CC BY-ND
10
март № (312) зНиСО
55
© Дуванова О.В., Мишанькин Б.Н., 2019 УДК 579.843.1:577.1
ОЦЕНКА АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ НА ХОЛЕРНЫЙ ВИБРИОН (НА ПРИМЕРЕ ВЕЩЕСТВА АЦЕТИЛ^-ЦИСТЕИНА^)
О.В. Дуванова, \Б.Н. Мишанькин
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора, ул. Горького, д. 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, Россия
Изучено действие вещества ацетил-Ы-цистеина-L на холерный вибрион. Его минимальная подавляющая концентрация для штаммов Vibrio cholerae El Tor O1 и O139 серогрупп составила 12,5 мг/мл на плотных питательных средах - агаре Мартена (рН 7,6) и LB (рН 7,2), тогда как на синтетической среде Бхаскарана с использованием в качестве единственного источника углерода 0,1 % глюкозы, 0,05 % Ы-ацетил-^-^-глюкозамина или коллоидного хитина (0,027 %) она снижалась до 50250 мкг/мл. Обнаружена способность вещества ацетил-Ы-цистеина-L подавлять активность очищенного фермента Ы-ацетил-р-В-глюкозаминидазы (хитобиазы). Выявленное антибактериальное действие вещества ацетил-Ы-цистеина-L в отношении штаммов Vibrio cholerae El Tor O1 и O139 серогрупп с разной эпидемической значимостью (наличие/отсутствие генов ctxAB и tcpA) указывает на целесообразность рассмотрения вопроса о возможности включения этого вещества в состав компонентов растворов, используемых при регидратационной терапии случаев диареегенных заболеваний. Ключевые слова: V. cholerae, штаммы, Ы-ацетил-Ь-цистеин, Ы-ацетил-в-В-глюкозаминидаз-ная активность, 4-метилумбеллиферил-Ы-ацетил-в-В-глюкозаминид ^-MUF^l^Ac).
O.V. Duvanova, В.Ы. Mishankin □ ESTIMATION OF ANTIBACTERIAL EFFECT ON VIBRIO CHOLERAE (ON THE EXAMPLE OF THE SUBSTANCE ACETYL-N- CYSTEINE-L) □
Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor, 117/40 Gorky Str., Rostov-on-Don, 344002, Russia.
We studied the effect of the substance acetyl-Ы-cysteine-L on cholera Vibrio. Its minimum inhibitory concentration for the strains of Vibrio cholerae El Tor O1 and O139 serogroup was 1-2.5 mg/ml in solid nutrient media - Martin's agar (pH 7.6) and LB (pH 7.2), while in Bhascaran synthetic medium, using glucose (0.1per cent) as the sole carbon source, Ы-acetyl-p-D-glucosamine (0.05 per cent) or colloidal chitin (0.027 per cent) it was reduced to 50-250 цg/ml. The ability of the substance acetyls-cysteine-L substance to suppress the activity of the purified enzyme Ы-acetyl-e-D-glucosaminidase (chitobiasis) was found. Antibacterial effect detected of the substance acetyls-cysteine-L against the strains of Vibrio cholerae El Tor O1 and O139 serogroups with different epidemic significance (presence / absence of ctxAB and tcpA genes) indicates the advisability of considering the issue on the possibility of including this substance in composition of solution components used in the rehydration therapy of diarrheal diseases cases. Key words: V. cholera, strains, acetyl-Ы-cysteine-L, N-acetyl-в-D-glyukozaminidasе activity, 4-methylumbelliferyl-Ы-acetyl-в-D-glucosaminide ^-MUF.Gl^Ac).
Ацетил-N-цистеин-Ь (C5H9NO3S) - ацили-рованная тиолсодержащая аминокислота (предшественник L-цистеина и глутатиона). Ацетил -цистеин является основным действующим веществом некоторых препаратов, широко применяемых в различных областях медицины [1, 6, 11, 15]. В связи с расшифрованным механизмом действия и обнаруженными свойствами открываются новые области и перспективы его применения. Несмотря на то что в ряде экспериментальных и клинических исследований обнаружены антибактериальные свойства ацетил^-цис-теина-L для некоторых микроорганизмов [14] и выявлена его способность уменьшать адгезию некоторых возбудителей к слизистым оболочкам, оказывая прямое разрушающее воздействие на внеклеточный матрикс и позволяя рассматривать ацетил-^цистеин^ в терапии инфекций, которые связаны с образованием биопленок [1, 7] в составе которых микроб приобретает свою гиперинфекциозность [16], потенциал действия ацетил-^цистеина^ остается не до конца изученным. Отсутствие в доступной литературе сведений по влиянию вещества ацетил-^цисте-ина-L на холерный вибрион инициировало исследование чувствительности к нему штаммов Vibrio cholerae El Tor O1 и 0139 серогрупп.
