CC BY
22
Орипнальы досл1дження
Original Researches
УДК 616.833.58-089.844-092.9 DOI: 10.22141/1608-1706.2.19.2018.130653
Гайович 1.В.1, Савосько С.1.2
1ДУ «1нститут травматологи та ортопедИ НАМН Укра!ни», м. Ки!в, Укра!на 2Нацональний медичний ун1верситет ¡мен1 О.О. Богомольця, м. Ки!в, Укра!на
В1ддалеш результати впливу кл1тинних технолопй на регенеращю адничного нерва при пластиц великого дефекту (експериментальне досл1дження)
Резюме. Актуальнсть. Автопластика при ушкодженн нерва не завжди призводить до задовльних результат. Особливо це важливо враховувати при великих ушкодженнях нервiв (бльше 10 см), коли за час проростання аксойв до м'юця дистального шва вдбуваеться фiброз зони дистального шва, що унеможливлюе подальшу регенера^ю нерва та призводить до незадовльних функцональних результат. Метою досыдження було дослдити вплив аспрату юсткового мозку та суспензИ жирово! тканини на регенера^ю нервiв за умови пластики великих дефект. Матерали та методи. Експерименти проведен на 25 отатевозр'1лихкролях. Тварини були розподлен на 5 експериментальнихгруп: 2 контрольн (у 1-й нерв залишався неушкодженим, у 2-й виконувалася лише автопластика дефекту), у 3-й груп застосовувалися автопластика нерва \ транспланта^я жирово! тканини, у 4-й — пластика нерва '¡з використанням суспензИ' юсткового мозку, у 5 — пластика нерва з комбнованим застосуванням клтинних суспензiй. Результати. Через 1 та 3 мсяц тварин виводили з експерименту та зразки досл^увалися пстолопчно та морфоме-трично. Морфометричний аналiз через 1 мсяць показав, що проростання аксонв через дистальний шов спостергалося лише в групах, в яких застосовувався аспрат юсткового мозку, через 3 мсяц в контрольна груп частка аксонв, що проросли, становила 49,7 %, в дослдних групах вона була значно вищою — до 64 % у груп, де застосовувалася комбiнацiя жирово! тканини й аспрату юсткового мозку. Бюхiмiчнi показники, таю як йТ-^афораза, рiвень дiенових кон'югат, ТБА-активних продуккт'в, через 3 мсяц були ближчими до норми в групах використання клтинно! технологи. Висновки. У результат досл^ень встановлено в'ропдний позитивний вплив застосування клтинних технолопй на регенера^ю нерва, як на морфолопчну структуру, так i на бюхiмiчнi процеси. Найкращi результати отриман в груп застосування комбiнацi! аспрату юсткового мозку та жирово! тканини.
Ключовi слова: регенера^я; ушкодження нерва; аспрат юсткового мозку; жирова тканина
Травма
Вступ
На сьогодш автопластика великих дефекпв нерва е стандартом хiрургiчного вщновлення застартих ушко-джень перифершного нерва. У лiтературi накопичилася велика кшьысть даних про ощнку рiзних способiв автопластики, ефектившсть вщновлення нерва та м'язiв кшщвки. Разом iз тим вдало проведена автопластика нерва не завжди дае бажаний результат, що спонукае дослщниив до пошуку рiзних стимулюючих засобiв. Насамперед сфера наукових пошуыв була спрямо-вана на використання тканинних факторiв росту, арсенал яких е досить широким i на сьогодш достатньо
дослщженим, а стимулюючий вплив щодо регенераци тканин — доведеним [5, 12]. Проте технолопчне отри-мання факторiв росту людини (human growth factor) та фармакоекономiчнi труднощi е перешкодою для !х широкого використання. Тому одним i3 напрямiв сти-муляци вщновлення нерва стала розробка автолопчних продукпв, що мютять стимулюкш бюлопчш фактори i сприяють процесам регенераци' (Pompilio). Використання автолопчних продукпв швидко розширило можливосп хiрурril в маншулюванш факторами росту i секреторними бтками з метою полшшення загоення исток, сухожилив i м'яких тканин. Клшчне застосу-
© «Травма» / «Травма» / «Trauma» («Travma»), 2018
© Видавець Заславський О.Ю. / Издатель Заславский А.Ю. / Publisher Zaslavsky O.Yu., 2018
Для кореспонденци: Гайович 1гор Володимирович, ДУ «1нститут травматологи та ортопедй НАМН УкраТни», вул. Бульварно-Кудрявська, 27, м. Кшв, 01601, Украна; e-mail: [email protected] For correspondence: Igor Gayovich, State Institution "Institute ofTraumatology and Orthopaedics of the NAMS of Ukraine', Bulvarno-Kudriavska st., 27, Kyiv, 01601, Ukraine; e-mail: [email protected]
вання тканинних суспензiй (тромбоцитарно! плазми, жирово! тканини) в таких галузях, як щелепно-лицьова хiрургiя, пластична хiрургiя i загальна хiрургiя, не да-ють можливiсть дослiдити механiзм та закономiрностi впливу автологiчних продуктiв на процеси регенераци, тому багато з цих продуклв були вивченi в межах фун-даментальних наукових робiт.
На сьогодш як такi автологiчнi продукти вiдносно широкого застосування набули автолопчна тромбоци-тарна плазма, суспензiя мезенхГмальних клiтин жирово! тканини i червоного тсткового мозку (Farouk). У експериментальних дослiдженнях показано стимулю-ючий вплив зазначених тканинних засобiв на процеси пролiферацií та диференшаци клiтин сухожилкiв. На думку авторiв, застосування автоплазми здiйснюe свiй вплив через вивГльнення тромбоцитами i жиро-вими клiтинами факторiв росту (IGF-1, bFGF, PDGF, TGF-ß та im). Комбiнацií вивiльнених факторiв росту e джерелом мiсцевоí' регуляцй' посттравматичного вгд-новлення. Крiм того, автологiчнi клггинш суспензй' не викликають iмуннi реакци, а !х використання в неви-сокш концентрацй' дозволяе активувати фiзiологiчний процес формування згортка та вивтьнення факторiв росту.
