CC BY
29
В 2004 г. за цикл работ по созданию оригинальных химических и химико-энзиматических технологий и организации производства линейки противоопухолевых препаратов коллектив авторов в составе Е.Н. Калиниченко, Н.М. Литвинко, И.А. Михайлопуло, Г.В. Зайцевой, А.И. Зинченко, П.Т. Петрова удостоен звания лауреатов Государственной премии Республики Беларусь в области науки и техники. Итогом деятельности ученых стало объединение всех этапов умного производства: от научной идеи и разработки принципиально новых методов синтеза до их практического воплощения.
Исследования в области химии компонентов нуклеиновых кислот проводятся в нашей стране более 45 лет. Точкой отсчета развития этого направления в Беларуси стал 1970 г., когда начал создаваться Институт биоорганической химии и первый директор института академик Афанасий Ахрем пригласил кандидата химических наук Игоря Михайлопуло создать лабораторию химии нуклеотидов и полинуклео-тидов. Под руководством молодого ученого проводились систематические исследования в сфере химического и энзиматического синтеза модифицированных нуклео-зидов и нуклеотидов, разработки
http://innosfera.by
Химия компонентов нуклеиновых кислот получила успешное развитие в Институте биоорганической химии. Научные основы модификации нуклеозидов и методов их синтеза обусловили создание новых биологически активных соединений методом целенаправленного моделирования структуры.
УМНОЕ ПРОИЗВОДСТВО:
от научной идеи до ее практического воплощения
новых, высокоэффективных методов получения широкого спектра этого класса соединений, многие из которых являются противовирусными и противоопухолевыми препаратами, а также ценными инструментами биохимических и молекулярно-биологических изысканий, нацеленных на выяснение фундаментальных основ функционирования клетки.
Трудно переоценить вклад Игоря Михайлопуло в изучение химии, биохимии и биотехнологии компонентов нуклеиновых кислот. Им сформулирована концепция химико-энзиматического синтеза модифицированных нуклеозидов и нуклеотидов,разработаны научные основы модификации большого числа нуклеозидов и методов их синтеза, что обусловило поиск новых биологически активных соединений методом целенаправленного моделирования структуры. Кроме того, И. Михайлопуло впервые предложил комплексный биотехнологический подход к созданию модифицированных нуклео-зидов и олигонуклеотидов, исходя из ДНК или РНК, и получил новые знания об особенностях функционирования ряда ферментов нуклеинового обмена.
Новые методы
трансформации
нуклеозидов
Установление структуры дез-оксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), выяснение генетического кода и механизма реализации наследственной информации в бесконечное многообразие белков, постоянно углубляющееся понимание биохимии вирусной инфекции и трансформации нормальной клетки в злокачественную обусловили огромный интерес исследователей к этой области науки. Как
правило, нуклеозиды не проявляют биологической активности, и долгое время считалось, что они не могут служить источником химиотера-певтических средств. Однако в середине 1940-х гг. было высказано предположение, что внесение некоторых изменений в углеводную или гетероциклическую часть нуклеозидов может привести к созданию соединений с интересными биологическими свойствами. Уже к началу 60-х первые препараты для лечения вирусных инфекций и ин-гибирования опухолей вошли в медицинскую практику.
Лауреаты Государственной премии Республики Беларусь в области науки и техники 2004 г.: Е.Н. Калиниченко, Н.М. Литвинко, И.А. Михайлопуло, П.Т. Петров, А.И. Зинченко
Первоначально исследования,
проводившиеся в лаборатории химии нуклеотидов и полинуклеоти-дов ИБОХ, фокусировались на поиске новых высокоэффективных химических методов трансформации природных нуклеозидов, а также на получении нуклеозидов путем конденсации гетероциклических оснований с производными сахаров (конвергентный подход). В это время были разработаны методы синтеза аналогов природных соединений, модифицированных нуклеозидов, которые до сих пор находят применение как в лабораторных исследованиях, так и в виде технологических схем синтеза лекарственных препаратов.
Белорусскими учеными были созданы новые высокоэффективные методы, позволяющие осуществлять направленные превращения 1,2-диольных групп сахаров и нуклеозидов в дезокси-, хлор- и фтордезокси-производные. Для получения хлордезоксинуклеозидов предложен новый реагент - хлоран-гидрид ацетилсалициловой кислоты (ХААСК). В результате систематического изучения превращений 1,2-диольных групп сахаров и нуклеозидов под действием ХААСК был выяснен механизм трансформации и определена область применения широкого спектра аналогов природных соединений. На основе этого реагента разработана высокоэффективная технология получения противолейкозного препарата «Цитарабин», считающаяся по настоящий день лучшей в мире. Он зарегистрирован в СССР в 1987 г. и стал первым противоопухолевым препаратом, который выпускался из отечественной
фармсубстанции на экспериментальном заводе Института органической химии Латвийской ССР, ныне фирма «Гриндекс». В 1989 г. за создание и внедрение в производство «Цитарабина» сотрудники Института биоорганической химии АН БССР И. А. Михайлопуло и Е. Н. Калиниченко в составе коллектива авторов были удостоены Премии Совета Министров Латвийской ССР. В 1998 г. это противолейкозное средство начало изготавливаться на Республиканском унитарном предприятии «Белмедпрепараты».
