CC BY
97
Биология
УДК 57.083.13
ОТРАБОТКА УСЛОВИЙ БИОКОНВЕРСИИ ОТХОДОВ СПИРТОВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ С ПОМОЩЬЮ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ
© 2009 г. И.В. Фадеева, НА. Атыкян, В.В. Ревин
Мордовский госуниверситет им. Н.П. Огарёва biotech@moris.ru
Поступила в редакцию 14.10.2009
Изучены процессы совместного культивирования при различных соотношениях молочнокислых бактерий и базидиального гриба Lentinus (Рапш) ^гтш ВКМ F-3616D на твердом осадке и нативной послеспиртовой барде. Показано, что совместное культивирование приводит к интенсификации роста культуры гриба, увеличению накопления биомассы как при жидкофазном, так и твердофазном процессе. При этом полученные препараты барды обогащаются дополнительным белком и не подвергаются микробиологической порче от 7-10 суток (жидкие препараты) до 2-3 недель (твердые препараты).
Ключевые слова: послеспиртовая барда, культивирование, грибы, молочнокислые бактерии, безотходная переработка.
Введение
В последние годы мировая индустрия производства спиртов росла огромными темпами [1, 2]. При этом ежегодно образуются различные органические отходы и побочные продукты (послеспиртовая барда, эфироальдегидная фракция, сивушные масла, диоксид углерода), среди которых особая сложность утилизации существует с послеспиртовой бардой, по причине ее значительных объемов (около 12 кг на 1 л произведенного спирта). В России около 10-15% от ее общего количества применяется в осенне-зимний период в натуральном виде для откорма скота и около 20% перерабатывается в кормовые препараты для животноводства. Однако большая часть барды, особенно в летний период, портится, т.к. из-за высокого влагосодержания не подлежит длительному хранению (не более 1-2 суток) [3, 4]. В этой связи на спиртзаводах достаточно часто происходит ее бесконтрольный сброс в окружающую среду. Принимая во внимание, что в послеспиртовой барде содержится значительное количество питательных веществ (сырой протеин, липиды, органические кислоты, макро- и микроэлементы), она является биологически нестабильной средой, в которой интенсивно развиваются процессы закисания и гниения. Поэтому сброс послеспиртовой барды без предварительной очистки представляет серьезную экологическую опасность для почвы и водоемов.
Проблема утилизации послеспиртовой барды актуальна практически для всех стран, где
осуществляется производство спирта, т.к. запрещается сбрасывать барду в водоёмы или в канализацию без предварительной переработки [5]. К настоящему времени в мире барду тем или иным образом перерабатывают, в основном на корма [б, 7], по достаточно энергозатратной технологии, основанной на сочетании процессов центрифугирования, вакуум-выпаривания и сушки. В результате получается сухая барда, выпускаемая за рубежом в виде нескольких продуктов - dried distillers grains (DDG), dried distillers grains and soluble (DDGS), wet wheat distillers' grains (WWDG). Многочисленные исследования показали, что кормовая ценность этих продуктов сопоставима с традиционными кормами [В, 9]. В России полный цикл переработки барды в «DDGS» реализован только на некоторых заводах.
Существует и ряд технологий микробиологической и биохимической биоконверсии барды путем культивирования на ней дрожжей, молочнокислых бактерий или ассоциаций микроорганизмов с добавлением грубых кормов и ферментов [10-13]. Молочнокислые бактерии к тому же обладают антагонистическим действием по отношению к патогенной микрофлоре желудочно-кишечного тракта, от которой ежегодно происходит гибель значительной доли молодняка сельскохозяйственных животных. Кроме того, добавление этих бактерий может способствовать консервированию барды (за счет накопления органических (прежде всего молочной) кислот и специфических антибиоти-
ков) и продлить срок ее хранения, а соответственно, и срок реализации без дополнительной энергозатратной сушки [14]. Недостатком молочнокислого заквашивания барды является относительно низкое накопление белка, что может быть компенсировано введением грибных культур, например базидиальных, характеризующихся высоким (до 56% от сухих веществ) содержанием белка и высокой гидролитической активностью [15].
Цель настоящей работы - разработка способа безотходной переработки послеспиртовой барды в кормовые препараты, путем совместного культивирования молочнокислых бактерий и гриба Lentinus (Panus) tigrinus BKM F-3616D на твердом осадке и нативной послеспиртовой барде, получаемой на ОАО «Мордовспирт».