Цель исследования - изучить действие вещества ацетил-Ы-цистеина^ на штаммы холерных вибрионов разных серогрупп, выделенных из различных источников и с разной эпидемической значимостью (наличие/отсутствие генов ctx AB и tcpA).
Материалы и методы. При выполнении исследований в зависимости от решаемой задачи использовали разные группы штаммов: 6 штаммов V. cholerae O1 El Tor (ctx+ tcp+), 6 дефектных по синтезу токсина и токсинкорегу-лируемых пилей штаммов (Actx Atcp), выделенных из воды поверхностных водоемов, 12 штаммов V. cholerae 0139 серогруппы, из которых 6 (ctx+ tcp+) были выделены из клинического материала, а 6 атоксигенных (Actx Atcp) -из проб воды поверхностных водоемов. Штаммы получали из музея живых культур с центром патогенных вибрионов ФКУЗ «Ростовский НИПЧИ», где их хранили в лиофилизиро-ванном состоянии.
В работе использовали вещество ацетил-Ы-цистеин-L (Россия). Коллоидный хитин (0,027 %) готовили по методу Balasubramanian et al. [8].
Для культивирования микроорганизмов применяли агар Мартена (рН 7,6), LB (рН 7,2) (Дифко) и Бхаскарана с использованием в качестве единственного источника углерода 0,1 % глюкозы (Россия), 0,05 % N-ацетил-Р-Б-глюкоза-мина (Serva) или коллоидного хитина (0,027 %). N-ацетил-Р-О-глюкозаминидазную активность у холерных вибрионов выявляли качественно [9] и количественно с применением флуорогенного субстрата 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-P-D-глюкозаминида (4-MUF GlcNAc, Sigma). Результат реакции оценивали на флюоресцентном спектрофотометре Hitachi F-2500 с использова-
ЕС
ЗНиСО март № (312)
нием лицензионной программы FL Solutions. Выделение и очистку фермента К-ацетил-P-D-глюкозаминидазы осуществляли по методу [2].
Результаты исследования. Установлено, что все штаммы Vibrio cholerae El Tor O1 и 0139 серогрупп оказались чувствительными к веществу ацетил-К-цистеину-L независимо от объекта выделения и набора детерминант вирулентности. Обнаружено антибактериальное действие ацетил-К-цистеина-L в концентрации 1-2,5 мг/мл. Небезынтересно отметить, что на плотных питательных средах - агаре Мартена (рН 7,6) и LB (рН 7,2) - МПК ацетил^-цис-теина-L для штаммов V. cholerae O1 и 0139 серогрупп, выделенных из различных источников, независимо от наличия/отсутствия генов ctxAB и tcpA составляла 1-2,5 мг/мл. В то же время на синтетической среде Бхаскарана с использованием в качестве единственного источника углерода 0,1 % глюкозы, 0,05 % - N-аце-тил-Р^-глюкозамина или коллоидного хитина (0,027 %) МПК снижалась до 50-250 мкг/мл. Выявлена 10-кратная разница в чувствительности к веществу ацетил-К-цистеину-L на полных и голодной средах, которая, по-видимому, объясняется как широким спектром его действия как тиолсодержащего антиоксиданта на различные системы микроба, так и влиянием отдельных компонентов сред на этот процесс.
Особенно интересно поведение вибрионов на среде с хитином, полимером, играющим важную роль в экологии возбудителя холеры. Обнаруженный хитинолитический комплекс у холерных вибрионов [5], включающий не менее 5 хитиназ, позволяет с большей определенностью поддерживать утверждение [13] о существовании у пандемичных штаммов V. cholerae экологической ниши вне человека, но ассоциированной с хитин-содержащими организмами.