Разрабатывались новые типы модифицированных нуклеозидов, потенциально активных в отношении вируса иммунодефицита (ВИЧ), в результате чего был создан препаративный метод синтеза 2',3'-дидезоксицитидина, зарегистрированного в Республике Беларусь в качестве лечебного средства для ВИЧ-инфицированных больных под торговым названием «Замицит®».
Нельзя не отметить огромный вклад в организацию производства этого препарата кандидата химических наук Петра Петрова, которым экспериментально и теоретически были обоснованы закономерности физико-химических превращений биополимеров под влиянием различных модифицирующих факторов (ионизирующее излучение, ультразвуковая и термодеструкция), разработаны технологические основы получения лекарственных форм противовирусных (6-меркаптопу-рина, тиогуанина) и противоопухолевых лекарственных средств «Цитарабина» и «Лейкладина».
В лаборатории химии нуклео-тидов и полинуклеотидов проводились широкие исследования
зависимости «структура - стереохимия», представляющие значительный интерес для понимания механизмов химических и биохимических реакций. Особенно выделяются работы по изучению мо-лекулярно-биологических аспектов нуклеинового обмена, соответствующих VI технологическому укладу, в результате которых установлено, что ферменты рестрикции ЕсоВ.1, ВатН1 и НтйШ в присутствии (2'-5')олигоаденилатов теряют свою сайт-специфичность и функционируют подобно неспецифическим ДНКазам. Этот эффект зависит от структуры (2'-5')олигоаденилата, его концентрации и типа рестриктазы. 5'-Дефос-форилированные олигомеры влияют на вторичную структуру ДНК Я, способствуя образованию односпи-ральных участков, которые могут расщепляться нуклеазой Б1. Различия в способности тримеров влиять на вторичную структуру ДНК связаны с их конформационными особенностями. Вопреки существующему мнению, экспериментально доказано, что стереохимический, а не структурный, фактор определяет устойчивость фтордезоксио-лигомеров к гидролизу 2'-фосфоди-эстеразой и активацию РНКазы Ь -ключевого фермента в механизме действия интерферона, от которого зависит эффективность расщепления вирусных мРНК. Эти данные позволили выявить соединения с высокой стабильностью и одновременно более высокой активирующей способностью, чем природный медиатор 2-5А.
Под руководством Е.Н. Калиниченко разработаны новые методы химического и химико-энзимати-ческого синтеза широкого спектра соединений, впервые установлено,
что роль альтернативных кофакторов - доноров фосфатных групп для нуклеозидкиназ - могут выполнять не только аденозин-5'-три-фосфат (АТФ), но и З'-дезоксиаде-нозин-2'-трифосфат и 2'-дезокси-аденозин-З'-трифосфат. Крупным научным вкладом является установление зависимости между структурой гетероциклического основания, с одной стороны, и стереохимией и геометрией фураноз-ного кольца - с другой. Изучение большого набора фтордезоксину-клеозидов впервые позволило обнаружить конформационно жесткие молекулы нуклеозидов, не содержащие дополнительных связей между гетероциклом и углеводным фрагментом молекулы. Жесткость последней определялась ориентацией атома фтора в углеводном фрагменте либо сочетанием модифицированного определенным образом гетерооснования и дезок-сифторфуранозного кольца. Установлена важная роль структурных и стереохимических факторов (2',5')олигонуклеотидов в регуляции литической активности клеток иммунной системы (природных киллеров, макрофагов) и ключевых ферментов противовирусного действия интерферона.
Результатом перечисленных работ стало создание в Республике Беларусь промышленного производства различных современных лекарственных средств для лечения рака крови, СПИДа, других вирусных заболеваний.
Доктором химических наук Натальей Литвинко впервые была установлена и экспериментально обоснована определяющая роль ну-клеозидфосфатов в регуляции фос-фолипидного обмена путем усиления активности внутриклеточных
фосфолипаз, нарушение которой в цепочке последующих реакций приводит к апоптозу (клеточной смерти). Обнаружено образование прочного комплекса компонентов нуклеиновых кислот с гомогенной фосфолипазой А2 - ферментом, гидролизующим фосфолипиды и не относящимся к нуклеиновому обмену. Предложены эффективные способы разделения комплекса, показано сопряжение увеличения активности фосфолипазы А2 с активацией монооксигеназной системы при превращении лекарственных средств в организме.