Экспериментальная часть
Исследования проводили в периодических условиях, используя различные концентрации инокулята молочнокислых бактерий и гриба. В качестве инокулята молочнокислых бактерий использовали смесь молочнокислых стрепто-
кокков и лактобацил, используемую в молочной промышленности при производстве творога, которую разводили стерильной дистиллированной водой до концентрации 107 КОЕ/мл. Штамм гриба L. (Р.) tigrinus' ВКМ F-3616D [16] поддерживали в пробирках со скошенным сусло-агаром. Для приготовления инокулята гриб выращивали в течение 7 суток на жидкой среде Чапека-Докса. Выращивание инокулята вели в колбах Эрленмейера объемом 500 мл, содержащих 100 мл среды. Культивирование вели в условиях перемешивания на орбитальных термо-статируемых качалках при 200 об/мин, температуру поддерживали на уровне 26°С. Засев проводили кусочком агара, заросшего культурой гриба (приблизительно 1х1 см).
В опыте совместного культивирования гриба и молочнокислых бактерий инокуляты вносили в различных соотношениях, предварительно доводя рН барды до рН 7 при помощи 1 н КаОН. Культивирование на нативной барде проводили в периодических перемешиваемых условиях (200 об/мин). Твердый осадок барды получали центрифугированием при 8000 об/мин в течение 15 мин. На твердом осадке барды
8 2
s
о
я
м
Ї - ■ 4
/ .У У
>1
4
Время, сутки
а
3
3
2
0
2
б
В
Время, сутки
Рис. 1. Влияние количества внесенного инокулята на накопление биомассы грибом Ь. (Р.) tigrinus ВКМР-3616Б и молочнокислыми бактериями на нативной послеспиртовой барде: а - при концентрации грибного инокулята 0.1 г по абсолютно сухому весу (а. с. в.)/100 мл барды; б - при концентрации грибного инокулята 0.2 г по а.с.в./100 мл барды;
1 - без молочнокислых бактерий; 2 - 5-106 К0Е/100 мл барды; 3 - 107 К0Е/100 мл барды; 4 - 2-107 К0Е/100 мл барды
культивирование проводили в тонком слое (толщиной не более 2 см). В процессе культивирования контролировали прирост биомассы микроорганизмов (гравиметрически), белок (по методу Бредфорда, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин [17]), редуцирующие сахара (феррицианидным методом). Опыты повторяли по пять раз. Статобра-ботку проводили с использованием приложения Excel программного обеспечения Microsoft Office. Рассчитывали среднее арифметическое (М), среднеквадратичное отклонение (ст) и ошибку среднего (m).
Результаты и их обсуждение
Проведенные в обоих вариантах исследования показали, что совместное культивирование грибов L. (P.) tigrinus BKMF-3616D и молочнокислых бактерий благоприятно сказывается на
росте культур и позволяет получить довольно высокий выход белковой биомассы.
Так, в первой серии опытов с нативной бардой с вариацией концентрации грибного иноку-лята (от 0.1 г до 0.2 г по а.с.в. на 100 мл барды) и инокулята молочнокислых бактерий (от 5-10 до 2-107 на 100 мл барды) наблюдается увеличение выхода биомассы с увеличением концентрации последних. Кроме того, в варианте, где добавлен грибной инокулят в концентрации 0.1 г/100 мл барды, наблюдается самый низкий выход биомассы (рис. 1) и максимум накопления смещается на 6-8 сутки культивирования.
Положительное влияние совместного культивирования молочнокислых бактерий и грибов может быть обусловлено несколькими причинами. Во-первых, бактерии выделяют в среду культивирования молочную кислоту, в результате рН среды снижается, а грибы предпочитают именно кислые области рН [18]. Положительный эффект
0.5
ч 0.4
и о ч м 0.3
0.2
0.1
0
4
Время, сутки
м
2 4 б
Время, сутки
2
б
б
Рис. 2. Влияние количества внесенного инокулята на накопление белка грибом Lentinus BKMF-3616D и
молочнокислыми бактериями на нативной послеспиртовой барде: а - при концентрации грибного инокулята 0.1 г по а.с.в./100 мл барды; б - при концентрации грибного инокулята 0.2 г по а.с.в./100 мл барды; 1 - без молочнокислых бактерий; 2 - 5-106 КОЕ/100 мл барды; 3 - 107 КОЕ/100 мл барды; 4 - 2-107 КОЕ/100 мл барды
подтверждается и данными по изменению содержания растворимого белка (рис. 2).
