CC BY
23УДК 577.12:616.833-001-003.93-091.8 DOI http://dx.doi.org/10.5281/zenodo.1240753
I. В. Гайович, В. В. Гайович, О. М. Макаренко, С. I. Савосько
НЕЙРОМЕТАБОЛ1ЧН1 ЗМ1НИ ПЕРИФЕР1ЙНОГО НЕРВА ТА М'ЯЗ1В ПРИ IX ТРАВМАТИЧНОМУ УШКОДЖЕНН1 ТА ВПЛИВ АУТОЛОГ1ЧНО1 ЖИРОВО1 ТКАНИНИ ТА К1СТКОВОГО МОЗКУ НА РЕПАРАТИВНО-В1ДНОВН1 ПРОЦЕСИ
ПРИ ПЛАСТИЦ1 НЕРВА
ДУ «1нститут травматологи та ортопеди НАМН Укра1ни», Ки1в, Украша;
Нацiональний медичний унiверситет iMeHi О.О. Богомольця, Ки1в, Украша
Summary. Gayovich I. V., Gayovich V. V., Makarenko A. N., Savosko S. I. NEUROMETABOLIC CHANGES OF PERIPHERAL NERVE AND MUSCLE AFTER TRAUMATIC INJURY ANDEFFECT OF AUTOLOGOUS ADIPOSE TISSUE AND BONE MARROW ON REGENERATIVE PROCESSES AFTER NERVE PLASTIC. - Clinic of microsurgery and reconstructive surgery of the hand, Institute of Traumatology and Orthopedics NAMS of Ukraine, Kyiv, Ukraine; Department of histology and embryology, Bogomolets National Medical University, Kyiv, Ukraine.- e-mail: gajjgor@gmail.com. Effectiveness of surgical recovery of peripheral nerve and muscle and biochemical disorders in denervated muscle after application of autologous suspension of adipose tissue and bone marrow has been analyzed in the article presented. The cell suspension was applied around the sciatic nerve graft, which created a favorable microenvironment for reparative processes. The criteria for evaluation of therapeutic intervention were: the level of sciatic nerve regeneration, the level of oxidative stress and antioxidant enzyme system. The results showed progressive oxidative stress in nerves and muscles after injury, disturbances of redox balance and cytoprotective enzyme systems. The use of cell suspensions suppressed metabolic disruption in muscle; activate compensatory mechanisms of cytoprotection and concomitant repair of tissues.
Key words: nerve graft, sciatic nerve, bone marrow suspension, adipose tissue suspension, metabolism.
Реферат. Гайович И. В, Гайович В. В., Макаренко А. Н., Савосько С. И. НЕЙРОМЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО НЕРВА И МЫШЦ ПРИ ИХ ТРАВМАТИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИ И ВЛИЯНИЕ АУТОЛОГИЧНОЙ ЖИРОВОЙ ТКАНИ И КОСТНОГО МОЗГА НА РЕПАРАТИВНО - ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ ПРИ ПЛАСТИКЕ НЕРВА. В статье проанализирована зависимость уровня хирургического восстановления периферического нерва и биохимических нарушений денервированных мышц при применении аутологичной суспензии жировой ткани и костного мозга. Клеточные суспензии наносили вокруг сегмента аутопластики седалищного нерва, что создавало благоприятную микросреду для репаративных процессов. Критериями оценки терапевтического воздействия были уровень регенерации седалищного нерва, уровень оксидативного стресса и показатели ферментов антиоксидантной системы. Результаты исследований подтвердили развитие окислительного стресса в нерве и мышцах после травмы, нарушения окислительно-восстановительного равновесия, ферментативной системы цитопротекции. Применение клеточных суспензий угнетало метаболические нарушения мышц на этапе реиннервации, активировало компенсаторные механизмы цитопротекции и сопутствующую репарацию тканей.
Ключевые слова: аутопластика, седалищный нерв, суспензия костного мозга, суспензия адипоцитов, метаболизм.
© Гайович I. В., Гайович В. В., Макаренко О. М., Савосько С. I.
Реферат. Гайович I. В., Гайович В. В., Макаренко О. М., Савосько С. I. НЕЙРОМЕТАБОЛ1ЧН1 ЗМ1НИ ПЕРИФЕР1ЙНОГО НЕРВА ТА М'ЯЗ1В ПРИ IX ТРАВМАТИЧНОМУ УШКОДЖЕНН1 ТА ВПЛИВ АУТОЛОГ1ЧНО1 ЖИРОВО1 ТКАНИНИ ТА К1СТКОВОГО МОЗКУ НА РЕПАРАТИВНО-В1ДНОВН1 ПРОЦЕСИ ПРИ ПЛАСТИЦ1 НЕРВА. Дослвджувалася залежшсть якосп вщновлення нерва при аутопластищ та вплив жирово! тканини i к1сткового мозку, що наносили навколо зони пластики на регенерацш нерва та денервацшш процеси мязiв. Застосування клiтинних суспензш пригнiчувало метаболiчнi порушення м'язiв на еташ решнервацп, вповiльнюючи дегенеративнi процеси при денервацп мязу та забезпечували пришвидшення та покращення якостi регенерацп нерва.
Ключовi слова: аутопластика, адничий нерв, суспензiя к1сткового мозку, суспензiя адипоцитов, метаболiзм.