На пути синтеза соединений нуклеозидной природы
Поиск подходов к направленному регулированию природной защитной функции организма от вирусных инфекций и ряда патологий, а именно таковую осуществляет 2-5А-система, позволяет не только изучить механизм ее функционирования, но и создать соединения с высоким терапевтическим потенциалом (рис. 1). Обширный цикл работ, выполненный в лаборатории химии нуклеотидов и полинуклео-тидов, увенчался получением новых биологически активных соединений, позволивших выявить некоторые структурные и конформацион-ные факторы, определяющие процессы функционирования 2-5А-си-стемы [6, 7, 10-12]. Так, например, аналоги, у которых 2' (З')-терми-нальный аденозиновый фрагмент молекулы был замещен на 9-(2,3-ан-гидро-Р-Б-рибофуранозил)аденин или 9-(2,3-ангидро-Р-Б-ликсофура-нозил)аденин, не обнаружили токсичности, оказались значительно более стабильными в сравнении
Рис. 1. Эндогенная противовирусная защита клетки, которая индуцируется интерфероном в ответ на молекулы РНК, синтезирующиеся в вирус-инфицированных клетках
с природным медиатором 2-5А (рис. 1). При этом они селективно ингибировали интерлейкин-2, играющий ключевую роль в процессе отторжения пересаженных органов. Действительно, в экспериментах по трансплантации почки у кроликов и затем обезьян было установлено: оба соединения в низких концентрациях препятствуют отторжению и, что исключительно важно, повышают природные защитные функции организма в отношении вирусных инфекций вследствие увеличения концентрации лейкоцитарных интерферонов а и у приблизительно в два раза.
Вместе с тем оставалась нерешенной проблема синтеза биологически важных соединений нуклеозидной природы. Многие из них были ограниченно доступны или вовсе недоступны для углубленных медико-биологических исследований, что замедляло их продвижение в клиническую практику. Наиболее многообещающей стратегией представлялось рациональное
Г
сочетание эффективных химических методов синтеза и ферментативных трансформаций. Последние должны были заменить низкоэффективные, многостадийные химические схемы, в первую очередь реакции создания гликозид-ной связи между гетероциклическим основанием и углеводным фрагментом. Для химико-энзима-тического синтеза модифицированных нуклеозидов были объединены усилия сотрудников лаборатории химии нуклеотидов и полинукле-отидов Института биоорганической химии и лаборатории биотехнологии соединений нуклеиновой природы Института микробиологии НАН Беларуси, которой руководил доктор биологических наук А.И. Зинченко.
Итогом совместных исследований стали аналоги компонентов нуклеиновых кислот, что делает эти соединения доступными для углубленного изучения их
свойств и возможного последующего практического использования. Особо следует отметить разработку оригинальных технологий получения высокоэффективных лекарственных препаратов нового поколения «Лейкладин» (кладри-бин; 2-CdA) и «Флударабел» (флу-дарабина фосфат), которые имеют широкий спектр клинической активности в отношении лимфоид-ных злокачественных новообразований. Оба лекарства обладают огромным, дополняющим друг друга потенциалом в отношении различных злокачественных и аутоиммунных заболеваний. В 2002 г. в Республике Беларусь были зарегистрированы субстанция и лекарственная форма «Лейкладин», а в 2005 г.- «Флударабел» и организовано их производство.
НПЦ «ХимФармСинтез»
Разработка высокоэффективных противоопухолевых препаратов
Сектор активных фармацевтических ингредиентов (А) и сектор готовых лекарственных форм (Б)
обусловила создание в 2012 г. на базе Института биоорганической химии НАН Беларуси научно-производственного центра «ХимФармСинтез», который возглавила член-корреспондент Елена Калиниченко. Это уникальное открытое производство, охватывающее полную технологическую цепочку изготовления высокоэффективных противоопухолевых лекарственных средств - от научных исследований с использованием современных методов докинга до выпуска высокотехнологических фармсубстанций и готового препарата на базе отечественных разработок. Такая продукция сочетает в себе значительную наукоемкость, высокий уровень импортозамещения и может достойно конкурировать не только с азиатскими, но и европейскими производителями.
«ХимФармСинтез» занял свою нишу в области разработки и выпуска высокотехнологичных узкоспециализированных препаратов, направленных на лечение редких заболеваний. Сегодня в портфеле предприятия более 26 зарегистрированных наименований джене-риков и уникальных молекул. Обеспечение производства лекарственных средств фармацевтическими субстанциями - залог стабильности работы отечественной фармацевтики, что весьма важно с точки зрения национальной безопасности страны.
Стратегия научно-производственного центра - ориентация на современные высокотехнологичные субстанции, такие как пеметре-ксед, децитабин, бортезомиб, кла-дрибин, клофарабин, флударабина фосфат, ингибиторы тирозинкина-зы и др. На фармацевтическом рынке они, как правило, отсутствуют.
Изготовляют их 1-2 страны, имеющие высокий научный потенциал.
В НПЦ «ХимФармСинтез» создана и внедрена система управления качеством. Получен сертификат соответствия ТКП 030-2013 «Надлежащая производственная практика (GMP)» (26.10.2015 г.), подтвержденный в 2018 г., №BY/112 05 01.077 04388, удостоверяющий соответствие требованиям СТБ ISO 9001-2009 системы менеджмента качества применительно к производству. Контрольно-аналитическая лаборатория аккредитована на соответствие требованиям СТБ ИСО/МЭК 17025 по 300 методикам анализа.