Катаболический каскад, согласно схеме Hunt D.E. et al. [10], начинается с расщепления полимера на олигомеры внеклеточными хитиназа-ми (гены VC0769, VC1952, VCA0027), которые хотя и обладают разной активностью или регуляцией, действуют согласованно при превращении хитина в попадающие затем в периплазматичес-кое пространство олигосахариды (GlcNAc)n >2. Сюда можно отнести К-ацетил-Р^-глюкозами-нидазу и N-ацетилгексозаминидазу (VC2217 и VC0613). В периплазме же олигосахариды хитина под действием периплазматических хитодек-стриназы (VCA0700) и К-ацетил-Р^-глюкоза-минидазы деградируют до (GlcNAc)12 [12].
Большой интерес для нас представляла обнаруженная ранее у холерных вибрионов N-ацетил-Р^-глюкозаминидаза (К.Ф.3.2.1.30) -фермент, входящий в состав хитинолитическо-го комплекса и выполняющий важную роль в утилизации хитина, а также наделяющий холерный вибрион определенными конкурентными преимуществами и участвующий в выживании/сохранении холерных вибрионов [2, 3].
В ходе анализа полученных результатов обнаружено, что кроме антибактериального эффекта на штаммы холерных вибрионов выявлено влияние вещества ацетил-N-цистеина-L и на активность очищенного препарата N-ацетил-Р-D-глюкозаминидазы. Активность фермента, принимающего участие в выживании/сохранении холерных вибрионов, ингибировалась на 50 % после 15-минутной инкубации N-ацетил-
P-D-глюкозаминидазы с 1,5 мМ (250 мкг/мл) ацетил-К-цистеина-L при использовании для регистрации активности флуорогенного субстрата 4-MUF. GlcNAc. Концентрации в 0,360,75 мМ (30-125 мкг/мл) подавляли активность на 25-30 %, тогда как большие концентрации препарата - 500 мкг и выше (3 мМ и выше) полностью ингибировали активность фермента (таблица), что объясняется наличием в структуре его каталитического домена четырех остатков цистеина. Взятые для контроля очищенные препараты нейраминидазы и отрТ-про-теазы холерного вибриона, не содержавшие в своем составе остатков цистеина, в присутствии вещества ацетил-К-цистеина-L активность сохраняли полностью.
Таблица. Влияние вещества ацетил-Ч-цистеина^ на активность N-ацетил-р-Б-глюкозаминидазы
V. cholerae P-18950 Table. Effect of the substance acetyl-N-cysteine-L on the activity of N-acetyl-p-D-glucosaminidase V. cholerae P-18950
Реагенты Концентрация Относительная активность, %
Контроль - 100
ацетил-Ы-цистеин^ 1,5mM 50
ацетил-Ы-цистеин^ 3 mM (и выше) 0
Обнаруженная способность вещества аце-тил-К-цистеина-L подавлять активность очищенного фермента К-ацетил^-О-глюкозамини-дазы (хитобиазы) холерного вибриона, вероятно, может определенным образом влиять на ход событий при заболевании и вибриононосительстве.
Таким образом, повышенная чувствительность возбудителя холеры к веществу ацетил-Ж-цистеину-Z на средах с коллоидным хитином объясняется присутствием в структурах перечисленных выше ферментов большого числа (8-11) остатков цистеина, способных формировать чувствительные к ацетилцистеину дисуль-фидные связи, разрывы которых сопровождаются образованием сульфгидрильных (-SH) групп, ведущих к нарушению функций белков (включая некоторые ферменты) с последующей гибелью клетки. Нельзя исключить и возможности вещества ацетил-К-цистеина-L подавлять биологическую активность ctxA и ctxB - субъединиц, а также zof-токсина, токсин-корегули-руемых пилей и гемагглютинин/протеазы (НА/Р) холерных вибрионов, несущих в своем составе от 2 до 4 остатков цистеина, что будет являться предметом дальнейших исследований и расширит наши представления о биологии возбудителя.
Заключение.
Полученные данные указывают на способность вещества ацетил-К-цистеина-L оказывать антибактериальный эффект на все взятые в исследование штаммы Vibrio cholerae El Tor O1 и 0139 серогрупп с разной эпидемической значимостью (наличие/отсутствие генов ctx AB и tcpA) и выделенных из различных источников. Показано, что на плотных питательных средах -агаре Мартена (рН 7,6) и LB (рН 7,2) - минимальная подавляющая концентрация (МПК) вещества ацетил-К-цистеина-L для штаммов V. cholerae El Tor O1 и 0139 серогрупп составила 1-2,5 мг/мл, тогда как на синтетической среде Бхаскарана с использованием в качестве единственного источника углерода 0,1 % глюкозы, 0,05 % К-ацетил^-О-глюкозамина или
март № (312) зНиСО
57
коллоидного хитина (0,027 %) МПК снижалась до 50-250 мкг/мл. Выявлена способность веще-еэ ства ацетил-Ы-цистеина^ подавлять активность очищенного фермента ^ацетил-Р^-глюкоза-минидазы (хитобиазы), участвующего как в утилизации хитина, так и в выживании/сохранении холерных вибрионов.
