CC BY
17
Медицинская диагностика нового уровня
Исторически сложившееся в нашей стране направление функциональной биохимии как ее физиологического аспекта в настоящее время получило развитие на уровне изучения механизмов отдельных химических реакций. Для решения этой задачи на молекулярном уровне необходимо было выделить из клеток многочисленные соединения, определить их структуру и функции. Современный уровень исследования требует от экспериментатора установить, от каких изменений структуры химических соединений нарушилась та или иная функция с целью ее коррекции.
Диагностические средства иммунохимического микроанализа
В середине прошлого столетия на границе химии природных соединений и биохимии зародилась новая наука — биоорганическая химия, главная задача которой — установление взаимосвязи между строением природных органических веществ и выполняемой ими в живом организме функцией. Такой подход стал основным в работе ученых Института биоорганической химии НАН Беларуси (ИБОХ НАН Беларуси). Результаты изучения взаимодействия «структура — функция» в ряду биополимеров (белков, гликопротеинов, ДНК, РНК) и низкомолекулярных биорегуляторов (компонетов нуклеиновых кислот, гормонов, производных липидов)
явились основой разработки новых методов диагностики, создания лекарственных препаратов, проведения научных исследований различного профиля.
При некоторых наследственных болезнях обмена веществ биохимические проявления мутантных генов предшествуют возникновению клинических симптомов. Именно поэтому путь исследований от молекулярного уровня до формирования первых признаков заболевания остается ключевым в анализе механизма патогенеза, его диагностики и последующего лечения. При подозрении на наследственную патологию применяют соответствующие биохимические методы.
В основе одного из современных подходов лежит многократное удвоение при полимеразной цепной реакции определенного участка ДНК. В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуального определения (ПЦР-диагностика). Такой способ химического исследования биологических макромолекул позволяет обнаружить новые наследственные аномалии или склонность к их развитию, количественно оценить профиль экспрессии генов в образцах опухолевых и других тканей, что обеспечивает точность постановки диагноза и влияет на выбор схемы лечения пациентов.
В Институте биоорганической химии НАН Беларуси созданы средства молекулярной диагностики на основе ПЦР-диагностики для применения в области сельского хозяйства, спорта, медицины. В 2007—2008 гг. с использованием метода ПЦР разработаны эффективные способы определения полиморфизма генов ангиотензин-превращающего фермента, брадикинина, эндотелиальной синтазы окиси азота, которые позволяют прогнозировать выносливость спортсмена и способность противостоять значительным физическим нагрузкам, установить предрасположенность человека к риску развития сердечно-сосудистых заболеваний, таких как артериальная гипертензия и гипертрофия левого желудочка на ран-
ней стадии, с целью своевременного принятия профилактических мер. (В.А. Си-нелёв, А.С. Бабенко, И.Е. Майоров, С.А. Усанов).
Разработан метод определения уровня экспрессии онкогена Her~2 в опухолевых тканях молочной железы человека, который основан на ПЦР и отличается высокой степенью воспроизводимости результатов, а также надежной системой положительных и отрицательных контролей. Гиперэкспрессия онкогена Her~2 позволяет диагностировать развитие карцином молочной железы человека. Процедура состоит из этапа выделения высокоочищенного препарата общей РНК из гомогената опухолевой ткани, получения РНК/ДНК дуплекса и последующей амплификации специфического фрагмента кДНК в реальном времени (А.С. Бабенко, В.А. Синелёв, И.Е. Майоров, С.А. Усанов).
ПЦР-диагностика нашла применение в методе ускоренной диагностики туберкулеза, поскольку традиционные детекции туберкулеза (обычная и люминесцентная микроскопия, культуральные методы) обладают низкой чувствительностью и требуют длительного времени для получения результата. Туберкулез, как известно, хроническая бактериальная инфекция. Ежегодно им заболевают около 8 млн человек, около 3 млн из них умирают от его осложнений (из них 100 тысяч — дети). Род Мусоbасterium насчитывает несколько десятков видов. Однако туберкулез у человека вызывают М.tuberculosis, М.bovis и М.africanum, которые входят в М.tuberculosis complex. Секвенирование геномов представителей микобактерии позволило подобрать специфичные оли-гонуклеотидные праймеры и провести ПЦР-анализ для идентификации комплекса Мусоbасterium tuberculosis с высокой специфичностью и дифференцировать его от других представителей микобак-терии (А.В. Василевская, Г.В. Сергеев, А.А. Гилеп, С.А. Усанов).
