центр сердечно-сосудистой хирургии
Цель. Изучение роли P. aeruginosa в развитии остеомиелита грудины и ребер у кардио-хирургических больных и анализ основных биологических свойств изолированных штаммов бактерий. Материалы и методы. В течение 2007 — 2013 гг. в результате бактериологического обследования 83 пациентов стационара выделено 132 бактериальные культуры. Материалом для исследования служило отделяемое ран. Забор, посев и идентификацию выделенных культур проводили с использованием соответствующих тест-систем; анти-биотикочувствительность изучали диско-диффузионным методом. Результаты. Доля P. aeruginosa составила 10,6% (n=14), что сопоставимо с данными по раневым инфекциям общехирургических стационаров. При оценке вирулентных свойств выделенных штаммов установлена прямая сильная коррелятивная связь (R=0,846, p=0,000132) между гемолитической и фосфолипазной активностью. Степень пленкообразующей способности в значительной мере варьировала от 0,122 до 1,412 ед. ОП; высоко пленкообразующими вариантами были 64,3% изученных культур. Статистически значимой связи между био-пленкообразованием и другими изученными признаками не выявлено. Четыре штамма продуцировали металло-беталактамазы VIM2 типа и имели идентичные RAPD-профили. Заключение. Учитывая, что ранее подобные культуры не обнаруживали и все они изолированы в короткий промежуток времени, мы сделали вывод, что, по-видимому, их кратковременная циркуляция связана с заносом, что и стало причиной инфицирования пациентов. Показано, что P. aeruginosa может быть этиопатогеном как ранних, так и поздних осложнений после кардиохирургических вмешательств.
Журн. микробиол., 2015, № 2, С. 69—74
Ключевые слова: Pseudomonas aeruginosa, внутрибольничные штаммы, остеомиелит грудины и ребер
A.V.Kasatov1'3, E.S.Gorovits1, M.V.Kuznetsova1'2, O.A.Timasheva2, S.G.Sukhanov1'4
EVALUATION OF BIOLOGICAL PROPERTIES OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA STRAINS ISOLATED FROM PATIENTS WITH STERNUM AND RIB OSTEOMYELITIS
1Perm State Medical Academy, 2Research Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm; 3Perm Regional Clinical Hospital; 4Federal Centre of Cardiovascular Surgery, Russia
Aim. Study of the role of P. aeruginosa in the development of osteomyelitis of sternum and ribs in cardio-surgery patients, and analysis of the main biological properties of the isolated bacterial strains. Materials and methods. 132 bacterial cultures were isolated from 83 hospital patients as a result of bacteriological examination during 2007 — 2013. Wound discharge was the study material. Sampling, seeding and identification of the isolated cultures was carried out by using the respective test-systems; antibiotic sensitivity was studied by disc-diffusion method. Results. The proportion of P. aeruginosa was 10.6% (n=14) that is comparable with data on wound infections of general surgery hospitals. A direct and strong correlation (R=0.846, p=0.000132) between hemolytic and phospholipase activity was established during evaluation of virulence properties of the isolated strains. The degree of film-forming ability varied significantly from 0.122 to 1.412 OD; 64.3% of the studied cultures were highly film-forming variants. Statistically significant association between biofilm formation and other studied properties was not found. 4 strains produced VIM2-type metallo-betalactamase and had identical RAPD profiles. Conclusion. Considering that earlier the similar cultures were not detected and all of them were isolated at a short interval of time, we have made a conclusion, that their short-term circulation is probably associated with introduction, which was the reason for patient infection. P. aeruginosa could be the etio-pathogen of both early and later complications of cardio-surgical interventions.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 2, P. 69—74
Key words: Pseudomonas aeruginosa, nosocomial strains, sternum and ribs osteomyelitis
Наиболее вероятными возбудителями остеомиелита грудины и ребер при открытых операциях на сердце являются грамположительные микроорганизмы (до 70%), главным образом, Staphylococcus aureus [1, 13]. В настоящее время, в том числе и за счет антистафилококковой профилактики, в этиологии гнойно-септических осложнений при кардиохирургических вмешательствах возрастает роль грамотрицательных бактерий, из которых наиболее значимым является P. aeruginosa [9]. При этом подобные осложнения, в частности, медиастинит, вызванный P. aeruginosa, чаще заканчивается летально, чем аналогичные заболевания, обусловленные иными микроорганизмами [10]. Прежде всего, это связано с особенностью биологических свойств данного вида бактерий, продукцией многочисленных факторов вирулентности и природной антибиотикоустойчивостью P. aeruginosa [2, 3]. Наибольшую опасность представляет инфицирование больных полирезистентными внутрибольничными штаммами P. aeruginosa, циркулирующими в отделении, когда источником является медицинский персонал, что нередко приводит к вспышкам синегнойной инфекции [8, 12].