Використання пiдготованоí' суспензй' клгган червоного кiсткового мозку також сприяло регенераци ушко-джених тканин. Як зазначають автори, мезенхiмальнi стовбуровi клiтини кiсткового мозку е потенщалом для мультилiнiйноí' диференцiацií. Разом iз тим е данi про низьт показники виживання й онкогеншсть Гмплан-тованих мезенхiмальних стовбурiв клгтини тсткового мозку, що може пщрвати ефективнiсть клiтинноí' тера-пи. Використання додаткового мкросередовища, яким може бути автолопчна тромбоцитарна плазма, мож-ливо, дасть змогу подолати щ обмеження. З огляду на це метою даного дослгдження було пiдтвердити ефект автологiчноí' тромбоцитарноí' плазми, суспензй клгган червоного тсткового мозку та "х комбiнованого нане-сення на процеси регенераци травмованого сгдничного нерва та метаболiчноí' шдтримки денервованих м'язГв гомшки.
Матер1али та методи
Експерименти проведет на 25 статевозртих кро-лях вагою 3,2—3,5 кг. Тварини були розподтеш на 5 груп: 1-ша — контрольна група (без ушкодження сгдничного нерва); 2-га — дослгдна група (пластика сгдничного нерва); 3-тя — група, в якш використаш автопластика нерва i трансплантацiя жировоí' тканини (ЖТ); 4-та — пластика нерва Гз застосуванням суспензй червоного тсткового мозку (ЧКМ); 5-та — пластика нерва з комбшованим використанням клГтинних суспензш.
Премедикацш та знеболювання дослгдних тварин здшснювали шляхом введення тюпенталу натрш (ьр., 60 мг/кг). Експериментальш маншуляци проводили вГдповгдно до правил Regulations on the animal use of in research biomedical research, European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental
and other scientific purposes, Guide for the Care and Use of Laboratory Animals [16]. Тваринам наносили дефект нерва. Вишкали фрагмент шдничного нерва довжи-ною 1 см та здшснювали пластику видтеним сегментом нерва. У 3-й груш забiр 1 мл жирово! клггковини здшснювали з дтянки великого сальника через 1 см доступу до черевно! порожнини. Пiсля цього забрану жирову тканину подрiбнювали та гомогешзували шляхом 10-кратного пропускання через 1-мл канюлю. До жирово! тканини додавали 1 мл автологiчно! збагачено! тромбоцитами плазми, що отримували з 5 мл веноз-но! кровi шляхом центрифугування мозку з цитратом декстрози (1 : 8) 16 хв при 740 g, та здшснювали забiр 1 мл шару плазми, багато! тромбоцитами над еритро-цитарною масою, пiсля чого додавали 0,1 мл бичачого тромбшу для утворення суспензй' жирово! тканини та збагачено! тромбоцитами плазми.
У 4-й груш забiр 2 мл астрату тсткового мозку здшснювали голкою з троакаром iз проксимального вщ-дiлу стегна (дтянки великого вертлюга). Шсля цього астрат кiсткового мозку з цитратом декстрози (1 : 8) центрифугували 16 хв при 740 g та здшснювали забiр 1 мл шару плазми над еритроцитарною масою, додавали 0,1 мл бичачого тромбшу для утворення суспензй астрату тсткового мозку.
У 5-й груш отриману жирову тканину змшували не зi збагаченою тромбоцитами плазмою, а з астратом тсткового мозку та бичачим тромбшом для отриман-ня активно! суспензй (рис. 4). У дослщних групах зону пластики нерва вкривали клiтинними суспензiями, шсля чого виконувалося ушивання рани.
Одничний нерв та м'язи гомiлки фксували у 10% нейтральному формалiнi. Шсля фксац!! з нервiв на крiотомi виготовляли зрiзи товщиною 15—20 мкм та використовували метод iмпрегнацü азотнокислим срiблом. Фрагменти м'язiв зневоднювали у висхтних концентрацiях еталону i заливали в парафш. Парафь новi зрiзи забарвлювали методом гематоксилш-еози-ном. Морфометричний аналiз проводили за допомо-гою програмного забезпечення Carl Zeiss (AxioVision SE64 Rel.4.9.1, Нiмеччина) пiд мкроскопом Olympus BX 51 (Японiя).
Для оцшки метаболiчних змiн у денервованих м'язах були проведет бiохiмiчнi дослщження про- та анти-оксидантно! системи. Для цього визначали активнiсть ферментав антиоксидантно! системи глутатюнперокси-дази (GPx) (нмоль • хв-1 • мг-1), глутатiонредуктази (GR) (нмоль • хв-1 • мг-1), каталази (мкмоль • хв-1 • мг-1) та рiвень продуктiв пероксидаци вiльних низькомолеку-лярних SH-груп (нмоль/мг проте!ну), ТБК-реагуючих продуклв (мкмоль/г тканини), дieнових кон'югатiв (нмоль/мг проте!ну) i карбонiльних груп (нмоль/мг проте!ну).
Бiохiмiчнi показники визначали в супернатантах фрагмента нерва. Для цього фрагменти нерва гомоге-нiзували i центрифугували при 10 тис. g протягом 20 хв та дослщжували спектрофотометричним методом iз використанням спектрофотометра pQuant, Bio-Tek (США).
Рiвень загального бiлка визначали за методом Ьс^у [7]. Каталазну активнiсть — за методом ЛвЫ [1]. Кон-центрацiю ТБК-активних продуктiв визначали в го-могенатах фрагмента нерва за методом ЦеШуата [13]. Вмют дiенових кон'югатiв у фрагментi нерва вимiрю-вали за методикою, описаною в статп В.Г. Гаврилова. Визначення рiвня низькомолекулярних 8Н-груп здай-снювали за методом Е11тап [2]. Активнють ОРх вимь рювали за зменшенням рiвня NADPH у сполученiй глутатiонредуктазнiй реакци (GR), що визначали за методом Paglia [10]. Стутнь окисно! модифшаци про-те!шв оцiнювали за вмютом карбонiльних похiдних проте!шв колориметричним методом [14].
