CC BY
6
ОЦЕНИТЬ ВЛИЯНИЕ ЭКСПРЕССИИ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ
МАРКЕРОВ ОПУХОЛИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ШЕЙКИ МАТКИ НА РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОВЕДЕНИЯ СОПРОВОДИТЕЛЬНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ
Камышов C.B.
Республиканский специализированный научно-практический медицинский центр онкологии и радиологии Министерства Здравоохранения Республики Узбекистан, Ташкент
Kamyshov S.V.
Republican Specialized Scientific and Practical Medical Center of Oncology and Radiology, Ministry of
Health of the Republic of Uzbekistan
Аннотация
У большей части больных РШМ (у 73,3, 80,0 и 76,7% соответственно) присутствовали молекулярно-биологические маркеры p53, VEGF и Ki-67. В то время, как маркеры Bcl-2 и EGFR обнаруживались у 36,7 и 30,0% больных. Сравнительная оценка уровня опухолевых маркеров и 5-летней выживаемости больных РШМ показала, что наибольшей прогностической значимостью в отношении эффективности лечения обладают молекулярно-биологические маркеры p53, VEGF и Ki-67, а также уровень пролиферативной активности (ПА) опухоли. Исследования показали, что наибольший эффект в увеличении 5-летней выживаемости больных РШМ оказывала схема сопроводительной иммунотерапии, включающая экстракорпоральную иммунофармакотерапию и плазмаферез. Проведённый анализ уровня онкомаркеров и 5-летней выживаемости больных, позволяет сделать вывод о том, что положительный уровень p53, VEGF и Ki-67 у больных РШМ, наряду с высокой пролиферативной активностью опухоли, может служить основанием для проведения данной категории пациенток сопроводительной иммунотерапии с ЭИФТ, что может существенно увеличить эффективность стандартных схем противоопухолевого лечения.
Ключевые слова: биомолекулярные маркеры, рак шейки матки, прогрессирование опухоли.
Key words: biomolecular markers, cervical cancer, tumor progression.
Введение. Известно, что одним из coвpeмeн-ньк путей пpoгнoзиpoвaния течения онкогинеколо-гических заболеваний и выpaбoтки лeчeбнoй тaктики является изучение мoлeкyляpнo-биoлoгичecкиx мapкepoв в ткани oпyxoли [2,3,8]. Ocoбoe внимaниe пpивлeкaют cвeдeния o нapyшeнияx мexaнизмoв пpoлифepaции, aпoптoзa и aнгиoгeнeзa в oпyxoлeвыx клеткax [8]. Злокачественные опухоли рака шейки матки (РШМ) - одна из актуальных проблем клинической онкологии. По данным Международного агентства по изучению рака, каждый год регистрируется около 490 тыс. новых случаев РШМ, при этом свыше 55 % женщин умирает от этого заболевания [1]. Природа РШМ рассматривается как последовательный многоступенчатый процесс: от неизменного эпителия шейки матки до интраэпителиальной неоплазии и до инва-зивного рака [2]. Патологоанатомы всегда стремились связать с морфологией опухоли степень ее клинической агрессивности. Так, гистологические классификации опухолей разрабатывались с учетом уровня злокачественности составляющих их нозологических форм. Сегодня одним из наиболее перспективных направлений в диагностике злокачественных опухолей является определение опухолевых маркеров, что может давать дополнительную информацию о биологической особенности опухоли. Большое внимание уделяется изучению маркеров, характеризующих апоптоз, пролиферацию клетки, - это белки р53, Вс1-2, Ю-67 и EGFR, ЭФР [3,9]. Известно, что ген-супрессор р53 кодирует ядерный белок, модулирующий экспрессию генов, ответственный за репарацию ДНК, деление клеток и апоптоз [4,5,8]. Почти в половине случаев злокачественных опухолей обнаруживаются мутации в
хромосоме 17 в области локализации гена-супрес-сора р53 [9]. Сегодня в литературе нет единого мнения относительно динамики экспрессии р53 при прогрессировании РШМ. Согласно данным ряда авторов, он может как повышаться, так и снижаться при РШМ [9]. В свою очередь, антиген Ki-67 является ядерным белком, экспрессия которого отмечается в активную фазу клеточного цикла, включая митоз. Согласно данным литературы, экспрессия Ki-67 повышается при поражении шейки матки [10]. Белку Bcl-2 принадлежит важная роль в регуляции апоптоза. Показано, что высокая степень экспрессии опухолевой клетки Bid (белка из семейства Bcl, играющего важную роль в регуляции апоптоза и интегрирующего сигналы для митохондрий) коррелирует с неблагоприятным прогнозом РШМ [10].