Отличаясь политропизмом, P. aeruginosae могут колонизировать внутренние органы, кожные и слизистые покровы, индуцируя развитие гнойно-воспалительных заболеваний различной локализации [14]. В то же время, их роль в развитии гнойно-септических осложнений после кардиохирургических вмешательств, в частности, остеомиелита грудины, остается недостаточно исследованной. Самостоятельный интерес представляет и изучение биологических свойств штаммов синегнойных бак-
терий, изолированных от таких больных, их факторов персистенции, вирулентности, а также антибиотикочувствительности. При этом анализ фенотипов изолятов позволяет, с одной стороны, использовать их в качестве маркеров для изучения эпидемиологических аспектов, с другой — оценивать степень выраженности факторов вирулентности P. aeruginosa при данной патологии.
Цель работы — изучение роли P. aeruginosa в развитии остеомиелита грудины и ребер у кардиохирургических больных, анализ основных биологических свойств изолированных штаммов бактерий.
В течение 2007 — 2013 гг. проведено бактериологическое обследование 83 больных с остеомиелитом грудины и ребер, развившимся после операционных вмешательств у кардиохирургических больных. Подобные осложнения у 47 (56,6%) пациентов возникли спустя 2 — 4 месяца после оперативного вмешательства.
Материалом для исследования служило отделяемое ран. Забор, посев и идентификацию выделенных культур проводили в соответствии с положениями, регламентированными приказом № 535 МЗ СССР от 22.04.1985 г. Использовали соответствующие тест-системы: Энтеро-, Стафило-, Стрепто- и Неферм-тест 24 («Эрба Лахема», Чехия). Результаты учитывали с помощью бактериологического анализатора Multi-scan-Ascent фирмы «TERMO-Labsystems» (Финляндия) и компьютерной программы «Микроб-автомат», осуществляющей автоматическое считывание коммерческих идентификационных тест-систем.
Антибиотикочувствительность изучали диско-диффузионным методом в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Определение металло-беталактамаз у штаммов P. aeruginosa, резистентных к карбапенемам, осуществляли в соответствии с [6] методом радиальной диффузии, нагружая один из дисков с антибиотиком 0,5 М ЭДТА. У положительных в тесте штаммов проводили детекцию генов металло-беталактамаз (blaViM-2) с использованием праймеров VIM2f/VIM2r (фрагмент 801 п.н.), предложенных в [11]. Способность к пленкообразованию изолированных культур P. aeruginosa изучали в соответствии с [5]. В качестве факторов вирулентности определяли наличие гемолитической (ГА) и фосфолипазной активности (ФЛА). ГА определяли на 5% кровяном агаре, ФЛА — на 10% желточном агаре. Степень выраженности признаков оценивали по коэффициентам, которые определяли на основании расчета отношения диаметра зоны гемолиза к диаметру колоний и соответственно отношения диаметра зоны «опалесцирующего венчика» к диаметру колоний. Способность к слизеобразованию оценивали при посеве на плотные питательные среды, изучая макроскопически свойства колоний. Генетическое типи-рование штаммов P. aeruginosa осуществляли посредством полимеразной цепной реакции с праймером М13 (RAPD-ПЦР) [7]. ДНК получали согласно Stone G.G. et al. (1999) методом кипячения. Амплификацию проводили на термоциклере Т3 («Biometra», Германия). Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы ООО «Синтол» (Москва). Режим для RAPD-ПЦР включал: начальный цикл денатурации — 1 мин при 94°C — 20 сек; отжиг 45°C — 20 сек; синтез 72°C — 60 сек; завершающий цикл 5 мин при 72°C. Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в 1,2% агарозном геле при напряжении электрического поля 6 В/см. Визуализацию полос и документирование данных осуществляли с помощью системы гель-документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», США). Для определения достоверности различий между изучаемыми показателями использовали t-критерий Стьюдента. Взаимосвязь признаков определяли по коэффициенту линейной корреляции (R) Спирмана.