Активнють NAD(P)H-хiнон-оксидоредуктази (ДТ-дiафорази) визначали в реакцiйнiй сумiшi, що мютила NADPH-генеруючу глюкозо-6-фосфатдегiдрогеназну систему, менадюн (2-метил-1,4-нафтохiнон) та МТТ [3-(4,5-диметилтiазо-2-ил)-2,5-дифенiлтетразолiй бромщ]. NAD(P)H-хiнон-оксидоредуктаза каталiзуе NADPH-залежне вiдновлення менадюну в менадiол. Наступне утворення формазану в результат неензим-ного вщновлення МТТ пiд дiею менадiолу реестрували в дiапазонi довжини хвиль 550—640 нм [6].
Порiвняння отриманих результат здшснювали за допомогою U-критерiю Вткоксона — Манна —Уíтнi.
Результати та обговорення
Дослiдження травматично пошкодженого сщнич-ного нерва тварин починали з аналiзу яюсних та кль-кюних характеристик iнтактного нерва контрольно! групи. Гiстологiя iнтактного нерва подана щтьно ор-ганiзованими нервовими волокнами ^елшовими i безмiелiновими), системою кровоносних мкросудин i стромальними елементами нерва (рис. 1). Архггекто-нiка останнiх сформована ендо-, пери- й епiневрiем — системою колагенових волокон i фiброцитiв, функцю-нальна i просторова оргашзащя яких рiзко змiнюеться за умов травматичного ушкодження й iнтоксикацií. На структурному рiвнi нерв вкритий епiневрiем, в якому локалiзованi мiкросудини малого та великого дiаме-тра. Периневрш роздiляе нерв на фасцикули. Пооди-нокi нервовi волокна та !х групи оточенi ендоневрiем. В ендоневри локалiзоване мiкроциркуляторне русло,
гемокапiляри орiентованi вздовж вiсi нерва. Нервовi волокна сщничного нерва поданi головним чином мь елiновим типом, в яких перехвати Ранв'е рееструють-ся з рiзним iнтервалом, а муфти мiелiновоí' оболонки мають рiзну товщину (рис. 1 а, Ь). Кiлькiсна щть-нiсть нервових волокон в штактному нервi становила 9601,0 ± 285,5 од. мм2 (табл. 1).
Пстоструктура нерва в груш 2, тобто шсля автопластики, мала шшу архггектошку. Через 1 мiс. шсля травми зона автопластики характеризувалася вщнов-ленням анатомiчноí' будови нерва, чпко реестрували проксимальний i дистальний шви. На гютолопчному рiвнi фасцикули проксимального i дистального сег-ментiв зона автопластики суттево розрiзнялася. Ет-неврш нерва у тварин дослiдно! групи представлений товстою смугою щiльно! сполучно! тканини, особливо в дiлянцi етневрального шва.
Дiлянка дистального шва характеризувалася посттравматичною активащею нейролемоцитiв, шкапсу-ляцiею шва, реорганiзацiею сполучно! тканини нерва. Продукпв (дериватiв) розпаду нервових волокон не реестрували, що вказуе на !х повну елiмiнацiю з тканини нерва через 1 мю. пiсля автопластики. Коли в термши 1 мiс. ознак регенераци нервових волокон через дистальний шов не реестрували (рис. 1 с, ё), то в термь ни 3 мю. установлено проростання осьових цилiндрiв у дистальний вiдрiзок нерва в кiлькостi 4773,4 ± 229,6 нервових волокон/мм2 (Р < 0,05), тобто 49,7 % (р < 0,05) порiвняно з контрольним показником (табл. 2). При цьому вiдмiчено ознаки вторинно! дегенераци окремих нервових волокон. На основi отриманих даних мож-на припустити, що тривала регенерацiя травматично ушкодженого нерва може завершуватись дегенеращею нервових волокон при недосягненш iннервацiйно! мь шеш.
У групi 3, де використана автопластика iз застосу-ванням суспензи ЖТ, реестрували кращу посттравма-тичну регенерацш нерва. На макроскопiчному рiвнi чiтко розрiзнялись окремi зони нерва (проксимальний, дистальний сегменти i зона автопластики), але дiлянка нанесення жирово! тканини за обсягом сполучно! тканини ютотно вiдрiзнялась вщ дiлянки пiсля травматично! невроми дослщно! групи 2. Так, вiдмiче-
Таблиця 1. ЩльнСть нервових волокон у дистальному в'щр'/зку сдничного нерва через 1 та 3 мсяц шсля початку експерименту, нервов! волокна/мм3 (М х т)
Група 1 мю. 3 мю.
1-ша Контроль 9601,0 ± 285,5
2-га Травма 0 4773,4 ± 229,6*
3-тя ЖТ 0 6477,3 ± 329,5*, #
4-та ЧКМ 851,9 ± 54,3*, # 6166,3 ± 255,9*, #
5-та Комплекс 906,0 ± 54,4*, #, а 6680,1 ± 337,1*, #, а
Примтки: ЖТ — трансплантаця жировоI тканини; ЧКМ (астрат червоного ксткового мозку) — трансплантаця ^сткового мозку; * — Р < 0,05 порiвняно з контролем, # — Р < 0,05 порiвняно з травмою, " — Р < 0,05 порiвняно з ЖТ.
но збтьшення сполучно! тканини, утворення шжно! сполучно! тканини в епiневрií, проростання жирово! тканини мiж фасцикулами нерва. Дистальний сегмент нерва характеризувався збтьшенням товщини етнев-рiю, мiграцieю активованих фiбробластiв, стазованими мiкросудинами. Основний обсяг дослщжуваного сегмента представлений нейролемоцитами, проте регенерат! нервових волокон через 1 мю. не встановлено (рис. 1 е, 1). Через 3 мю. у дистальному вiдрiзку нерва число регенерованих нервових волокон становило 6477,3 ± 329,5 мм2, що на 35,6 % бтьше, нiж у групi 2 (Р < 0,05).