Так, при низкой концентрации грибного ино-кулята (рис. 2а) и постепенном увеличении концентрации инокулята молочнокислых бактерий наблюдается образование большого количества внеклеточного белка уже на 4-6 сутки. Без добавления молочнокислых бактерий количество внеклеточных белков низкое и плавно возрастает в процессе культивирования, достигая максимума на 6-8 сутки культивирования. Вероятно, это обусловлено тем, что культура гриба - медленно растущая культура (по сравнению с бактериями) [19], а поэтому процесс накопления белков, в том числе и в связи с лизисом клеток, растянут во времени. В то же время бактерии быстрее растут, но и быстрее отмирают при достижении стацио-
нарной фазы, в связи с чем, вероятно, в этих вариантах наблюдается максимальный выход внеклеточного водорастворимого белка уже на 4-6 сутки. При этом после достижения максимума наблюдается некоторый спад содержания белка, что, возможно, связано с потреблением их грибами, т.к. в этих вариантах наблюдается более высокий выход биомассы. При увеличении концентрации грибного инокулята и варьировании содержания инокулята молочнокислых бактерий характер накопления внеклеточного белка имеет несколько другую картину (рис. 2б). Так, в варианте без добавления инокулята молочнокислых бактерий наблюдаются два максимума (на 4 и 8 сутки) накопления внеклеточных белков, что может быть обусловлено выходом каких-то внеклеточных ферментов на первых этапах культи-
Время, сутки
я
&
2
&
К
и
о
Время, сутки
Рис. 3. Влияние количества внесенного инокулята на накопление редуцирующих сахаров грибом ЬеШтш tigrinus BKMF-3616D и молочнокислыми бактериями на нативной послеспиртовой барде: а - при концентрации грибного инокулята 0.1 г по а.с.в./100 мл барды; б - при концентрации грибного инокулята 0.2 г по а.с.в./100 мл барды; 1 - без молочнокислых бактерий; 2 - 5-106 К0Е/100 мл барды; 3 - 107 К0Е/100 мл барды; 4 - 2-107 К0Е/100 мл барды
вирования, когда грибу необходимо питание. А питание данный тип грибов получает, гидролизуя полимерные субстраты - целлюлозу, лигнин и т.д. [20, 21]. Затем эти ферменты утилизируются самой культурой. Второй пик накопления белка связан уже, по-видимому, с началом литических процессов в культуре. В случае добавления молочнокислых бактерий картина накопления внеклеточного белка такая же, как и при содержании грибного инокулята 0.1 г по а.с.в./100 мл барды -ранний пик на 4 сутки культивирования (вероятно вследствие лизиса бактериальных клеток) и постепенное снижение содержания к 8 суткам (вероятно вследствие их потребления). Это согласуется и с данными, полученными по биомассе - максимальное накопление биомассы наблюдается на 8 сутки культивирования в варианте с 0.2 г грибного и 2-10 КОЕ бактериального инокулята на 100 мл барды.
Второй причиной увеличения выхода биомассы грибов и молочнокислых бактерий при совместном культивировании выступает то, что в барде присутствует довольно большое количество (до 2/3 от сухих веществ) клетчатки, которая разлагается грибами благодаря наличию у них мощного лигно- и целлюлолитического комплекса [18, 19], что обеспечивает поступление дополнительного количества углеводов, используемых кокультурами для роста.
Подтверждение нашего вывода можно проследить по изменению редуцирующих сахаров (рис. 3).
Как видно из рис. 3 происходит постепенное увеличение их концентрации до 4-6 суток, а затем резкое снижение до 8 суток, что, вероятно, связано с двумя фазами роста гриба и бактерий - на первых этапах гриб гидролизует высокополимерные компоненты барды до сахаров, вырабатывая внеклеточные ферменты (с этим связано и увеличение выхода белков (см. рис. 2). Затем начинается активное потребление сахаров, одновременно и интенсивный рост культур (см. рис. 1). То есть редуцирующие сахара играют роль, прежде всего, питательных компонентов, практически не накапливаясь в среде культивирования.