Актуальной остается проблема изучения клинического полиморфизма наследственной патологии. Благодаря откры-
ФедорЛАХВИЧ генеральный директор ГНПО «Химический синтез и биотехнологии» — директор Института биоорганической химии НАН Беларуси, академик
Наталья ЛИТВИНКО заместитель академика-секретаря Отделения химии и наук о Земле, доктор химических наук
тиям в области биохимической генетики и цитогенетики обнаружены новые наследственные аномалии. Как правило, та или иная известная ранее наследственная болезнь представляет группу клинически сходных, но генетически разных состояний (явление генетической гетерогенности).
Генетическая гетерогенность и изменение проявления главного гена под влиянием других генов или факторов окружающей среды с генетической точки зрения — основные причины клинического полиморфизма наследственных болезней.
Исследование полиморфизма моноок-сигеназ играет важную роль в установлении риска возникновения и диагностике химически индуцируемых раковых опухолей. Это связано с проблемой патологических эффектов, оказываемых низкомолекулярными соединениями эндогенного и экзогенного происхождения и необходимостью установления механизмов защиты организма от нежелательных химических воздействий. В определенных условиях окисление низкомолекулярных соединений в организме некоторыми изоферментами цитохрома Р-450 (Р-4501А1, Р-4501В1) приводит не к их детоксикации, а к метаболической активации, образованию канцерогенов, способствующих возникновению и развитию раковых опухолей. Известно, что гены, кодирующие оба типа цитохрома Р-450, полиморфны. Совместно с немецкими учеными впервые были сконструированы бакуловирусные плазмиды, включающие ген дикого типа СУР1А1*1 и два его наиболее часто встречающихся мутированных варианта — СУР1А1*2 и СУР1 А1*4, проведены экспрессия соответствующих белков в клетках линии насекомых Spodoptera frugiperda, а также физико-химическая характеристика полученных гемопротеидов и исследована их каталитическая активность в отношении субстратов, потенциально метабилизи-рующихся в канцерогены. Это позволило выяснить функциональную значимость точечных замен аминокислот в структуре цитохрома человека, что очень важно для выявления механизма развития онкологических заболеваний и их диагностики на ранней стадии болезни (П.А. Киселев, Н.А. Бовдей, В.-Х. Шунк, Д. Шварц).
Разработана новая, отличающаяся высокой специфичностью методология диагностики воспалительных процессов в организме по выявлению липолити-ческой активности в биологическом ма-
териале. Впервые содержание метаболитов фосфолиполиза, сопутствующих воспалению, в клетках альвеолярных макрофагов, сыворотке крови здоровых доноров и больных острым панкреатитом определялось при участии метгемогло-бина с использованием разностной спек-трофотометрии (Н.М. Литвинко, Л.А. Ско-ростецкая, С.В. Кучуро, Г.Н. Рахуба). Метод был адаптирован к возможностям отечественного прибора СФ «СОЛАР», применяемого в клинической практике (Н.М. Литвинко, Л.А. Скоростецкая).
Уровень активности панкреатической фосфолипазы А2 (ФЛА2), гидролизующей фосфолипиды, считается высокоспецифичным диагностическим маркером острого некротического панкреатита. Поэтому липолитическая реакция с участием панкреатической ФЛА2 послужила основой разработки способа для поиска средств антипанкреатитного действия среди физиологически активных соединений (Н.М. Литвинко, Т.А. Желдакова, С.В. Кучуро, Е.Р. Филич, патент Республики Беларусь №5752 от 07.08.2003), в том числе производных тиотетроновой кислоты (Д.Б. Рубинов, Т.А. Желдакова, Н.М. Литвинко, С.В. Кучуро, Г.Н. Рахуба, патент Республики Беларусь №10191 от 24.10.2007). С целью применения ФЛА2 в диагностических целях был создан уникальный способ ее выделения из поджелудочной железы, основанный на экстракции фермента с помощью субстрата, растворенного в органическом растворителе, в отсутствии кофактора (Н.М. Литвинко, патент Республики Беларусь №8416 от 29.05.2006).