В подавляющем большинстве случаев (79,52%) из гнойного отделяемого, полученного от 83 больных, были изолированы микроорганизмы различной видовой принадлежности. Всего выделено 132 бактериальные культуры, в том числе, 41 куль-
тура (31,06%) представителей семейства Enterobacteriaceae и 67 культур грамположи-тельных кокков (50,76%). Что касается P. aeruginosa, то было изолировано 14 таких культур (10,61%), причем 9 из них в монокультуре, остальные в виде двухкомпонент-ных ассоциаций с Klebsiella pneumoniaе и Staphylococcus spр.
Все изучаемые культуры на жидкой питательной среде образовывали характерный сине-зеленый пигмент, что является видовым признаком P. aeruginosa. Тринадцать из них лизировали бараньи эритроциты. Степень выраженности гемолитической активности колебалась в широких пределах от 0,5 до 4,5 усл. ед. и в среднем составила 1,99±0,53. В десяти случаях зафиксирована фосфолипазная активность, ее интенсивность также значительно варьировала — от 0,3 до 4,0 усл. ед. Средние значения этого показателя были равны 2,04±0,55. Следует отметить, что в большинстве случаев эти факторы вирулентности были сопряжены и присущи одним и тем же штаммам P. aeruginosa. Так, между ФЛА и ГА установлена прямая сильная коррелятивная связь (R=0,846, p=0,000132). В то же время, степень выраженности этих признаков у изученных культур была сравнительно невысокой. Еще одним фактором вирулентности этих микроорганизмов является способность продуцировать мукоид (альгинат), который входит в состав экзополисахаридов [4]. Такие микроорганизмы за счет выделения слизи на твердых питательных средах образуют вязкие блестящие незначительно выступающие над поверхностью агара колонии. Способность к слизеобразованию регистрировали у 57,14% изучаемых культур. Что касается пленкообразующей активности, то как и в предыдущих наблюдениях (при изучении ФЛА и ГА), степень ее выраженности в значительной мере варьировала от 0,122 до 1,412 ед. ОП, средние значения составили 0,903±0,535. Высоко пленкообразующими вариантами были 64,28% изученных штаммов. Статистически значимой связи между ФЛА или ГА и пленкообразованием не выявлено. Высоко пленкообразующими были культуры как с выраженным слизеобразованием, так и без него.
Далее была изучена антибиотикочувствительность выделенных штаммов P. aeruginosa. Протестированы препараты, обычно рекомендуемые для лечения таких больных, в их числе цефалоспорины III поколения (цефтазидим), карбапенемы (меропенем, имипенем), фторхинолоны (ципрофлоксацин, офлоксацин), амино-гликозиды (амикацин), а также полимиксины (полимиксин В). Все изученные штаммы P. aeruginosa были чувствительны к полимиксину В. Эффективными были цефтазидим и карбапенемы, но при этом четыре культуры, устойчивые и к имипе-нему, и к меропенему, характеризовались наличием металло-беталактамаз (наблюдалось увеличение диаметра зоны подавления роста вокруг диска, пропитанного антибиотиком и ЭДТА). Молекулярно-генетический анализ подтвердил присутствие в этих штаммах металло-беталактамаз VIM2 типа. Следует подчеркнуть, что эти культуры отличались полирезистентностью, они были устойчивы к антибиотическим препаратам трех классов.