Полученные результаты представляют теоретический и практический интерес. Они дополняют наши представления о механизме действия вещества ацетил-N-цистеина-L, что в перспективе сможет расширить показания к его применению, учитывая полученные недавно данные об антибактериальном действии этого вещества в отношении биопленок холерных вибрионов [4].
Обнаруженные свойства вещества ацетил-^цистеи^^ могут указывать на целесообразность рассмотрения вопроса о возможности его включения в состав компонентов растворов, используемых при регидратационной терапии случаев диареегенных заболеваний, обусловленных возбудителями II-IV групп патогенности.
ЛИТЕРАТУРА (п. 7—16 см. References)
1. Голуб А.В. Бактериальные биопленки - новая цель терапии? // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2012. № 1. С. 23-29.
2. Дуванова О.В., Мишанькин Б.Н., Водопьянов А.С. и др. N-аце-тил-р^-глюкозаминидаза холерных вибрионов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2016. № 2. С. 41-48.
3. Дуванова О.В., Мишанькин Б.Н., Сорокин В.М. и др. Оценка влияния температуры культивирования на активность N-аце-тил-р^-глюкозаминидазы у холерных вибрионов // Здоровье населения и среда обитания. 2016. № 4 (277). С. 42-44.
4. Дуванова О.В., Мишанькин Б.Н., Титова С.В. и др. Действие ^ацетил^-цистеи^ на биопленки холерного вибриона // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018. №. 2. С.83-87.
5. Мишанькин Б.Н., Шиманюк Н.Я., Водопьянов С.О. и др. Изучение хитинолитического комплекса холерного вибриона сероварианта О139 // Биотехнология. 2010. № 1. C. 32-40.
6. Ушкалова Е.А. Ацетилцистеин в клинической практике: настоящее и перспективы // Фармацевтика. 2007. № 17. С. 30-36.
REFERENCES
1. Golub A.V. Bakterial'nye bioplenki - novaya tsel' terapii? [Bacterial biofilms - a new goal of therapy?]. Kliniches-kaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya, 2012, no. 1, pp. 23-29. (In Russ.)
2. Duvanova O.V., Mishan'kin B.N., Vodop'yanov A.S. et al. N-atsetil-в-D-glyukozaminidaza kholernykh vibrionov [N-acetyl-^-D-gluco-
saminidase of cholera vibrios]. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii, 2016, no. 4 (277), pp. 42-44. (In Russ.)
3. Duvanova O.V., Mishan'kin B.N., Sorokin V.M. et al. Otsenka vliyaniya temperatury kul'tivirovaniya na aktivnost' N-atsetil-ß-D-glyukozaminida-zy u kholernykh vibrionov [Evaluation of cultivation temperature effect on the activity of N-acetyl-ß-D-glucosaminidase in cholera vibrios]. Zdo-rov'e naseleniya i sreda obitaniya, 2016, no. 4 (277), pp. 41^-8. (In Russ.)
4. Duvanova O.V., Mishan'kin B.N., Titova S.V. et al. Deistvie N-atse-til-L-tsisteina na bioplenki kholernogo vibriona [Effect of N-acetyl-L-cysteine on biofilms of Vibrio cholerae]. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii, 2018, no. 2. pp. 83-87. (In Russ.)
5. Mishan'kin B.N., Shimanyuk N.Ya., Vodop'yanov S.O. et al. Izuche-nie khitinoliticheskogo kompleksa kholernogo vibriona serovarianta O139 [The study chitinolytic complex of Vibrio cholerae O139 of se-rovariant]. Biotekhnologiya, 2010, no. 1, pp.32-40. (In Russ.)
6. Ushkalova E.A. Atsetiltsistein v klinicheskoi praktike: nastoyashchee i perspektivy [Acetylcysteine in clinical practice: present and perspectives]. Farmatsevtika, 2007, no. 17, pp. 30-36. (In Russ.)