Применение современных методов иммунотерапии в лечении онкогинекологических заболеваний c использованием новых возможностей изучения молекулярно-биологических маркеров, может дать информацию o прогнозе течения заболевания, содействовать назначению рационального и эффективного лечения, что и определяет актуальность данного исследования.
В связи с вышесказанным, нами изучено влияние экспрессии молекулярно-биологических маркеров опухоли на результаты проведения сопроводительной иммунотерапии у больных раком шейки матки.
Материал и методы исследования. Были обследованы молекулярно-биологические маркеры опухоли у 30 больных раком шейки матки (РШМ) T2-3N0-iM0 стадий (II-III клинические стадии), которые находились на госпитализации в отделениях онкогинекологии и химиотерапии в 2009-2011гг.
Иммуногистохимические методы исследования были проведены на гистологических препаратах операционно-биопсийного материала первичной опухоли больных РШМ, полученные до начала терапии. Образцы опухолевой ткани фиксировали в нейтральном забуференном формалине с обычной стандартной проводкой и заливкой в парафин. Гистологические препараты окрашивали обычными способами и проводили иммуногистохимические исследования. Парафиновые срезы депарафиниро-вали и регидратировали по стандартной методике. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали DAB+систему [DakoCytomation, Дания]. Оценку результатов окрашивания проводили с применением светового микроскопа «Leica» (Германия) под увеличением х10; х20; х40. Для маркера оценивали локализацию окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма, мембрана). Количество положительных клеток оценивали в зонах, содержащих их максимальное количество. У больных РШМ в иммуногистохимической оценке экспрессии p53 использовали моноклональные мышиные антитела к р53 (клон DO-7), Bc1-2 ('клон 124), EGFR (клон E30), VEGF (клон VG1), Ki-67 (клон M1B-1) (DakoCytomation, Дания). В исследовании применяли следующие критерии оценки маркеров: 1. опухоль считали отрицательной по р53, если в ткани опухоли отсутствовала ядерная реактивность с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25%; и положительной по р53, если было окрашено более 25% ядер опухолевых клеток; 2. опухоль считали отрицательной по Bc1-2, EGFR и VEGF, если в ткани опухоли отсутствовала цито-плазматическая реактивность с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25%; и положительной, если было окрашено более 25% опухолевых клеток; 3. для оценки пролифератив-ной активности (ПА) опухоли подсчитывали количество Ki-67-положительных опухолевых клеток,
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
приходящихся на 300 опухолевых клеток. Индекс К1-67 определяли по формуле: ПА=число К1-67-положительных клеток х 100/общее количество клеток. При этом пролиферативная активность опухоли оценивалась как процент К1-67 положительных клеток от общего количества опухолевых клеток. Высокая пролиферативная активность соответствовала индексу К1-67>40%, низкая пролиферативная активность опухоли соответствовала индексу К1-67<40%. Иммунотерапия в комплексе стандартной полихимиотерапии была проведена на трех группах больных: 1 группа - 12 больных РШМ без проведения иммунотерапии (контрольная группа); 2 группа - 9 больных РШМ в комплексе с экстракорпоральной иммунофарма-котерапией (ЭИФТ); 3 группа - 9 больных РШМ в комплексе с ЭИФТ+плазмаферез (ЭИФТ+ПФ).