У груш 4, де застосована автопластика з ЧКМ ( ас-трат червоного кюткового мозку), встановлено реге-нерацiю нервових волокон у дистальний сегмент нерва через 1 мю. на рiвнi 851,9 ± 54,3 мм2 (8,8 % вт контролю, Р < 0,05). Деривапв дегенерованих осьових ци-лiндрiв i глiоцитiв не реестрували. Дистальний сегмент нерва характеризувався регенеращею поодиноких нервових волокон i зменшенням щiльностi дедиференщ-йованих нейролемоцитiв, що свiдчить про втновлення нейроглiальних взаeмодiй i зменшення рiвня гшально! компенсаци (рис. 1 g, И). Через 3 мiс. число регенерованих нервових волокон становило 6166,3 ± 255,9 мм2, що на 29,1 % бiльше, шж у групi 2 (Р < 0,05).
У груш 5, в якш комплексно застосовувалася сус-пензiя ЖТ i ЧКМ, також установлено проростання нервових волокон через дистальний шов. Рiвень реге-нераци в термш 1 мюяць становив 906,0 ± 54,4 од/мм2 (9,4 % вiд контрольного показника, р < 0,05), а через 3 мюяш — 6680,1 ± 337,1 од/мм2, тобто на 39,9 % бтьше щодо показника в групi порiвняння (р < 0,05). Нерво-вi волокна формували незначнi кластери, мiж якими локалiзованi елементи сполучно! тканини (рис. 1 ^ мали рiзний рiвень мieлiнiзацií, реестрували поодинот рекурентнi волокна. Цi результати свтчать про те, що застосування ЖТ i ЧКМ одночасно з пластикою великих дефекпв дозволяе своечасно створити сприятливе мкросередовище для регенераци ушкодженого нерва. Для вивчення метаболiчноí' характеристики цього мь крооточення було проведене бiохiмiчне дослiдження дистальних сегменпв нерва.
Таким чином, установлено вiрогiдну рiзницю в щiльностi проростання нервових волокон через шов у вшх групах, де застосовувалися клiтиннi технологи, по-рiвняно з контролем на рiвнi р < 0,05. Вiроriдноí' рiзни-цi за щiльнiстю волокон мiж групами, де застосовувалися рiзнi суспензи, не виявлено, проте в груш, в якш використовувалася сумiш жирово! тканини та асшрату кiсткового мозку, вона була найвищою, а морфоло-гiчно структура параневрального оточення найбiльше вiдповiдала здоровiй тканиш з вiдтворенням тканини ковзання.
Результати оцшки бiохiмiчних показникiв стнично-го нерва через 1 мюяць тсля травми та пластики нерва в груш 2 засвтчили компенсаторну вiдповiдь фермен-тативно! системи антиоксидантного захисту у втпо-вiдь на утворення продукпв пероксидаци. Так, через 1 мюяць тсля пошкодження рiвень ТБК-активних про-
дукпв збтьшився щодо контролю в 2,7 раза (р < 0,05), дieнових кон'югапв — у 3,3 раза (р < 0,05), карбонть-них груп — у 2,7 раза (р < 0,05). Уш зазначет сполуки утворюються в результат дГ! активних форм кисню, пероксидаци лiпiдних та бiлкових молекул. Тобто тсля травми втбуваеться гшерпродуктя вiльних радикалiв, що на клггинному рiвнi створюють агресивне мкро-оточення в дистальному сегменп нерва. Через 3 мюяш шсля автопластики встановлено суттеве зменшення рiвня зазначених метаболтв, проте жоден показник не досягав контрольних показникiв.
Одночасно з цим встановлено зменшення втьних SH-вмiсних сполук: у середньому в 3,7 i 2,4 раза вт-повiдно до термшу спостереження (р < 0,05) (рис. 2). Активнють ферментiв антиоксидантно! системи змь нювалась залежно вт ферменту. Вiдмiченi незначне зменшення активносп GPx i GR через 1 мюяць i рiз-ке збтьшення через 3 мюяш — майже в 3,4 i 4,8 раза (р < 0,05). Активнють каталази збтьшилась у 2 рази (р < 0,05), але в наступний термш не вiдрiзнялась вiд контрою. Активнють ДТ^афорази рiзко зменшилась, хоча вiдмiчено часткове вiдновлення показника (у 4,4 i 1,9 раза щодо термшу спостереження, р < 0,05).
У загальнш динамщ метаболiчних змш можна стверджувати про компенсаторну активацш каталази в гострий перiод тсля травми i порушення в системi функцiонування ДТ-дiафорази i GR. У вщдаленому перiодi травми нерва встановлено компенсаторну активацш GPx i GR i часткове вiдновлення системи де-токсикаци, в якiй задiяна ДТ-дiафораза. Установленi метаболiчнi змiни можуть пояснити причини розвитку вторинно! дегенераци в регенеруючих нервових волокнах у дистальному сегменп нерва. Аналiз змш метабо-лiчних показник^в на тлi застосування суспензГ! мезен-хiмальних клiтин ЖТ i ЧКМ засвтчив позитивнi змiни вiдносно процесiв пероксидаци в ушкодженому нервi.
У групах тварин, яким проводили ТЖТ i ТКМ, сут-тево! рiзницi з групою порiвняння на 3-й мюяць спостереження не виявлено. Рiзницю встановлено лише за деякими показниками.
У груш з ЖТ (група 3) зменшився рiвень ТБК-реагуючих продукпв, дieнових кон'югатiв i карбонть-них груп у 1-й мюяць (р < 0,05). Активнють каталази була меншою щодо групи 2 у вш термши спостереження, GPх, GR — лише у втдалений перiод (р < 0,05). Показник DТ-дiафорази не змшився.