На молодом предприятии за шесть лет работы разработаны оригинальные технологии производства 14 субстанций и 12 готовых лекарственных форм (ГЛФ), которые реализуются в Беларуси и России. Они полностью соответствуют требованиям европейских и американских фармакопей по качеству, а в ряде случаев и превосходят их. Созданы высокоэффективные технологии получения ряда новых соединений, а также известных, но малодоступных ранее нуклеозидных антибиотиков.
На основе химических методов синтеза на НПЦ «ХимФармСинтез» ежегодно производится более 100 кг иматиниба мезилата альфа-формы для нужд УП «Академфам».
Особо следует отметить разработку лекарственного средства «Бортезомиб», лиофилизированный порошок для приготовления раствора для внутривенного введения, 3,5 мг и 2,0 мг, для лечения пациентов с множественной миеломой. Это генерическое лекарственное средство, фармацевтически эквивалентное оригинальному препарату
«Велкейд®» и произведенное по полному циклу, начиная с отечественной фармацевтической субстанции. Сравнительный анализ «Велкейда®» (BSP Pharmaceuticals S. r.l., Италия/ Janssen Pharmaceutica N.V., Бельгия), «Бортезомака» (Натко Фарма ЛТД, Индия) и «Бортезомиба» подтвердил высокое качество отечественного препарата, его чистоту и низкое содержание примесей. Любая не специфицированная примесь составляет 0,06% при норме 0,3%, то есть в 5 раз ниже, чем у ориги-натора «Велкейд®», что подтверждено Протоколом испытаний №20/1 от 06.01.2016г ЛФФА РУП «ЦЭИЗ».
В рамках Государственной программы «Импортозамещающая фармпродукция» разработана технология производства фармсуб-станции и лекарственной формы отечественного препарата «Пеме-трексед» с учетом того, что возможности его применения для терапии опухолевых заболеваний далеко не исчерпаны.
В результате проведенного исследования улучшен промышленный способ получения ключевого полупродукта - тозилата пеметрекседа, что позволило сократить время протекания реакции глутаминирования карбоно-вой кислоты до 30-60 мин и снизить содержание примесей до 3,6%. Эта технология позволила также уменьшить суммарное количество сопутствующих примесей в субстанции, которое, согласно данным ВЭЖХ, не превышало 0,11%, при этом энантиомерная чистота препарата составляла не ниже 99,85%. Для доказательства были химически синтезированы все примеси, и анализ выполнялся на колонках, предназначенных для контроля энантиомеров.
Еще одним эффективным отечественным противоопухолевым препаратом, производимым по полному циклу, начиная с синтеза фарм-субстанции, является «Азацити-дин». Его сравнительный анализ с оригиналами «Вайдазой®» (Baxter Oncology GmbH, Германия) и «Вин-дузой» (Dr. Reddy's, Индия) по всем показателям подтвердил высокое качество отечественного лекарственного средства.
Производство от молекулы до готовой
лекарственной формы
Ограничивающим фактором
для широкого использования в медицинской практике «Азацити-дина» и «Децитибина» является их высокая гидролитическая нестабильность в водных растворах по сравнению с природным аналогом цитидином и известным противоопухолевым препаратом «Ци-тарабином». Возможное решение проблемы устойчивости «Азаци-тидина» - поиск новых производных, сходных по эффективности, но обладающих более высокой стабильностью и менее выраженной токсичностью. В этих целях был осуществлен синтез, изучена гидролитическая стабильность и биологическая активность новых аналогов «Азацитидина», содержащих атом фтора при С2'/С3'-по-ложениях углеводного фрагмента. Обнаружено одноименное вещество с атомом фтора при С(2') в арабино-конфигурации, проявляющее в 1,7 раза более высокую стабильность при физиологических рН и 9-10-кратное усиление специфического цитотоксическо-го эффекта по сравнению с известным препаратом «Азацитидином»,
Рис. 2. Модель связывания фторсодержащего структурного аналога иматиниба в активном центре онкобелка - мутантной тирозинкиназы
что делает его перспективным для дальнейших биологических исследований in vivo.
Среди разнообразных пури-новых фторнуклеозидов аналог 2'-фтор-арабиноаденозина с атомом хлора во 2-м положении гетероциклического основания, известный как «Клофарабин», обладает высокой активностью в отношении ряда опухолевых клеточных линий и используется в медицинской практике в качестве эффективного терапевтического средства нового поколения при лечении острой лейкемии у детей. Из доступных производных фтор-арабинофуранозы в НПЦ разработан и запатентован в Республике Беларусь оригинальный препаративный метод синтеза фармсубстанции клофарабина и организовано производство его лекарственной формы. Он зарегистрирован в Беларуси в 2017 г., начата его регистрация в России.