Полученные результаты исследования. При изучении экспрессии молекулярно-биологических маркеров опухоли у больных РШМ отрицательный уровень р53 был отмечен у 8 (26,7%) пациенток, положительный - у 22 (73,3%). В то же время, при изучении Вс1-2 была обнаружена обратная закономерность: отрицательный уровень Вс1-2 определялся у 19 (63,3%) больных РШМ и положительный - у 11 (36,7%). Соответствующие показатели при изучении БвРЯ обнаруживались у 21 (70,0%) и 9 (30,0%) пациенток, УБвБ - у 6 (20,0%) и 24 (80,0%) и при изучении К1-67 - у 7 (23,3%) и 23 (76,7%) пациенток. Следовательно, у большей части больных РШМ уровень изучаемых онкомаркеров был положительным, за исключением Вс1-2 и БвРЯ, которые были отрицательными у 63,3 и 70,0% пациенток соответственно. Полученные результаты представлены на рисунке 1.
р53 Bcl-2 EGFR VEGF Ki-67
■ Отрицательный уровень ■ Положительный уровень
Рисунок 1. Количество больных РШМ с отрицательным и положительным уровнями изучаемых
онкомаркеров
Наиболее высокие показатели 5-летней выживаемости отмечались в группе больных РШМ, которым проводилась ЭИФТ+ПФ. Так, в контрольной группе больных выживаемость с отрицательным
уровнем р53 составила 64,4±6,7%, тогда как в группах с ЭИФТ и ЭИФТ+ПФ эти показатели составили 73,2±7,7 (р>0,05) и 77,4±8,4% (р>0,05) соответственно. Полученные данные представлены на ри-
сунке 2. При положительном значении данного он- групп с применением методов иммунотерапии со-комаркера, 5-летняя выживаемость составила ответственно. 46,1±5,1% для контрольной группы без иммунотерапии и 55,6±4,9 (р<0,05) и 60,5±6,4% (р<0,05) для
90
р53(-) р53(+) Bcl-2(-) Bcl-2(+) EGFR(-) EGFR(+)
1 группа без иммунотерапии 2 группа ЭИФТ без ПФ 3 группа ЭИФТ с ПФ
Рисунок 2. 5-летняя выживаемость больных РШМ в зависимости от вида иммунотерапии и экспрессии
молекулярно-биологических маркеров опухоли
Ген-супрессор р53 кодирует ядерный белок, модулирующий экспрессию генов, ответственный за репарацию ДНК, деление клеток и апоптоз. На сегодняшний день в литературе нет единого мнения относительно динамики экспрессии р53 при прогрессировали РШМ. Согласно данным ряда авторов, он может, как повышаться, так и снижаться при данном заболевании. Частота накопления mut-р53 увеличивается с ростом злокачественности опухолей, в то время как при доброкачественных опухолях накопления mut-р53 не встречается, а в злокачественных опухолях частота накопления увеличивается до 46% [2,4,7,8]. Белку Bcl-2 принадлежит важная роль в регуляции апоптоза. Показано, что высокая степень экспрессии опухолевой клетки Bid (белка из семейства Bcl, играющего важную роль в регуляции апоптоза и интегрирующего сигналы для митохондрий), коррелирует с неблаго приятным прогнозом РШМ. Bcl-2 может полностью задерживать апоптоз, вызванный р53 и другими стимуляторами, в том числе цитостатическими препаратами, но не останавливает апоптоз, вызванный цитотоксическими Т-лимфоцитами [2,10]. В различных работах было показано резкое и значимое усиление экспрессии Bcl-2 при локализованных формах РШМ по сравнению с начальными стадиями и последующее снижение экспрессии при местнораспространенном процессе [10]. Показатели 5-летней выживаемости в контрольной группе больных РШМ при рассмотрении маркера Bcl-2 в контрольной группе составили 57,2±5,0% при отрицательном его уровне и 49,5±5,6% - при его положительном значении. Соответственно, в группах с иммунотерапией данный показатель составил 73,7±7,2% (р<0,05) и 76,4±7,0% (р>0,05) при отрицательном уровне и 57,5±5,4% (р>0,05) и 66,2±7,4% (р>0,05) - при его положительном значении.