Проведенные на первом этапе исследования показали, что оптимальным вариантом культивирования на нативной барде с рН, доведенным до 7.0, является вариант 0.2 г по а.с.в./100 мл барды грибного инокулята и 2-10 КОЕ/100 мл барды инокулята молочнокислых бактерий. Выход биомассы в данном варианте на 8 сутки культивирования составил 6.7 г/л. Полученный препарат не подвергался микробиологической порче в течение 7-10 суток.
Во второй серии опытов мы проводили совместное культивирование молочнокислых бактерий и гриба на твердом осадке барды, влажностью 70-72%. При этом мы также увеличили и количество вносимых инокулятов до 1 г по
а.с.в. грибного на 100 г твердого осадка влажностью 72% и до 108 КОЕ молочнокислых бактерий на 100 г твердого осадка влажностью 72% (рис. 4).
сЗ
сЗ
О
О
о
и
о
&
о
к
Рис. 4. Влияние количества внесенного инокулята на накопление биомассы грибом Ьепіїпш ії^їпш ВКМЕ-3616D и молочнокислыми бактериями на твердом осадке послеспиртовой барды: 1 - гриб 1 г, молочнокислых бактерий 107 КОЕ; 2 - гриб 1 г, молочнокислых бактерий 5-107 КОЕ; 3 - гриб 1 г, молочнокислых бактерий 108 КОЕ; 4 - гриб 0.2 г, молочнокислых бактерий 5-107 КОЕ; 5 - гриб 2 г, молочнокислых бактерий 5-107 КОЕ на 100 г твердого осадка барды
Так, в вариашж с 1 г по а.с.в. грибного ино-кулята и с вариацией концентрации инокулята молочнокислые бактерий наблюдается практически одинаковый выеод сырой биомассы с увеличением концентрации молочнокислые бактерий (значения варьируют в пределax ошибки опыта).
В вaриaнтax с постоянным содержанием молочнокислые бактерий (З^Ю7 КОЕ) и варьированием концентрации грибного инокулята картина накопления биомассы коррелирует с увеличением концентрации последнего. Это связано с высоким содержанием в твердом осадке барды полимерные субстратов (до 1З% во влажном и 50% в сухом), разлагаемых поли-
ферментным комплексом гриба [22], что обеспечивает интенсивный рост кокультур. Максимальное накопление биомассы и внеклеточного растворимого белка наблюдается в варианте с З^Ю7 КОЕ молочнокислые бактерий и максимальной концентрацией грибного инокулята -1 г/lOO г осадка барды (рис. 4 и З).
Сопоставление полученные по биомассе и белку данные с динамикой накопления редуци-рующиx сaxaров выявило картину, аналогичную культивированию на нативной барде - с накоплением и потреблением по мере роста.
Таким образом, проведенные исследования показали, что оптимальным вариантом культивирования на нативной барде является внесение
й ю о 5 Ю й *
S о
и о
я
X
О
Сутки
п
& ю
S s
Ю й
t* 3 я о я о
я
я
о
и
о
а
З -
З -
1 -I
1 1 1 1 1
2 4 б Сутки 8
Рис. З. Влияние количества внесенного инокулята на накопление белка грибом Lentinus tigrinus BKMF^616D и молочнокислыми бактериями на твердом осадке барды: а - при концентрации грибного инокулята 1 г по а.с.в. и различного соотношения молочнокислые бактерий на 1OO г твердого осадка барды; 1 - 1O7; 2 - З^Ю7; З -1O8 КОЕ; б - при концентрации молочнокислые бактерий З^Ю7 КОЕ и различной концентрации грибного инокулята на 1OO г твердого осадка барды: 1 - O.2; 2 - 1; З - 2 г по а.с.в.
2
2
O
0.2 г по а.с.в./100 мл барды грибного инокулята и 2-107 КОЕ/100 мл барды инокулята молочнокислые бактерий, а на твердом осадке барды -1 г по а.с.в. на 100 г осадка грибного инокулята и 340 КОЕ на 100 г осадка инокулята молочнокислые бактерий. Выеод сырой биомассы на нативной барде составляет б.72 г/л барды, а с твердого осадка - 1б9 г/кг. Результаты изложенной работы позволили установить, что нативная барда и твердый осадок послеспиртовой барды, обработанные грибом и молочнокислыми бактериями, xaрaкте-ризуются повышенной биологической стойкостью и большим содержанием белка по сравнению с нативной бардой. В этой связи полученные оптимальные варианты могут быть использованы для производства кормовые препаратов, обогащенные белком и пробиотическими бактериями. А внедрение иx в производство позволит успешно решить проблемы безотxодной переработки послеспирто-вой барды в спиртовом производстве.