У групi з ЧКМ (група 4) рiвень ТБК-реагуючих про-дукпв i дieнових кон'югатiв зменшився в 1-й мюяць (р < 0,05), а на 3-й не вiдрiзнявся вт групи 2. Показник GR i каталази зменшився щодо групи 2 через 3 мiся-Ш пiсля автопластики (р < 0,05). Активнють DТ-дiа-форази суттево збтьшилась у гострому перiодi травми щодо групи 2 у 3,2 раза (р < 0,05). Незважаючи на втносну варiабельнiсть одержаних даних, загальним висновком е те, що у втдалений перюд продовжуеть-ся розвиток компенсаторних захисних механiзмiв у пошкодженому нерв^ i цей рiвень мае тенденцiю до зменшення порiвняно з групою без застосування авто-логiчних кпiтинних суспензiй.
Рисунок 1. Дистальний в'щр'зок сдничного нерва через 1 i 3 мс. псля пластики нерва. Одночасна регенерац!я та вторинна дегенерац!я нервових волокон у rpyni 3 на 3-й м!сяць тсля автопластики Примаки: a, b — контрольна група; c, d — група травми з автопластикою (1 i 3 м!сяц1); e, f — група травми з автопластикою та ЖТ (1 i 3 м!сяц1); g, h — група травми з автопластикою та ЧКМ (1 i 3 м!сяц1); i, j — група травми з автопластикою, ЖТ та ЧКМ (1 i 3 м!сяц!). 1мпрегнац1я азотнокислим срблом (об. 40, ок. 10). ^
При комбiнованому застосуваннi ЖТ iз ЧКМ (група 5) у сщничному нервi встановленi збтьшення активнос-т GPx i GR i одночасне зниження активност каталази. При цьому продукти пероксидацй залишалися на висо-кому рiвнi, i навiть !х рiвень зростав за деякими показни-ками у вщдалений перiод, зокрема концентращя ТБК-реагуючих продуктiв була збтьшеною в 1,4 раза (р < 0,05). При цьому рiвень 8Н-вмюних сполук збтьшувався в 1-й мюяць, але через 3 мiсяцi не вiдрiзнявся вiд групи 2.
Таким чином, дослщження метаболiчних показниив травматично ушкодженого нерва через 3 мюящ пiсля пластики та застосування ТЖТ i ТКМ як засобiв стиму-лювання до регенерацй засв!дчили часткову нормал!за-цiю реакцiй окисно-втносно! рiвноваги та компенсатор-ну активацiю окремих ланок антиоксидантного захисту, що пояснюе збтьшення р!вня регенерацй нерва тсля застосування автологiчних кттинних суспензш.
Результати експериментальних дослiджень дозволили встановити особливост регенерацй сщничного нерва через дефект шляхом використання методу авто-
пластики. Установлено, що регенеращя в дистальний сегмент нерва вiдбуваеться через 1 мюяць тсля пластики, а в цей термш вiдмiчаються гютоструктурш та метаболiчнi змши. Через 3 мюящ тсля автопластики встановлено регенеращю лише на р!вш 49,7 %.
Нанесення в мют автопластики суспензи мезенхь мальних клгган ЖТ i ЧКМ, що приготованi з автоплазмою, збагаченою тромбоцитами, позитивно вплинуло на регенерацiю периферiйного нерва шсля травми. При цьому вплив дослщжуваних суспензiй мав деякi вщмшность
Суспенз!я клгган ЖТ вплинула на активацш про-ростання нервових волокон кр!зь сегмент автопластики травмованого нерва, при цьому вiдмiченi дтянки з адипоцитами в етневри та збтьшення щтьносл ней-ролемоцитiв у дтянт шва. На думку авторiв, жирова тканина мютить велику кльюсть стромальних стовбу-рових клгган (/ик Р.А, 2001), як! безпосередньо пене-трують тканину травмованого сщничного нерва, акти-вують анпогенез, метабол!чний потенщал ендотелш
мiкросудин, нейролемоцитiв, що впливае на регене-рацiю нервових волокон. Цим можна пояснити збть-шення рiвня регенераци нервових волокон до 67,4 %. Клггини ЖТ сприяли регенераци нерва та запобиали розвитку вторинно'1 дегенераци у вiддалений перiод.
Суспензiя клггин ЧКМ суттево в гострому перiодi активувала регенерацiю осьових цилiндрiв i нейроле-
моцитiв, що пiдтверджуеться проростанням пооди-ноких нервових волокон через дистальний шов, про-те у вщдалений перiод регенерацiя характеризувалася розвитком вторинно'1 дегенераци, хоча загальна кшь-кiсть волокон також була в межах 64,2 %. Активацш пришвидшення регенераци нервових волокон через дтянку автопластики можна пояснити видiленням
ТБК-активш продукти
ш
*" ** П| п! И п!
□ 1 мюяць ■ 3 МЮЯЩ Карбоншьш групи
ш
4-°
□ 1 мюяць ■ 3 МГСЯЦ|
Глутатюнпероксидаза
ПИ [-1
— * *#
и * п
Л
#
¿Г
✓ # # #
□ 1 мюяць ■ 3 МЮЯЦ|
ш.
Д1снов1 кон'югати
* »• * «* * **
/ У #
□ 1 мюяць ■ 3 МЮЯЩ Вшьш БН-групи
4>
20 15 10 5 0
Л
«г ^
□ 1 МЮЯЦЬ ■ 3 МЮЯф
Глутатюнредукгаза
15 10 5 0
пи
я
П
П
□ 1 мюяць ■ 3 МЮЯЦ
35 30 25 20 15 10 5 0
Катапаза
ш
* *#
мо
л<Г
г
□ 1 мюяць ■ 3 МЮЯЩ
дТ-д1афораза
Л
*
Л
А
□ 1 МЮЯЦЬ ■ 3 МЮЯЩ
Рисунок 2. Змни б'юх'/м'чних показниюв у дистальному сегмент сщничного нерва
пСля травми та автопластики Прим'/тка: ЖТ — трансплантаця жирово/ тканини; ЧКМ — трансплантаця юсткового мозку; * — в!рог!дно до контролю (р < 0,05); # — в!рог!дно до травми (р < 0,05).