Особо следует отметить инновационное лекарственное средство «Лейковир» в форме кишечно-растворимых таблеток, которое рассматривается как перспективное для лечения рецидивирующего и хронического прогрессирующего рассеянного склероза. Это
иммунодепрессант второго поколения, имеющий более избирательное влияние на Т-лимфоциты по сравнению с такими депрессантами, как «Азатиоприн», «Циклофосфан» и «Метотрексат». Супрессорный эффект «Лейковира» проявляется в отношении Т-клеток, тогда как В-кле-точное звено иммунитета в диапазоне эквивалентных доз активируется. Препарат угнетает экспрессию антигенов СБ4+ лимфоцитов и значительно слабее влияет на СБ8+ клетки, что приводит к снижению их соотношения в 4 раза в сторону преобладания супрессорной функции Т-лимфоцитов. После его курсового применения селективный иммуно-супрессорный эффект продолжается несколько месяцев. «Лейковир» влияет также на экспрессию и секрецию воспалительных и регуля-торных цитокинов и хемокинов, ведет к стабилизации состояния пациентов и в ряде случаев способствует снижению инвалидизации при рассеянном склерозе.
В настоящее время в НПЦ «Хим-ФармСинтез» проводятся исследования по разработке аналогов ингибиторов тирозинкиназы и создания технологий производства современных таргетных препаратов.
Последние используются для лечения хронического миелоидного лейкоза. Учитывая вторичную резистентность пациентов, обусловленную появлением мутантных форм гибридного белка BCR-ABL тирозинкиназы, специалистами научно-производственного центра предложен подход к дизайну новых соединений, заключающийся в замене бензольного линкера в структуре иматиниба на менее объемный пиррольный фрагмент. Комбинаторным методом создана библиотека соединений, включающая 5 вариантов структурных фрагментов для аденинового кармана, 5 вариантов линкера и 2 фрагмента для DFG-out-кармана, аналогичных ингибиторам нилотиниба и понати-ниба. В качестве рецепторов применяются трехмерные структуры ряда терапевтически значимых белков класса тирозинкиназ. Удобным средством поиска их потенциальных ингибиторов, а также анализа комплексов «белок - лиганд» является молекулярный докинг на базе программного обеспечения AutoDock Vina.
Осуществлен химический синтез ряда новых структурных производных иматиниба, нилотиниба и сорафениба. Проведена компьютерная оценка эффективности связывания полученных соединений в активном центре тирозинкина-зы методом молекулярного докин-га (рис. 2).
На основании анализа результатов докинга известных ингибиторов были сформированы критерии для фильтрации соединений-кандидатов. Выявлены структуры, наиболее перспективные для синтеза и дальнейшего изучения в качестве потенциальных ингибиторов протеинкиназ.
Ориентация на использование результатов научных исследований в практике и создание современного высокотехнологичного научно-производственного центра «ХимФарм-Синтез» позволили организовать производство с применением разработанных химико-энзиматических и химических технологий новых отечественных фармсубстанций и высокоэффективных препаратов, являющихся социально важными для отечественного здравоохранения.
Рекомбинантные ферменты
Результаты фундаментальных исследований ферментов микроорганизмов легли в основу оригинальных химико-ферментативных технологий, разработанных в лаборатории молекулярной биотехнологии нуклеиновых кислот Института микробиологии НАН Беларуси, возглавляемой членом-корреспондентом Анатолием Зинченко. За 20-летний период ее деятельности здесь выполнено большое число работ, связанных с целенаправленной трансформацией нуклеиновых кислот и их компонентов.
Впервые в мире предложен уникальный биохимический подход к получению модифицированных компонентов нуклеиновых кислот, синтез которых только химически или ферментативно затруднен или невозможен. Удалось выявить микроорганизмы, клетки которых в наших технологиях выполняют роль маленьких химических фабрик. Семь культур микроорганизмов, отобранных и селектированных в качестве продуцентов ферментов, необходимых для гидролиза нуклеиновых кислот и трансформации их компонентов, переданы во Всероссийскую коллекцию
Человеческий аннексии-А5 Аденозиндезаминаза
Escherichia coli
Рис. 3. Схема молекулы химерного белка «Аннексин-Аденозиндезаминаза»
промышленных микроорганизмов Института «ВНИИ генетика» РАН. Эти штаммы в настоящее время включены в Белорусскую коллекцию непатогенных организмов, которая официально признана объектом национального достояния.
Сконструирован и запатентован рекомбинантный штамм бактерий, продуцирующий плазмиды, характеризующиеся наибольшим среди известных аналогов числом иммуностимулирующих СрО-мотивов. Впервые в мире получены нанораз-мерные частицы А1, М§-слоистых двойных гидроксидов, содержащих фармакологически перспективные СрО-ДНК и цикло-диГМФ, и показана способность высвобождать их в среду рН-зависимым способом. Эти данные свидетельствуют о перспективности использования полученных нанокомплексов в качестве рН-контролируемой системы доставки нуклеиновых соединений в клетки-мишени. По результатам исследований защищена диссертация «Разработка биотехнологических способов получения иммуностимуляторов нуклеиновой природы - СрО-ДНК и цикло-диГМФ», которая победила в конкурсе ВАК Республики Беларусь на лучшую
кандидатскую диссертацию 2015 г. в номинации «Естественные науки».
Кроме того, в лаборатории сконструированы и изучены три новых ре-комбинантных штамма Escherichia coli, продуцирующих нуклеозидфосфо-рилазы термофильной бактерии Thermus thermophilus. Впервые с использованием указанных ферментов синтезировано более десятка фармакологически перспективных, но малодоступных фторсодержащих ну-клеозидов, в том числе не описанный в литературе 3'-фтор-2',3'-дидез-окси-2-фтораденозин.