7. Aslam S., Darouiche R.O. Role of antibiofilm - antimicrobial agents in control of the device - related infections. Int. J. Artif. Organs, 2011, vol. 34, no. 9, pp. 752-758.
8. Balasubramanian R., Manocha M.S. Cytosolic and membrane-bound chitinase of two mucoraceous fungi: a comparative study. Ca-nad. J. Micobiol, 1992, no. 38, pp. 331-338. _
9. O'Brien M., Colwell R. A rapid test for chitinase activity that uses 4-methylumbelliferryl-N-acetyl-ß-D-glucosaminide. Applied Envi-ronm. Microbiol, 1987, vol. 53, no. 7, pp. 1718-1720.
10. Hunt D.E., Gevers D., Vanora N.M. et. al. Conservation of the chitin utilization pathway in the Vibrionaceae. Appl. Environm. Microbiol, 2008, vol. 74, no. 1, pp. 44-51.
11. Huynh H.Q., Couper R.T., Tran C.D. et. al. N-acetylcysteine, a novel treatment for Helicobacter pylory infection. Dig. Dis. Sci, 2004, vol. 49, pp. 1853-1861.
12. Keyhany N.O., Roseman S. Physiological aspects of chitin metabolism in marine bacteria. Biochim. Biophys. Acta, 1999, vol. 1473, pp. 108-122.
13. Lipp E.K. A. Huq, R.R. Colwell. Effects of global climate on infectious disease: the cholera model. Clin. Microbiol. Rev, 2002, vol.15, no. 4, pp. 757-770.
14. Parry M.F., Neu H.C. Effect of N-acetylcystein on antibiotic activity and bacterial growth in vitro. J. Clin. Microbiol, 1977, vol. 5, no. 1, pp. 58-61.
15. Prescott L.F., Illingworth R.N., Critchley J.A.J.H. et. al. Intravenous N-acetylcystein: the treatment of choice for paracetamol poisoning. Brithish Med. J, 1979, no. 2, pp. 1097-1100.
16. Tamayo R., Patimalla B., Camilli A. Growth in a biophilm induces a hyperinfectious phenotype in Vibrio cholerae. Infect. Immun, 2010, vol. 78, no. 8, pp. 3560-3569.
Контактная информация:
Дуванова Ольга Викторовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории диагностики особо опасных инфекций ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора e-mail :olga_duvanov a@mail.ru
Contact information:
Duvanova Olga, Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher at the Laboratory of diagnosis of particularly dangerous infections of Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor e-mail:olga_duvanova@mail.ru
V
© Мозжерова М.А., 2019 УДК 616-093/-098
ВИДЫ ДРОЖЖЕВЫХ ГРИБОВ РОДА CANDIDA В ИЗОЛЯТАХ ИЗ ПОЛОСТИ РТА У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ
М.А. Мозжерова
НУЗ «Центральная больница № 4 ОАО «РЖД», ул. Плющева, д. 15-а, стр. 1,
г. Москва, 111398, Россия
Проведено обследование ротовой полости 174 ВИЧ-инфицированных пациентов, находящихся на диспансерном наблюдении и лечении в Брянском Центре по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями, с выполнением комплекса бактериологических и па-разитологических исследований. Показано преобладание неальбикансных видов, а также микст-инфекций с двумя и более видами грибов рода Candida.
Ключевые слова: орофарингеальный кандидоз, нон-альбикансные виды Candida, антифунгиаль-ная чувствительность, резистентность к флуконазолу.
M.A. Mozzherova □ SPECIES OF YEAST-LIKE FUNGI OF THE GENUS CANDIDA IN ISOLATES FROM THE ORAL CAVITY IN HIV-INFECTED PATIENTS OF THE BRYANSK REGION □ Central hospital no. 4 of JSC «Russian Railways», 15-a Plusheva Str., Bild. 1, Moscow, 111398, Russia.
We examined of the oral cavity of 174 HIV-infected patients who are on dispensary supervision and treatment in the Bryansk Center for the prevention and control of AIDS and infectious diseases with the implementation of a complex of bacteriological and parasitological studies. The predominance of non-albican species, as well as mixed infections with two or more species of fungi of the genus Candida were shown. Key words: oropharyngeal candidiasis, non-albicans Candida species, antifungial sensitivity, resistance to fluconazole.