мезенхiмальними клiтинами та тромбоцитами плаз-ми факторiв росту (МоИашшаШ, Farouk), а причиною дегенеративних змш може бути агресивне мкроото-чення в дистальному сегментi нерва, що виникае на тлi травми нерва i розвитку окислювального стресу. Для пiдтвердження або спростування ще! думки був проведений порiвняльний аналiз про- й антиоксидантного профтю ушкодженого нерва тсля автопластики.
Як вiдомо, розвиток окислювального стресу i наступ-не перекисне окислення структурних компонентiв кль тин (лшщв плазматичних мембран, бiлкiв та нуклео-протещв) е одним iз основних патогенетичних шляхiв пошкодження тканин i органiв при травматичному й iшемiчному ураженнi. Пiдвищення iнтенсивностi про-цесiв перекисного окислення лiпiдiв (ПОЛ) е також мехашзмом розвитку рiзних сигнальних метаболiчних ланок. Темпи перебку вiльнорадикальних процесiв та !х регулящя перебувають пiд контролем багатокомпо-нентно! системи антиоксидантного захисту. Основним проявом окислювального стресу та параметром оцшки рiвня патобiохiмiчних змiн е накопичення первинних i вторинних продуктiв вiльнорадикального окислення. Найбiльш iнформативними показниками рiвня окислювального стресу е утворення дieнових кон'югатiв iз окислених лшщв, а також малонового дiальдегiду. Ма-лоновий дiальдегiд виникае в тканинах при деградаци полiненасичених жирiв на тлi ушкодження активними формами кисню, служить маркером ПОЛ й окислювального стресу та визначаеться не лише в тканинах, а й в плазмi кров^ тобто е показником системних роз-ладiв.
Одночасно з цим втбуваеться окислювальна моди-фiкацiя бiлкiв. Вiльнi радикали ушкоджують бiлки по всiй довжинi полшептидного ланцюга, порушуючи первинну, вторинну i третинну структуру бiлкiв, що призводить до агрегаци або фрагментаци бтково! мо-лекули, тобто втрати и функцiонального призначен-ня. Це мае втношення не лише до структурних бтыв мембран та цитоплазми, а й до бтыв позакитинного матриксу, факторiв росту, бiлкiв мiкросудин. Особливо легко окислюються бiлки, що мютять у своему по-лшептидному ланцюзi амiнокислоти з SH-групами. Особливо це важливо для оцiнки стану глутатюново! системи, оскiльки глутатiон створюе основний пул ще! системи.
Характерним маркером пошкодження бтыв за умов окислювального стресу е утворення карбонтьних груп при окисленш амiнокислот: лiзину, арпншу i проль ну. Карбоксильнi групи бiлкiв пiд дieю активних форм кисню перетворюються в карбонтьш групи, яы, зi сво-го боку, можуть взаeмодiяти з амiногрупами, що в результат призводять до утворення поперечних зшивок мiж бтковими молекулами i порушення !х активность
У проведених експериментальних дослiдженнях було встановлено, що через 1 мюяць тсля ушкодження стничного нерва та його автопластики втбува-ються розвиток ПОЛ та деградацiя бтыв у дистальному сегмент нерва, що е результатом травматичного, iшемiчного та метаболiчного ушкодження. Основни-
ми показниками цих розладiв е: 1) утворення ТБК-активних продуктiв (продукта ПОЛ, що взаемодiють i3 тюбарбпуровою кислотою), основним компонентом яких е малоновий дiальдегiд; 2) утворення дiенових кон'югатiв; 3) поява карбонiльних груп в ушкоджених проте!нах; 4) ушкодження та зменшення рiвня метабо-лiчно активних вiльних низькомолекулярних SH-груп, основним компонентом яких е глутатюн. Глутатюн е низькомолекулярним антиоксидантом i може брати участь у неферментативному антиоксидантному захис-та, виступаючи ефективним акцептором втьних ради-калiв (активнi форми кисню). Зниження рiвня глутать ону викликае зростання рiвня активних форм кисню, тддае клiтку ризику окисного пошкодження. Разом iз тим надлишкова продукцiя глутатiону е iндикатором розвитку окислювального стресу, що згодом призводить до клгтанно! загибель
Синтез глутатюну de novo та його втновлення реаль зуються АТФ-залежним шляхом, тобто порушення мь тохондрiально! функци корелюе iз зниженням втнов-леного глутатюну. З урахуванням цього важливим було оцiнити рiвень метаболiчних розладiв мiтохондрiй. Одним iз таких показниыв е активнiсть DТ-дiафорази (NAD(P)H-хiноноксидоредуктази; КФ 1.6.99.2) — ферменту, синтез якого активуеться при оксидатив-ному стреш та який бере участь принаймш в трьох системах бiохiмiчних реакцш: 1) вiдновленнi хiнонiв, 2) шдтриманш ендогенних антиоксидантiв у вiдновле-нш активнiй формi, 3) регуляц11 стабтьносп пухлинно-го супресора — протешу р53. Крiм того, DT-дiафораза координовано стимулюеться з iншими ензимами де-токсикац11, такими як глутатiон-S-трансфераза [9].
Рiвень пулу вiльних SH-вмiсних молекул, основу якого становить глутатюн, у гострому перюду зростав лише в групах, де була використана суспензiя клгтан ЖТ (група 3 i 5), але в 3-мiсячний термш не вiдрiзнявся вiд групи порiвняння, що вказуе на виснаження пулу цих антиоксидантних молекул.