Важную группу продукции, связанной с фармацевтической отраслью, составляют лечебно-диагностические препараты высокой социальной значимости. Разработка диагностических наборов осуществлена в ИБОХ НАН Беларуси и силами ученых организован их выпуск в созданной инновационной структуре — на хозрасчетном опытном производстве ИБОХ в количествах, обеспечивающих потребности страны. Методы и средства иммунохимического микроанализа
нашли широкое применение в медицине. Они позволили осуществить массовую профилактику разнообразных заболеваний, обеспечить условия для проведения всеобщей диспансеризации населения республики, а также для организации современной диагностической службы с использованием большого ассортимента РИА- и ИФА-наборов реактивов (более 30 наименований), выпускаемых ХОП ИБОХ. За разработку и внедрение в практику здравоохранения радиоиммунологических средств микроанализа и организацию их производства коллектив ученых ИБОХ (А.А. Ахрем, О.А. Стрель-ченок, Н.В. Пивень, В.Л. Чащин) удостоен в 1988 г. Государственной премии БССР в области науки и техники. Это направление успешно развивается.
Синтезирована по оригинальному способу 5-аминолевулиновая кислота (5-АЛК), которая применяется для фотодинамической диагностики и терапии злокачественных опухолей (Ф.А. Лахвич, М.А. Кисель, И.В. Тростянко, В.И. Дол-гопалец, патент Республики Беларусь №10019 от 27.08.2007).
В 2005—2007 гг. разработано программное обеспечение автоматизированной информационной системы комплексной оценки функции щитовидной железы, которое внедрено в работу спецполиклиники РУП «ПО «Беларуськалий» (Н.В. Пивень).
Рассматривается возможность использования в перспективе аутоантител к дека-рбоксилазе глютаминовой кислоты — высокоинформативном патогенетическом маркере сахарного диабета 1-го типа как количественного критерия для диагностики и изучения патогенеза инсулинзависи-мого сахарного диабета, оценки степени выраженности и прогнозирования развития аутоиммунного поражения поджелудочной железы при сахарном диабете 1-го типа у детей и взрослых (Н.В. Пивень, Е.Е. Орлова, Л.Н. Лухверчик).
По данным Всемирной организации здравоохранения, нарушения функции щито-
видной железы приближаются по частоте встречаемости к сердечно-сосудистым патологиям и диабету. Наиболее распространенные неонкологические заболевания тироидного профиля имеют аутоиммунную природу, а их диагностическими маркерами являются аутоантитела (ААТ) к тироантигенам — тироглобулину (ТГ), тиропероксидазе (ТПО) и рецептору ти-реотропного гормона. Своевременное распознавание аутоиммунного процесса определяет эффективность применения терапевтических средств, поэтому разработка быстрых, чувствительных и недорогих методов анализа приобретает все большее значение. Для определения ААТ к ТГ и ТПО использовали принцип иммунометрического анализа, основанный на прямом взаимодействии растворенных ААТ с иммобилизованным антигеном. (К.И. Михайлопуло, О.В. Цыганова, Е.П. Киселева, И.А. Кемежук).
По аналогии с биотинилированным тироксином был синтезирован конъюгат, содержащий остатки витамина Н (био-тин — Бт) и гормона щитовидной железы 3,3',5-трийод-1--тиронина (Тз). Конъюгат Бт-Тз испытан в качестве бифукниональ-ного лиганда в нескольких лабораторных тест-системах по определению концентраций Тз в сыворотке крови человека. Оказалось, что по сравнению с традиционно употребляемыми для этой цели гормон-белковыми конъюгатами низкомолекулярный Бт-Тз имеет ряд преимуществ. Главное из них заключается в гораздо более выраженной и понятной стехиометрии и прогнозируемости реакций специфического связывания с его участием. Кроме того, Бт-Тз проявил большую стабильность в условиях применения и длительного хранения, чем тирогормоны, конъюгированные с белками.