При сопоставлении и анализе всех исследованных фенотипических характеристик изолированных штаммов P. aeruginosa установлено, что четыре из них имели сходные биологические свойства, остальные десять отличались друг от друга по каким-либо признакам, чаще всего по антибиотикограммам. Учитывая эти обстоятельства для определения эпидемиологических параллелей мы ретроспективно проанализировали истории развития заболевания у этих 14 больных. Оказалось, что 9 пациентов после оперативного кардиохирургического вмешательства были выписаны в удовлетворительном состоянии. Однако спустя 4 — 8 недель они были вновь госпитализированы в кардиохирургический стационар для прохождения специализированного лечения по поводу возникших различных осложнений. До этого времени эти пациенты находились на стационарном лечении в других лечебных учреждениях города. Возможно, что во время пребывания именно в этих стационарах они инфицировались P. aeruginosa. В пользу этого положения свидетельствует и разнообразие
изученных фенотипических свойств у данных изолятов. Что касается других 4 штаммов P. aeruginosa, близких друг к другу по биологическим характеристикам, то, скорее всего, это были госпитальные штаммы кардиохирургического стационара. Они отличались полиантибиотикорезистентностью (и продуцировали металло-беталактамазы VIM2 типа), высоким уровнем биопленкообразования, наличием ряда изученных факторов вирулентности. Следует подчеркнуть, что эти штаммы P. aeruginosa были изолированы в течение короткого периода времени. Следовательно, развитие гнойно-септических осложнений, обусловленных P. aeruginosa у послеоперационных больных кардиохирургического профиля, может быть связано как с госпитальным штаммом кардиохирургического стационара, так и с инфицированием пациентов, находившихся на предшествующем стационарном лечении в других медицинских учреждениях.
Высказанное предположение о возможных источниках заражения таких больных нашло подтверждение в результатах проведенных молекулярно-генетических исследований. Из 14 протестированных культур P. aeruginosa у 4 были выявлены идентичные RAPD-профили, что позволило оценить их как близкородственные. Остальные штаммы отнесены к индивидуальным геномовариантам. Следует подчеркнуть, что культуры, принадлежащие к одной геномогруппе, были изолированы в короткий промежуток времени, что подтверждает высказанную гипотезу о циркуляции госпитального штамма с формированием короткой эпидемической цепочки в стационаре. Выявленные остальные случаи инфицирования P. aeruginosa, очевидно, между собой не связаны.
Известно, что вероятность инфекции, обусловленной P. aeruginosa, значительно повышается у ослабленных лиц, на фоне влияния стрессовых факторов, сопровождающих различные хирургические вмешательства. Послеоперационный период кардиохирургических больных, перенесших продолжительную операцию с обширной травматизацией тканей, обычно сопровождается иммунодепрессией или иммунодефицитом, что создает благоприятные условия для инфицирования.
Л ИТЕРАТУРА
1. Кохан Е.П., Александров А.С. Послеоперационные медиастиниты. Диагностика и лечение. Хирургия. 2011, 9: 22.
2. Руднов В.А. Современное клиническое значение синегнойной инфекции и возможности ее терапии у пациентов отделений реанимации. Инф. антимикроб. тер. 2002, 5: 170-177.
3. Сидоренко С.В., Резван С.П., Стерхова Г.А., Грудинина С.А. Госпитальные инфекции, вызванные P. aeruginosae. Распространение и клиническое значение антибиотикоре-зистентности. Антиб. химиотер. 1999, 3: 25-34.
4. Фурсова П.В., Милько Е.С., Левич А.П. Культивирование диссоциантов Pseudomonas aeruginosa в условиях заданного лимитирования. Микробиология. 2008, 77 (1): 1-б.
5. Шагинян И.А., Данилина Г.А., Чернуха М.Ю. и др. Формирование биопленок клиническими штаммами бактерий комплекса Вurkholderia œpacia в зависимости от их фенотипических и генотипических характеристик. Журн. микробиол. 2007, 1: 3-9.
6. Arakawa Y., Shibata N., Shibayama K. et al. Convenient test for screening metallo-ß-lactamase-producing Gram-negative bacteria by using thiol compounds. J. Clin. Microbiol. 2000, 38: 40-43.
7. Huey B., Hall J. Hypervariable DNA fingerprinting in Escherichia coli: minisatellite probe from bacteriophage M13. J. Bacteriol. 1989, 171 (5): 2528-2532.