Рецептор эпидермального фактора роста EGFR является трансмембранным гликопротеином, локализующимся на хромосоме 7р12. EGFR функционирует через димеризацию, активируя тирозинки-назу, участвуя в регуляции нормальной и неопластической клеточной пролиферации. При трансформации клеток происходит усиление синтеза этих белков и гиперэкспрессия рецепторов на поверхности клеток. EGFR присутствует во многих нормальных тканях и выраженная экспрессия наблюдается в солидных опухолях, включая РШМ. Согласно данным литературы экспрессия EGFR наблюдается примерно в 40% злокачественных опухолей ЖКТ, легкого, яичника, матки. При этом, роль EGFR как прогностического маркера при РШМ окончательно не определена [3]. При рассмотрении маркера EGFR было показано, что при его отрицательном значении у больных РШМ в группе без иммунотерапии 5-летняя выживаемость составила 55,4±5,3, а при положительном -54,8±5,8%. В группе с ЭИФТ соответствующие показатели составили 66,8±7,0 (р<0,05) и 64,3±6,9% (р>0,05), а в группе с ЭИФТ+ПФ - 69,5±6,3 (р>0,05) и 67,4±6,8% (р>0,05).
Основным активатором ангиогенеза считают фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), ответственный за пролиферацию и миграцию эндотели-альных клеток, а также имеющий непосредственное отношение к инвазии и метастазированию опухоли. Накоплены данные, подтверждающих участие VEGF и EGFR в построении сосудистого русла, росте и прогрессии злокачественных новообразований. Причем взаимодействие этих лигандов с трансмембранными тирозинкиназными рецепторами рассматривают как важнейший аутокринный путь промоции опухоли [2,3]. При отрицательном значении уровня VEGF в контрольной группе 5-
летняя выживаемость пациенток составила 64,3±7,2 и при положительном - 53,0±6,0%, представлено на рисунке 3. В группах больных, в которых применялась сопроводительная иммунотера-
пия, соответствующие значения при отрицательном значении УБвР составили 73,4±6,8 (р>0,05) и 75,2±7,4% (р>0,05), при положительном уровне данного онкомаркера - 60,7±5,6 (р<0,05) и
67,4±6,8% (р<0,05).
90
УЕСР(-) УЕСР(+) К1-67(-) К1-67(+) ПА низкая ПА высокая 1 группа без иммунотерапии 2 группа ЭИФТ без ПФ 3 группа ЭИФТ с ПФ
Рисунок 3. 5-летняя выживаемость больных РШМ в зависимости от вида иммунотерапии и экспрессии
молекулярно-биологических маркеров опухоли
Антиген К1-67 - это ядерный белок, экспрессия которого отмечается в активную фазу клеточного цикла, включая митоз. Согласно данным литературы, экспрессия К1-67 повышается при поражении шейки матки. Пролиферативный индекс К1-67 рассматривается как независимый прогностический показатель возникновения рецидива, общей и безрецидивной выживаемости, предсказательный фактор для определения чувствительности к химиотерапии (ХТ) и ЛТ. Индекс К1-67 позволяет оценить степень злокачественности опухоли и прогнозировать течение заболевания в совокупности с другими факторами. Показано, что высокий уровень индекса К1-67 сопряжен с неблагоприятным прогнозом. В частности, при высоком уровне К1-67 отмечается ухудшение показателей безрецидивной и общей выживаемости больных раком молочной железы, яичника, толстой кишки, мочевого пузыря, саркомах мягких тканей и др. [2,10]. Онкомаркер К1-67 не обнаруживался в опухолях 7 больных РШМ, у которых в контрольной группе 5-летняя выживаемость составила 65,2±5,8%, что показано на рисунке 3. При его положительном уровне в группе без иммунотерапии данный показатель составил 44,2±6,1%. В группах с проведением ЭИФИ и ЭИФТ+ПФ при отрицательном К1-67, показатели выживаемости составили 76,4±7,9 (р>0,05) и 77,8±6,7% (р>0,05) соответственно, а при положительном - 57,8±5,9 (р<0,05) и 63,3±7,4% (р<0,05). При низком уровне индекса ПА, который высчитывали по К>67, 5-летняя выживаемость у больных РШМ в группе без иммунотерапии составила 62,6±5,8, при высоком его уровне - 44,8±5,1%. Полученные данные представлены на рисунке 3. В группах с применением имммунотерапевтических методов, 5-летняя выживаемость при низком индексе ПА составила 73,7±8,2 (р>0,05) и 78,1±7,7%
(р>0,05), при высоком индексе - 54,5±5,4 (р>0,05) и 62,2±6,4% (р<0,05).