Рiвень продукпв пероксидац11 також зменшувався в гострому перiодi i надалi зростав. Таку динамку встановлено щодо карбонтьних груп i дiенових кон'югатiв при застосуванш суспенз11 клiтин як ЖТ, так i ЧКМ, а рiвень ТБК-активних продуктiв у групах 4 i 5 навiть зростав. Тобто у втдалений перiод пiсля застосування суспенз11 ЧКМ може виникати агресивне метаболiч-не мiкрооточення, що пояснюе причину вторинно'1 дегенерац11 нервових волокон у дистальному сегменп нерва.
Серед функцш, якi виконуе глутатiон, насамперед слт вiдзначити його участь у захисп клiтин вiд продук-тiв окислювального стресу. Так, глутатюнпероксидаза (GPx; номенклатура ферменпв: EC 1.11.1.9) за участю глутатiону вiдновлюе перекис водню до води, втнов-люе органiчнi продукта гтропероксидаци до вiдповiд-них спирпв.
Активацiя глутатiонзалежноl антиоксидантно! фер-ментно! системи нейтралiзуе реакцГ! ПОЛ i пiдтримуе у вiдновленому станi SH-групи протеlнiв, забезпечуючи цим !х функцюнальну активнiсть. GPx — один з основ-
них ферментiв ще1 системи, що кататзуе вiдновлення пероксиду водню й шших органiчних гiдропероксидiв до води i спиртiв з одночасним окисленням вщновле-ного глутатiону.
Рiзке збiльшення активност цих ферментiв у вщда-леному перiодi пiсля автопластики в групах 2—5 можна пояснити компенсаторними реакщями, що спрямова-нi на вщновлення антиоксидантно! системи. При цьо-му найбтьше пiдвищення показниив було встановле-но при комбiнованому застосуваннi суспензи клiтин ЖТ i ЧКМ.
Актившсть каталази через 1 мiсяць тсля травми залишалась пiдвищеною, але через 3 мюящ зменшу-валась, а в групах 4 i 5 навпъ була меншою за конт-рольнi значення. На противагу цьому актившсть ДТ-дiафорази спершу зростала, але в наступний перiод не вiдрiзнялась вiд групи 2.
Висновки
На вiдновнi процеси в травмованому нервi впливае не лише техшка пластики нерва, але й периневральне мiкрооточення, що формуеться на xni травми. Значну роль у системi антиоксидантного захисту вiдiграють механiзми синтезу та вщновлення глутатiону, осюль-ки вони безпосередньо утишзують АФК та продукта пероксидаци, а також опосередковано сприяють клiтиннiй репараци. Характерним для виникнення агресивного мiкрооточення в нервi е зниження рiвня ферментативних та неферментативних систем деток-сикаци, при цьому застосування автолопчно1 суспензи клгтн ЖТ забезпечуе нейтралiзацiю реакцiй ПОЛ, пригнiчуе утворення продукпв пероксидаци, позитивно впливае на рiвень антиоксидантно1 системи та сприяе регенераци нерва. На противагу цьому застосування суспензи клгтн ЧКМ забезпечило вiдносно короткотривалу дiю, осильки в подальшому регене-рацiя характеризувалася одночасною дегенерацiею нервових волокон. У результат дослщжень встанов-лено вiрогiдний позитивний вплив застосування кль тинних технологш на регенерацiю нерва, як на морфо-логiчну структуру, так i на бiохiмiчнi процеси. Таким чином, отримаш експериментальнi данi можуть бути пiдГрунтям для використання автолопчних мезенхь мальних клiтин жирово1 тканини для стимулювання вщновних процесiв у травматично пошкодженому пе-риферiйному нервг
Конфлiкт iffrepeciB. Автори заявляють про вщсут-нiсть конфлiкту iнтересiв при пиготовщ дано1 стагтi.
Список л1тератури
1. Aebi H. Catalase in vitro / H. Aebi // Meth. Enzymol. — 1984. — Vol. 105. — P. 121-126.
2. Ellman G. Tissue sulfhydryl groups / G. Ellman // Arch. Biochem. Biophys. — 1959. — Vol. 82, № 1. — P. 70-77.
3. Farouk A. Angiogenesis induced by autologous whole bone marrow stem cells seeded on collagen scaffolds in silicone nerve tubes. An experimental study / A. Farouk Abd El Azeem, Hatem Mostafa Hussin Al-Ahmady, Mustafa Ahmad Abdul Rahman
[et al.]// Tanta Dental. Journal. — 2014. — Vol. 11, Is. 3. — P. 227-234.
4. Gavrilov V.B. Izmerenie dienovyih kon'yugatov vplazme krovi po UF-pogloscheniyu geptanovyih i izopropanolnyih ekstraktov/ V.B. Gavrilov, A.R. Gavrilova, N.F. Hmara//Labor. delo. — 1988. — № 2. — P. 60-63.
5. Gordon T. The basis for diminished functional recovery after delayed peripheral nerve repair / T. Gordon, N. Tyreman, M.A. Raji // J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. — 2011. — Vol. 31. — P. 5325-5334.
6. Lind C., Cadenas E., Hochstein P., Ernster L. DT-di-aphorase: purification, properties, and function // Methods in Enzymology. — 1990. — № 186. — P. 287-301.
7. Lowry O.H. Protein measurement with Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.I. Randal// J. Biol. Chem. — 1951. — Vol. 193, № 1. — P. 265-275.
8. Mohammadi R. The use of undifferentiated bone marrow stromal cells for sciatic nerve regeneration in rats / R. Moham-madi, S. Azizi, N. Delirezh [et al.] // Int. J. Oral Maxillofac. Surg. — 2012. — Vol. 41(5). — P. 650-656.
9. Nioi P. Contribution of NAD(P)H: quinone oxidoreduc-tase 1 to protection against carcinogenesis, and regulation of its gene by the Nrf2 basic-region leucine zipper and the arylhydro-carbon receptor basic helix-loop-helix transcription factors / P. Nioi, J.D. Hayes // Mutat. Res. — 2004. — Vol. 555(1-2). — P. 149-171.
10. Paglia D.E. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase / D.E. Paglia, W.N. Valentine // J. Clin. Med. — 1967. — Vol. 70. — P. 158-169.