По результатам компьютерного моделирования взаимодействий Бт-Тз и био-тинсвязывающего гликопротеина авиди-на предложена модификация иммуно-ферментной тест-системы, в которой на первой стадии происходит взаимодействие Тз пробы с анти-Тз-ПХ, а уже по-
яч- ■ it
л/ i^-P
Панкреатическая фосфолипаза А2
Клеточная мембрана
Разностный спектр метгемоглобина (Met-Hb) -количественный показатель активности фосфолипазы А2 в сыворотке крови здорового (1) и больного ОП (2) пациента
уровень активности -диагностический признак острого некротического панкреатита (ОП)
HjO i^coa+H* жирная кислота
Использование липолитической реакции для диагностики воспалительных процессов
том в реакционную среду вводится Бт-Тз, который взаимодействует с оставшимися незанятыми Тз-связывающими сайтами анти-Тз-ПХ. Предложенная система неконкурентна, и ее преимущества выявлены в эксперименте (М.Е. Новаковский, О.В. Жоров, Н.В. Кузуб, И.И. Вашкевич, О.В. Свиридов).
Специфический антиген предстательной железы (ПСА) — наиболее точный маркер злокачественных опухолей предстательной железы. В сыворотке крови человека основной молекулярной формой общего иммунореактивного ПСА является комплекс ПСА с ингибитором протеаз а1-антихимотрипсином, свободный ПСА составляет 5—30% иммунореактивного ПСА. Соотношение свободного и общего ПСА выступает как критерий для дифференциальной диагностики между раком и доброкачественной гиперплазией предстательной железы. При оптимальных условиях проведения иммунохимических реакций необходимый уровень чувствительности иммуноэнзимометрических систем для определения общего и свободного ПСА достигается и при одностадийном проведении анализа.
С использованием международных стандартов ВОЗ свободного и общего ПСА, включающего 90% связанного с а1-анти-химотрипсином и 10% свободного ПСА, показана достоверность определений с помощью разработанных иммуноэнзи-мометрических тест-систем обеих молекулярных форм ПСА (А.И. Щербань, О.В. Жоров, Н.В. Кузуб).
В реализации механизмов программированной смерти клеток (апоптоза) ключевую роль играют каспазы — семейство сериновых протеиназ, катализирующих гидролиз пептидных связей, образованных карбоксильными группами аспараги-новой кислоты. Апоптоз ответственен как за удаление ненужных клеточных структур и неполноценных нефункциониру-ющих клеток в процессах онтогенеза и гомеостаза, так и за развитие патологических состояний, в частности сердечнососудистых, аутоиммунных, онкологи-
ческих заболеваний. Осуществлен синтез набора субстратов каспаз пептидной природы. Разработанные схемы перспективны для синтеза флуорогенных субстратов, у которых отщепляемым фрагментом являются производные аминокумарина, что позволит количественно определить активность каспаз, охарактеризовать степень выраженности процессов апоптоза и диагностировать функциональное состояние тканевых и плазматических клеток (В.П. Голубович, О.В. Грибовская, В.П. Мартинович).
Таким образом, ученые-химики находятся на передовых рубежах: разрабатываются новые методы диагностики болезней человека, создаются современные средства и выделяются в высокочистом
состоянии маркеры для этих целей.
Диагностические средства уже вышли из стен лабораторий и широко используются потребителями. Еще недавно в аптеках не было диагностических тестов для установления факта беременности, определения уровня глюкозы в крови, моче и др. Теперь они стали доступными для населения.
Прогресс в этой области знания идет наиболее быстро, и можно с уверенностью сказать, что от того, насколько отечественная фармацевтическая промышленность и медицина будет готова принять новые технологии в диагностике, в значительной степени будет зависеть разработка новых препаратов и качество лечения больных.