В итоге совместно с ИБОХ НАН Беларуси был установлен молекулярный механизм активации ключевого биокатализатора в синтезе компонентов нуклеиновых кислот (пуриннуклеозидфосфорилазы), который позволил определить исходные нуклеозиды для создания лекарственных препаратов с противоопухолевой и противовирусной активностью и синтезировать фармакологически перспективные фторпроизводные дезокси- и дидез-оксинуклеозидов. Разработка вошла в топ-10 результатов деятельности ученых НАН Беларуси в области фундаментальных и прикладных исследований за 2015 г.
БИОРЕАКТОРЫ
НА ОСНОВЕ СИСТЕМЫ
«фосфолипаза А2 -лиганд»
ФОСФОЛИПАЗА
КАСКАДНЫЕ БИОРЕАКТОРЫ
НА ОСНОВЕ СИСТЕМ:
«фосфолипаза А2 -цитохром Р450»
«фосфолипаза А2 гемоглобин»
Диагностика панкреатита
БИОБЕЗОПАСНОСТЬ ПЕСТИЦИДОВ
ПРОТИВОЯДИЯ И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ СРЕДСТВА
БЕЗОПАСНАЯ ДОЗА АНТИБИОТИКОВ
АНТИОКСИДАНТНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
Рис. 4. Биореакторы, на основе которых решаются поставленные задачи в энзимотерапии и диагностике
Под руководством Анатолия Зинченко сконструирован штамм бактерий, продуцирующих химерный белок, состоящий из человеческого аннексина-А5 и бактериальной аденозиндезаминазы (рис. 3). Согласно данным научной литературы, такой белок должен «снимать тормоз» с противоопухолевого иммунитета человека и служить высокоэффективным препаратом для терапии широкого круга онкологических заболеваний.
Предполагается, что по сравнению с аналогами препарат на основе химерного белка будет иметь более широкий спектр действия и отсутствие побочных эффектов. Эти особенности обусловлены тем, что в результате адресной доставки вещество будет связываться с молекулярной мишенью - фос-фолипидом, который выстилает поверхность только раковых клеток и отсутствует на поверхности
подавляющего большинства здоровых.
В лаборатории молекулярной биотехнологии экспериментально обоснована возможность металлизации плазмидной CpG-ДНК на-ночастицами меди в качестве одного из этапов при создании отечественного противоопухолевого препарата. Предложенный вариант более экономичен и экологически дружественен по сравнению со стандартными методами металлизации плазмид.
В перспективе лаборатория планирует изучить возможность создания на основе иммуностимуляторов нуклеиновой природы (CpG-ДНК и цикло-диГМФ) оригинального вакцинного препарата, способного превращать любую опухоль в «вакцину in situ», то есть в вакцину против самой себя. Имеются веские основания предполагать, что в скором
времени она станет главным оружием в арсенале терапевтического инструментария клиницистов в борьбе с раком.
Энзимотерапия и энзимодиагностика
Полученные результаты фундаментального характера, в том числе выявление участия в фосфолипо-лизе цитидин-содержащих нуклео-зидов и причастности фосфолипа-зы А2 к утилизации лекарственных средств, послужили основой для создания двух новых направлений прикладных изысканий и практических приложений фосфолиполи-за - энзимотерапии и энзимодиа-гностики. Работы в этой области ведутся в лаборатории прикладной энзимологии Института биоорганической химии НАН Беларуси под руководством доктора химических наук Натальи Литвин-ко. Для обеспечения исследований
такого рода разработан ряд биокаталитических систем (рис. 4). Одна из них - биореактор 1-го типа на основе системы «фосфолипаза А2 - лиганд», в которой в качестве лиганда выступают низкомолекулярные биорегуляторы - производные нуклеозидов, простагланди-нов, циклогександионов, органических кислот и др. Когда их инкубировали с ФЛА2 кобры, были обнаружены соединения с антигемолитическим действием - потенциальные антидоты (противоядия), при применении ФЛА2 поджелудочной железы - потенциальные противовоспалительные вещества со свойствами против панкреатита.
В настоящее время в качестве инновационных форм лекарственных препаратов используются конъюгаты (два соединения, связанные между собой химической связью) биологически активных
нуклеозидов с фосфолипидами, которые обеспечивают проникновение через клеточную мембрану, полностью ассоциированы с биологической средой и могут доставлять нуклеотид в различные клетки, в том числе в такие труднодоступные участки тела человека, как лимфатические узлы. Однако при прохождении таких конъюгатов к органу-мишени через желудочно-кишечный тракт возможно изменение их устойчивости вследствие разрушительного воздействия на фосфо-липидный «якорь» липолитических ферментов, в частности панкреатической фосфолипазы А2.
Следует отметить, что до сих пор о химии и биологической активности химерных конъюгатов компонентов нуклеиновых кислот с фосфолипидами известно немного, а их устойчивость к действию пищеварительной ФЛА2 практически не изучена.