Таким образом, у большей части больных РШМ (у 73,3, 80,0 и 76,7% соответственно) присутствовали молекулярно-биологические маркеры p53, VEGF и Ki-67. В то же время, маркеры Bcl-2 и EGFR обнаруживались у 36,7 и 30,0% пациенток соответственно. Сравнительная оценка уровня опухолевых маркеров и 5-летней выживаемости больных РШМ показала, что наибольшей прогностической значимостью в отношении эффективности лечения обладают молекулярно-биологические маркеры p53, VEGF и Ki-67, а также уровень про-лиферативной активности (ПА) опухоли. Наши исследования показали, что наибольший эффект в увеличении 5-летней выживаемости больных РШМ оказывала схема сопроводительной иммунотерапии, включающая ЭИФТ+ПФ. Проведённый анализ уровня онкомаркеров и 5-летней выживаемости больных, позволяет сделать вывод о том, что положительный уровень p53, VEGF и Ki-67 у больных РШМ, наряду с высокой пролиферативной активностью опухоли, может служить основанием для проведения данной категории пациенток сопроводительной иммунотерапии с ЭИФТ, что может существенно увеличить эффективность стандартных схем противоопухолевого лечения. При положительном уровне данных окомаркеров, наряду с высокой пролиферативной активностью опухоли, можно рекомендовать проведение сопроводительной иммунотерапии с ЭИФТ+ПФ.
Список использованной литературы
1. Аксель Е.М., Давыдов М.И. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2004 г // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Бло-хина РАМН. - 2006. - Том 17, № 3
2. Кондриков, Н. И. Значение иммуногисто-химического определения биомаркеров плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки // Акушерство и гинекология. - 2010. - № 6. -С. 44-48.
3. Шаназаров, Н. А. Роль эпидермального фактора роста и его рецептора в канцерогенезе: молекулярные механизмы их действия // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - Т. 8, № 4. - С. 85-90.
4. Chan J.K., Tian C., Monk B.J. et al. Prognostic factors for high-risk early-stage epithelial ovarian cancer // The Am. J. of cancer. - 2008 - 112(10). - P. 220210.
5. Kerner R., Sabo E., Gershoni-Baruch R. et al. Expression of cell cycle regulatory proteins in ovaries prophylactically removed from Jewish Ashkenazi BRCA1 and BRCA2 mutation carriers: correlation with histopathology // Gynecol. Oncol. - 2005. - 99(2). - P. 367-75.
6. Khalifeh I., Munkarah A.R, Schimp V. et al. The impact of c-kit and ki-67 expression on patients prognosis in advanced ovarian serous carcinoma // Int. J. Gynecol. Pathol. - 2005 - 24(3). - P. 228-34.
7. Khouja M.H., Baekelandt M, Nesland J.M, Holm R. The clinical importance of Ki-67, p16, p14, and p53 expression in patients with advanced ovarian carcinoma // Int. J. Gynecol. Pathol. - 2007. - 26(4). -P. 418-25.