11. Pompilio G. Autologous peripheral blood stem cell transplantation for myocardial regeneration: a novel strategy for cell collection and surgical injection / G. Pompilio, A. Can-nata, F. Peccatori [et al.] // Ann. Thorac. Surg. — 2004. — Vol. 78(5). — P. 1808-1812.
12. Ratajczak M.Z. Very small embryonic-like stem cells: characterization, developmental origin, and biological significance / M.Z. Ratajczak, E.K. Zuba-Surma, M. Wysoc-zynski [et al.] // Exp. Hematol. — 2008. — Vol. 36(6). — P. 742-751.
13. Uchiyama M. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test / M. Uchiyama, M. Mihara // Anal. Biochem. — 1978. — Vol. 86(1). — P. 271-278.
14. Zaytseva O.V. Modification of spectrophotometric method of determination of protein carbonyl groups / O.V. Zaytseva, S.G. Shandrenko // Ukr. Biokhim. Zhurn. — 2012. — Vol. 84(5). — P. 112-116.
15. Zuk P.A. Multiline age cells from human adipose tissue: implication for cell-based therapies / P.A. Zuk, M. Zhu, H. Mizuno [et al.] // Tissue Engineering. — 2001. — Vol. 7(2). — P. 211-228.
16. GUIDE LABORATORY ANIMALS FOR THECARE AND USE OF Eighth Edition/ Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals Institute for Laboratory Animal Research Division on Earth and Life Studies. — The National academies press, NW Washington, DC, 2011.
OmpuMaHO 12.02.2018 ■
Гайович И.В.1, Савосько С.И.2
1ГУ «Институт травматологии и ортопедии НАМН Украины», г. Киев, Украина 2Национальный медицинский университет имени А.А. Богомольца, г. Киев, Украина
Отдаленные результаты влияния клеточных технологий на регенерацию седалищного нерва при пластике большого дефекта (экспериментальное исследование)
Резюме. Актуальность. Аутопластика при повреждении нерва не всегда приводит к удовлетворительным результатам. Особенно это важно учитывать при больших повреждениях нервов (более 10 см), когда за время прорастания аксонов к месту дистального шва происходит фиброз зоны дистально-го шва, что делает невозможным дальнейшую регенерацию нерва и приводит к неудовлетворительным функциональным результатам. Целью исследования было изучить влияние аспирата костного мозга и суспензии жировой ткани на регенерацию нервов при пластике больших дефектов. Материалы и методы. Эксперименты проведены на 25 половозрелых кроликах. Животные были разделены на 5 экспериментальных групп: 2 контрольные (в 1-й нерв оставался невредимым, во 2-й выполнялась только аутопластика дефекта), в 3-й группе применялись аутопластика нерва и трансплантация жировой ткани, в 4-й — пластика нерва с использованием суспензии костного мозга, в 5-й — пластика нерва с комбинированным применением клеточных суспензий. Результаты. Через 1 и 3 месяца животных выводили из эксперимента и
образцы исследовались гистологически и морфометрически. Морфометрический анализ через 1 месяц показал, что прорастание аксонов через дистальный шов наблюдалось только в группах, в которых применялся аспират костного мозга, через 3 месяца в контрольной группе доля проросших аксонов составляла 49,7 %, в группах исследования она была значительно выше — до 64 % в группе, где применялась комбинация жировой ткани и аспирата костного мозга. Биохимические показатели, такие как DT-диафораза, уровень диеновых конъюгатов, ТБА-активных продуктов, через 3 месяца были ближе к норме в группах использования клеточной технологии. Выводы. В результате исследований установлено вероятное положительное влияние применения клеточных технологий на регенерацию нерва, как на морфологическую структуру, так и на биохимические процессы. Наилучшие результаты получены в группе применения комбинации аспирата костного мозга и жировой ткани.
Ключевые слова: регенерация; повреждение нерва; аспират костного мозга; жировая ткань
I.V. Gayovich1, S.I. Savosko2
1State Institution "Institute of Traumatology and Orthopaedics of the NAMS of Ukraine", Kyiv, Ukraine 2Bogomolets National Medical University, Kyiv, Ukraine
Long-term effects of cell technologies on sciatic nerve regeneration in plasty of large defect
(experimental study)
Abstract. Background. Autoplasty after nerve injury does not always lead to satisfactory results. This is especially important for large damage to the nerves (more than 10 cm) when during time of regeneration to the site of the distal suture, there is a fibrosis of the distal area which makes impossible further nerve regeneration and as a result leads to poor functional outcome. The purpose of the study was to investigate the effect of bone marrow aspirate and fatty tissue suspension on regeneration of nerves subjected to the plasty of large defects. Materials and methods. Experiments were conducted on 25 sexually mature rabbits. There were 5 experimental groups (2 controls: in the first one, nerve remained intact, in the second one, only autoplasty of the defect was carried out). In the third group, autoplasty of the nerve and transplantation of adipose tissue were performed; in group 4 — nerve plasty with application of bone marrow suspension; in group 5 — nerve plasty with combined application of cell suspensions. Results. After 1 and 3 months, the animals were sacrificed, and the specimens
were examined histologically and morphometrically. Morphomet-ric analysis 1 month after showed that axon sprouting through a distal suture was observed only in groups in which bone marrow aspirate was used. After 3 months in the control group, the number of sprouted axons was 49.7 %, and in the experimental groups it was significantly higher — up to 64 % in the group which used a combination of adipose tissue and bone marrow aspirate. Biochemical indices such as DT-diaphorase, level of diene conjugates, TBA-reactive substances in 3 months were closer to the norm in groups where cellular technologies were used. Conclusions. As a result of the research, a significant positive effect of cell technologies on nerve regeneration was established, both on the morphological structure and biochemical processes. The best results were obtained in the group where the combination of bone marrow and adipose tissue was used.
Keywords: regeneration; nerve damage; bone marrow aspirate; fatty tissue