При использовании нуклеозидов в качестве лигандов в биореакторах 1-го типа обнаружено, что устойчивость конъюгатов, образованных в результате многостадийного химического синтеза компонентов нуклеиновых кислот и фос-фолипидов, к атаке панкреатической фосфолипазы А2 зависит от нуклеозидной компоненты субстрата. При этом показано прямое действие моно-, ди- и трифосфатов нуклеозидов на фермент, без участия киназ. Найдены эффективные ингибиторы фосфолиполиза - фос-фодиэфирные производные аци-кловира, аденозина и рибаверина.
В отсутствие лиганда при условии использования липосом в качестве субстрата для ФЛА2 панкреаса проведена оценка их противоэнзимной устойчивости и предложены составы липосом, наименее подверженные ферментативному разрушению. Обнаружены
ТЕСТ-КОНТРОЛЬ 1
Гелевая пластинка с яичным желтком
(субстрат)
ТЕСТ-КОНТРОЛЬ 2
Мицеллы - модель фрагмента пищи (субстрат)
ТЕСТ-КОНТРОЛЬ 3
Липосома - модель клеточной стенки кишечника (субстрат)
Отечественный пестицид «Грасп» (граминицид)
Наблюдаемый эффект в предельно допустимых дозах: отсутствие действия - биобезопасность, ингибирование или активация приводит к патологии
ТЕСТ-КОНТРОЛЬ 4
Гемолиз цельных эритроцитов крови, инкубируемых в изотоническом растворе в присутствии ФЛА2, и испытуемого соединения, без которого фермент не способен разрушать клеточную оболочку этих форменных элементов крови
Рис. 5. Уникальная тест-система для контроля биобезопасности пестицидов
липонуклеотиды с повышенной
устойчивостью к действию ФЛА2: на основе фосфатидилэтанолами-на с замещенным этаноламиновым фрагментом на ацикловир, а также уридинсодержащее производное компонента нуклеиновых кислот с фосфатидовой кислотой. На их основе получены липосомы как потенциальная лекарственная форма нового поколения.
На основе биреакторов 2-го типа была разработана система мониторинга безопасности пестицидов, состоящая из серии тестовых контролей. Пестицид инкубируется с пищеварительной ФЛА2 (рис. 5). И ее активность определяется на основе четырех контрольных тестов. В первом используются гелевые пластины с яичным желтком в качестве пищевого элемента. Второй тест имитирует отдельный акт переваривания пищи - гидролиз фосфолипида, эмульгированного желчными кислотами. Третий контроль показывает влияние ФЛА2 в присутствии пестицида на липосомы в качестве модели кишечной стенки. В четвертом испытании пестициды апробируют на способность инициировать разрушение клеточной стенки эритроцита под действием ФЛА2, которая обычно не может гидролизовать фосфоли-пиды красных кровяных телец. Наблюдаемый эффект в максимально допустимых дозах: отсутствие действия - биобезопасность, ингиби-рование или активация - приводит к патологии. Было опробовано более 30 пестицидов разных классов. Выход гемоглобина из эритроцитов наблюдался только в присутствии пестицидов, имеющих структуру циклогександиона.
В лаборатории, возглавляемой Натальей Литвинко, созданы
каскадные биореакторы, содержащие два белка, вступающие в действие поэтапно на основе систем «фосфолипаза А2 - цитохром Р450», предложенные с целью определения безопасной для желудочно-кишечного тракта дозы антибиотиков. Показано, что в их присутствии цитохром вызывает увеличение активности фосфолипазы А2 поджелудочной железы, которая затем при превышении допустимого уровня может разрушить стенку кишечника. Таким образом, наблюдаемый эффект показывает: без проявления действия доза безопасна, при инги-бировании или активации ФЛА2 -ее необходимо уменьшить.
Биореакторы 2-го типа «фосфолипаза А2 - гемоглобин» использованы для создания и внедрения в клиническую практику не имеющего аналогов в мире диагностического набора «ФЛА2-ФОА» для выявления больных некротическим панкреатитом. Уровень активности РЬА2 известен как диагностический маркер этого заболевания. В качестве количественного показателя активности фосфоли-пазы А2 специалисты лаборатории применили разностный спектр гемоглобина. Доклинические и клинические испытания набора «ФЛА2-ФОА» в обоих случаях показывают хорошую корреляционную активность этого фермента с наличием или отсутствием панкреатита.
Совместно с ХОП ИБОХ создано производство набора «ФЛА2-ФОА», которое с 2015 г. осуществляет его выпуск. В настоящее время система «фосфолипаза А2 - гемоглобин» апробирована с целью определения антиоксидантного статуса организма - критерия, важного для принятия решения о необходимости хирургического вмешательства
и способности организма восстановиться после этого.