Список литературы
1. Pimentel D., Patzek T., Cecil G. // Rev. Environ. Contam. Toxicol. 2007. V. 189. P. 23-41.
2. Куxaренко А.А., Дадашев M.H. // Производство спирта и ликероводочнык изделий. 2004. № 2. С. 2З-2З.
3. Куxaренко А.А., Винаров А.Ю. // Пищевая промышленность. 2001. № З. C. ЗЗ-Зб.
4. Сорокодумов CH., Куxaренко А.А., Вина-ров А.Ю. // Пищевая промышленность. 2003. № 4. С. б0-б1.
3. Закон РФ «О государственном регулировании производства и оборота этилового спирта, алкогольной и спиртосодержащей продукции», ст. 8, п. 3.
6. Kim Y., Mosier N.S., Hendrickson R. et al. // Bioresour. Technol. 2008. V. 99. Iss. 12. P. З1бЗ-З17б.
7. Римарева Л.В., Лозанская Т.И., Худякова H.M. // Производство спирта и ликероводочнык изделий. 200б. № 2. С. 20-21.
8. Ham G.A., Stock R.A., Klopfenstein T.J. et al. // J. Anim. Sci. 1994. V. 72. Iss. 12. P. 3246-3257.
9. Klopfenstein T.J., Erickson G.E., Bremer V.R. // J. Anim. Sci. 2008. V. 86. P. 1223-1231.
10. Клиндюк А.М., Курдоглян А. М., Булатов А.П. // Кормопроизводство. 2004. № 4. С. 2-5.
11. Olstorpe M., Lyberg K., Lindberg J.E. et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74. Iss. 6. P. 16961703.
12. Курзин А.Б. // Пищевая промышленность. 2005. № 1. С. 25-30.
13. Vogel R.F., Knorr R., Muller M.R. et al. // Antonie Van Leeuwenhoek. 1999. V. 76. P. 403-411.
14. Lavermicocca P., Valerio F., Evidente A. et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. Iss. 9. P. 40844090.
15. Решетникова И.А. Деструкция лигнина ксило-трофными макромицетами. Накопление селена и фракционирование его изотопов микроорганизмами. М.: СП Новинтех-Пресс, 1997. 202 с.
16. Ревин В.В., Прыткова Т.Н., Лияськина Е.В., Черкасов В.Д., Соломатов В.И. Свидетельство о депонировании микроорганизма Panus (Lentinus) tigri-nus (Bulliard: Fries) Fries, 317. Регистрационный номер ВКМ F-3616 D присвоен 5 марта 1998 г.
17. Bradford M.M. // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254.
18. Ганбаров Х.Г. Эколого-физиологические особенности дереворазрушающих высших базидиаль-ных грибов. Баку: ЭЛМ, 1989. 180 с.
19. Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Атыкян Н.А. // Вестник ОГУ. 2003. Т. 22. № 4. С. 93-98.
20. Белова Н.В., Денисова Н.В. // Биотехнология. 2005. № 4. С. 55-58.
21. Гаврилова В.П., Шамонина В.П., Белова Н.В. // Биотехнология. 2002. № 5. С. 74-80.
22. Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Атыкян Н.А. и др. Фундаментальные и прикладные основы биотехнологии экологически безопасных композиционных материалов (монография). Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2004. 204 с.
REFINEMENT OF THE CONDITIONS FOR BIOCONVERSION OF ETHANOL PRODUCTION WASTES BY MEANS OF LACTIC ACID BACTERIA
AND BASIDIOMYCETES
I. V. Fadeeva, N.A. Atykyan, V. V. Revin
Joint cultivation processes have been studied for various proportions of lactic acid bacteria and basidium fungus Lentinus (Panus) tigrinus BKM F-3616D on spent distillers grains (wetcake) and in liquid mash. It has been shown that the joint cultivation results in a more intensive fungal culture growth and an increased biomass accumulation both in the liquid-phase and solid-phase processes. The preparations of distillers grain thus obtained are enriched by additional proteins and are not exposed to microbiological damage for a period from 7-10 days (liquid preparations) to 2-3 weeks (solid preparations).
Keywords: distillers grains, cultivation, fungi, lactic acid bacteria, non-waste technology.