8. Schindlbeck C, Hantschmann P., Zerzer M. et al. Prognostic impact of KI67, p53, human epithelial growth factor receptor 2, topoisomerase Ilalpha, epidermal growth factor receptor, and nm23 expression of ovarian carcinomas and disseminated tumor cells in the bone marrow // Int. J. Gynecol. Cancer. - 2007. - 17(5).
- P. 104755.
9. Soussi, T. P53 website and analysis of p53 gene mutations in human cancer: forging a link between epidemiology and carcinogenesis / T. Soussi, K. Dehouche, C. Beroud // Hum Mutat. - 2000. - V. 15. -P. 105-113.
10. Stoenescu, T. M. Assessment tumor markers by immunohistochemistry (Ki67, p53 and Bcl-2) on a cohort of patients with cervical cancer in various stages of evolution / T. M. Stoenescu, L. D. Ivan, N. Stoenescu, D. Azoicai // Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iasi.
- 2011. - Apr.-Jun. - V. 115, № 2. - P. 485-492.
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ СОПРОВОДИТЕЛЬНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ НА ДИСБАЛАНС ЦИТОКИНОВ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ
Камышов С.В.
Республиканский специализированный научно-практический медицинский центр онкологии и радиологии Министерства Здравоохранения Республики Узбекистан, Ташкент
Kamyshov S.V.
Republican Specialized Scientific and Practical Medical Center of Oncology and Radiology,
Ministry of Health of the Republic of Uzbekistan
Аннотация
Анализ TNF-a/IL-6 и IFN-y/IL-6, показал, что в норме TNF-a/IL-6 равен 0,69, а IFN-y/IL-6 - 0,7. В группе больных РЯ до лечения: TNF-a/IL-6 - 0,53, а IFN-y/IL-6 - 0,58. В группе больных после ПХТ без применения иммунотерапии: TNF-a/IL-6 - 0,59, а IFN-y/IL-6 - 0,22. В группе больных в комбинации ПХТ и ЭИФТ: TNF-a/IL-6 - 0,66; IFN-y/IL-6 - 1,46. В группе больных в комбинации ПХТ и ЭИФТ+ПФ: TNF-a/IL-6 - 0,97, а IFN-y/IL-6 - 3,22. У больных РЯ до лечения и после ПХТ без иммунотерапии наблюдается выраженный дисбаланс цитокинов, который усугубляется на фоне ПХТ. В группах больных с применением ЭИФТ и ЭИФТ+ПФ с тималином, наблюдается положительная динамика в состоянии иммунной системы, что выражается в иммуномодулирующем действии IFN-y, который является лимфоцитарным цитокином, стимулирующим Т-клеточное звено иммунитета. Применение иммунотерапии в комбинации ПХТ на наш взгляд является оправданным и эффективным методом, который приводит к нормализации иммунологических показателей иммунной системы, позволяет улучшить непосредственные результаты лечения, приводить к уменьшению интоксикации заболевания.
Ключевые слова: цитокины, рак яичников, иммунотерапия
Key words: cytokines, ovarian cancer, immunotherapy
Введение. Рак яичников (РЯ) занимает стабильно 3 -е место в структуре онкогенитальной патологии. Смертность от РЯ превышает смертность от рака шейки матки и тела матки вместе взятых, несмотря на достигнутые успехи в диагностике и лечении [5,9]. Течение опухолевого процесса при РЯ сопровождается формированием эндотоксикоза и вторичной иммунной недостаточности. Следует отметить, что эндотоксикоз это сложный, многокомпонентный процесс, который обусловлен накоплением в тканях и биологических жидкостях
эндотоксических субстанций в условиях снижения физиологических процессов детоксикации. Проведение при этом химиотерапии способствует дальнейшему нарастанию эндогенной интоксикации, угнетению иммунокомпетентности организма, что осложняет течение основного онкологического заболевания, а иногда, при развитии органных и системных нарушений, ограничивает возможности для проведения адекватного курса противоопухолевого лечения [1,2]. Несмотря на высокую чув-