8. Kohlenberg A., Weitzel-Kage D., Van der Linden P. et al. Outbreak of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa infection in a surgical intensive care unit. J. Hosp. Infect. 2010, 74: 350-357.
9. Okonta K.E., Anbarasu M., Jamesraj J. et al. Sternal wound infection following open heart surgery: appraisal of incidence, risk factors, changing bacteriologic pattern and treatment outcome. Ind. J. Thorac. Cardiovase. Surg. 2011, 27: 28-32.
10. Ottino G.M.D., De Paulus R., Pansini M.D.S. et al. Maior sternal wound infection after open-heart surgery: a multivariate analysis of risk factors in 2,579 consecutive operative procedures. Ann. Thorac. Surg. 1987, 44: 173-179.
11. Poirel L., Naas T., Nicholas D. et al. Characterization of VIM-2, a carbapenem-hydrolyzing metallo-beta-lactamase and its plasmid- and integron-borne gene from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate in France. Antimicrob. Agents. Chemother. 2000, 44: 891-897.
12. McNeil S.A., L. Nordstrom-Lerner, P.N. Malani et al. Outbreak of sternal surgical site infections due to Pseudomonas aeruginosa traced to a scrub nurse with Onychomycosis. Clin. Infect. Dis. 2001, 33: 317-323.
13. Upton A., Roberts S.A., Milsom P., Morris A.J. Staphylococcal post-sternotomy mediastini-tis: five year audit. ANZ J. Surgery. 2005, 75 (4): 198-203.
14. Van Delden C., Iglewski B. Cell-to-cell signaling and Pseudomonas aeruginosa infections. Emerg. Infect. Dis. 1998, 4: 551-560.
Поступила 20.04.14
Контактная информация: Касатов А.В., 614690, Пермь, ул. Пушкина, 85, (342)239-31-94
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРА, 2015
М.А.Тарасов1, С.Б.Гаранина1, У.А.Кресова2, А.М.Поршаков1, М.Н. Ляпин1, А.В.Рябова1, С.И.Толоконникова1, М.М.Шилов1, А.И.Удовиков1, Г.В.Григорьева1, С.А.Яковлев1
КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ ОТЛИЧИЙ РАЗНЫХ ТИПОВ ОЧАГОВ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ. ОЧАГИ ГЛПС В РАЗЛИЧНЫХ БИОТОПАХ СЕВЕРНОЙ СТЕПИ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», 2Центр гигиены и эпидемиологии в Саратовской области, Саратов
Цель. Определить качественные и количественные критерии оценки особенностей природных, природно-антропоургических и антропоургических очагов хантавирусов (на примере очагов геморрагической лихорадки с почечным синдромом — ГЛПС), сформировавшихся в различных районах Саратовской области. Материалы и методы. Проанализированы эпизоотологические и эпидемиологические данные с 1998 по 2012 гг. За этот период во всех типах очагов Аткарского района (северная степь) отработано 13 004 ловушко-ночей, добыто 2577 мелких млекопитающих. Для сравнительного анализа различий трех типов очагов использовались генетические, популяционно-экологические и эколого-эпизоотологические методы и критерии: ПЦР-диагностика и секвенирование патогенных для человека хантавирусов, кадастр видов и особенности сезонной динамики видового состава носителей хантавирусов, индексы доминирования, показатели численности и инфицированности хантавирусами носителей, распределение последних по биотопам, степень и характер контактов населения с природно-очаговыми комплексами, эпизоотический потенциал очагов. Результаты. На основе анализа многолетних данных показаны особенности 3 видов очагов ГЛПС в условиях различных преимущественно лесных биотопов северной и части типичной степи. Отмечено устойчивое доминирование генотипа хантавируса Пуумала, а также установлена слабо выраженная циркуляция в паразитарных системах с носителями рода Apodemus, прежде всего Apodemus agrarius генотипа Добрава. Заключение. При типизации очагов ГЛПС и ряда других зоонозов необходимо использовать определенный спектр наиболее информативных универсальных критериев, тесно связанных между собой.
Журн. микробиол., 2015, № 2, С. 74—80
Ключевые слова: типы очагов зоонозов, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, популяционная экология, эпизоотология зоонозов