Впервые в мире для установления повреждающего действия активных форм кислорода на биоструктуры, широко исследованного учеными, задействована его первичная мишень - непосредственно фосфолипиды вместо традиционно применяемого вторичного продукта их частичной деградации -малонового диальдегида. Инструментом впервые послужила активность сверхчувствительного к окисленным фосфолипидам фермента фосфолипазы А2, определяемая по спектральным изменениям гемоглобина в области полосы Соре. Это обеспечило более полную оценку общей антиоксидантной активности, то есть позволило охарактеризовать сопротивляемость организма и его резервы к восстановлению в результате оперативного вмешательства. Приоритет этого направления подтвержден патентами Республики Беларусь №19670 и №19669.
Антиоксидант Тго1ох и сыворотка крови человека оказывали защитный эффект к действию ультрафиолета - уменьшали наблюдаемое превышение активности ФЛА2 по отношению к окисленным фос-фолипидам, что делает эту модель перспективной для определения общей антиоксидантной активности биологических жидкостей.
Обнаружена хорошая корреляция между защитной способностью сыворотки крови к ультрафиолетовому облучению олеиновой кислоты путем обнаружения спектральных изменений миоглобина и уровнем развития панкреатита. Также показана действенность этого подхода на примере защитной способности черного и зеленого чая
к ультрафиолетовому облучению фосфатидилхолина. За открытие нового универсального индикатора антиоксидантного потенциала организма на основе фосфолиполи-за УФ-облученных фосфолипидов эти результаты включены в топ-10 НАН Беларуси 2017 г. Новизна полученных результатов защищена более чем 15 патентами Республики Беларусь и Евразийского патентного ведомства.
Новые инструменты
биотехнологии
нуклеозидов
В последние годы членом-корреспондентом Игорем Михайло-пуло совместно с Отделом биотехнологии Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (заведующий отделом - академик Анатолий Мирошников) предложена мульти-ферментная, каскадная стратегия синтеза биологически значимых модифицированных нуклеозидов.
Установлен молекулярный механизм активации ключевого биокатализатора в синтезе компонентов нуклеиновых кислот (пуринну-клеозид фосфорилазы, в том числе из бактериальных источников), который позволил определить исходные нуклеозиды для создания лекарственных препаратов с противоопухолевой и противовирусной активностью и синтезировать фармакологически перспективные дезокси- и 2',3'-дидезоксинуклеози-ды, содержащие атом фтора в углеводной части молекулы. Проведено сравнительное изучение каталитической активности нативного фермента и его мутанта, у которого аминокислота каталитического центра серин-90 заменена на ала-нин. В результате был получен
фермент с измененными свойствами и изучен ряд новых аналогов природных субстратов. Созданы также новые модифицированные нуклеозиды, представляющие интерес с точки зрения их биологических свойств и в качестве инструментов биохимических и молеку-лярно-биологических исследований. Эта работа была выполнена в кооперации с учеными лаборатории биоорганической химии и химической биологии Центра нано-технологий Технопарка Мюнстера (Германия) и Университета штата Мэриленд (Балтимор, США). Полученные результаты позволили авторам сформулировать подходы к направленному биотехнологическому синтезу модифицированных нуклеозидов для молекулярной биологии и в качестве компонентов коротких олигонуклеотидов, которые, по мнению ученых, перспективны для создания препаратов нового поколения для лечения вирусных и онкологических заболеваний. В настоящее время изучается механизм функционирования пиримидиннуклеозид-фос-форилаз, которые, наряду с ПНФ, стали важными инструментами биотехнологии модифицированных нуклеозидов.
* * *
Таким образом, научное направление химии компонентов нуклеиновых кислот успешно развивается, о чем свидетельствуют полученные награды и внедренные в производство разработки.
Фундаментальные результаты удостоены Премии НАН Беларуси и РАН (И.А. Михайлопуло), включены в топ-10 НАН Беларуси в 2015 г. (И. А. Михайлопуло,
А.И. Зинченко) и 2017 г. (Н.М. Лит-винко), публикуются в престижных научных журналах с высоким импакт-фактором.
Работы поддержаны МНТЦ и Белорусским республиканским фондом фундаментальных исследований. Подготовлен отдельный проект, в котором предлагается по каскадному принципу применить ферменты фосфолиполиза (фосфолипазу D и фосфолипазу А2) для синтеза липонуклеотидов с последующим установлением резистентности их фосфолипидного «якоря» к деградации (руководители Н.М. Литвинко, И.А. Михайлопуло, А.И. Зинченко).
Активно ведется подготовка научных кадров. Так, на счету члена-корреспондента Игоря Михайлопуло - 10 кандидатов наук и консультирование двух докторских диссертаций; члена-корреспондента Елены Калиниченко - 2 кандидата наук и консультирование защиты докторской, под руководством члена-корреспондента Анатолия Зинченко защитилось 8 диссертантов; доктор химических наук Н.М. Литвинко подготовила 3 кандидатов наук, 2 магистрантов и курировала написание более десятка дипломных работ.
Исследованиями в этой области был заложен потенциал для создания лекарственных средств новых поколений, аналогов которых пока нет ни в нашей стране, ни за рубежом. Это таргетные препараты, конъюгаты фармацевтически важных нуклеозидов с фосфолипидами, а также полинуклеотиды, сочетающие интерфероногенную активность и свойства депо-форм противовирусных и противоопухолевых субстанций.