Вступ. Проблема ввдновлення великих дефектiв нервiв та функцп м'язiв кiнцiвки залишаеться не виршеною [1]. Нажаль вдале хiрургiчне вщновлення ушкоджених нервiв, особливо при застарших ушкодженнях та великих дефектах нерва, не завжди дае бажаний результат i потребуеу досконалення терапевтичних та реабштацшних заходiв [2, 13]. Тривалий перiод ввдновленпя нерва призводить до втрати м'язами скоротливо! здатностi, таким чином навиъ пiсля проростання нерва, скоротлива функцiя м'язiв не вщновлюеться. Разом з тим, увага спещалюпв зосереджена лише на способах мрурпчного вiдновлення нерва та симптоматичнiй медикаментознш терапй, а метаболiчному пiдгрунтю ввдновних процесiв присвяченi лише поодинок1 фундаментальш науковi дослвдження [4]. З метою цитотрофiчноl стимуляци репаративних процесiв запропоноваш рiзнi аутологiчнi тканиннi матерiали та суспензи клiтин - плазми збагачено! тромбоцитами, суспензи жирово! тканини i к1сткового мозку [3, 14]. Перевагою таких технологш е зручнiсть !х використання на мрурпчному етапi, вщсутшсть iмунно! агресп на клiтинний матерiал i цитотрофiчний вплив на тканини оргашзму. Мета дослiдження: вивчити дисметаболiчнi розладi нерва та м'язiв при травматичному ушкодженш i ввдновних процесах при застосуваннi аутологiчних клiтинних суспензш адипоцитов та шсткового мозку; дослщити вплив сучасних методик клтгинно! терапй' на регенерацш нерва та денервацшш процеси в м'язах; покращити результата л^вання пащенпв з важкими ураженнями нервiв.
Матерiали та методи
Методолог1я експерименту
Експерименти проведеш на 25 кролях, вагою 3,2 - 3,5 кг. Тварини були роздшеш на 5 груп: 1) контрольна група (без ушкодження сiдничого нерва); 2) дослвдна група (пластика свдничого нерва); 3) аутопластика нерва i трансплантащя жирово! тканини; 4) пластика нерва з застосуванням суспензи к1сткового мозку; 5) пластика нерва з комбшованим застосуванням клггинних суспензiй. Тваринам наносили дефект адничого нерва довжиною 1 см, здшснювали пластику видiленим сегментом нерва. Приготовану суспензiю к1сткового мозку наносили навколо сегмента пластики адничого нерва. Премедикацш та знеболення дослщних тварин здiйснювали шляхом введения тюпенталу натрiю (i. р., 60 мг/кг). Експериментальнi маиiпуляцi! проводили вiдповiдно до правил "Regulations on the Animals' Use in Biomedical Research", "European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes", "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals".
Пстолог1чне дослгдження
Через 1 мюяць шсля проведено! операци тварин повторного наркотизували та здшснювали видалення i шдготовку окремих сегменпв травмованого адничого нерва для пстолопчного дослщження. Фрагмента нерва помщали в 10% нейтральний формалiн, шсля чого iз фiксоваиих дiлянок на крiотомi виготовляли гiстологiчнi зрiзи товщиною 15-20 мкм. 1з гiстологiчних методик фарбування були використанi iмпрегнацiя азотнокислим срiблом. Морфометричний аналiз проводили за допомогою програмного забезпечення Carl Zeiss (AxioVision SE64 Rel.4.9.1) та мшроскопу Olympus BX 51 (Японiя).
Б1охш1чне дослгдження
Для оцшки метаболiчних змш у дистальному сегментi сiдничого нерва були проведеш бiохiмiчнi дослiджения про- та антиоксидантно! системи. Для цього визначали
актившсть ферменпв антиоксидантного профiлю дiï: глутатюнпероксидази (GPx), глутатiонредуктази (GR) та каталази, piBeHb вiльний низькомолекулярних SH-груп. Про piBeHb оксидативного ушкодження сввдчили концентращя ТБК - реагуючих продуктiв, дieнових кон'югатiв, карбонiльних груп. Бiохiмiчнi показники визначали у супернатантах. Для цього фрагменти нерва гомогешзували i центрифугували при 10 000 g протягом 20 хв та дослiджували спектрофотометричним методом з використанням спектрофотометра ^Quant, Bio-Tek, (США).Рiвень загального бiлка визначали за методом Lowry [5]. Каталазну активнiсть визначали за методом Aebi [6]. Концентрацiю ТБК - активних продуктiв визначали в гомогенатах за методом Uchiyama [7]. Вмiст дieнових кон'югатiв у вимiрювали за методикою, описаною у статп Гаврилова В. Б. [8]. Визначення рiвня низькомолекулярних SH-груп здшснювали за методом Елмана. Активнiсть глутатiонпероксидази (GPx; номенклатура ферменпв: EC 1.11.1.9) вимiрювали за зменшенш рiвня NADPH в сполученоï глутатюнредуктазной (GR;номенклатура ферментiв: EC 1.8.1.7) реакцп [9]. Активнiсть глутатiонредуктази (GR; номенклатура ферменпв: EC 1.8.1.7) визначали за методом Paglia. Ступiнь окисноï модифшацп протеïнiв (ОМП) оцiнювали за вмютом карбонiльних похiдних протеïнiв колориметричним методом [10].
Порiвняння отриманих результатiв здшснювали за допомогою Ькритерш Стьюдента. Рiвень статистично1' значущостi був встановлений на рiвнi Р<0,05.
Результати дослiджень
У експерименп проведено спiвставлення та анал1з змiн метабол1чного профшю ушкодженого нерва та м'язiв в залежностi ввд протiкання процесiв регенерацiï нерва. Результати вщновлення в контрольнiй групi корелювали згiдно строк1в, швидкостi та якосп вiдновлення з вiдновленням великих дефекпв ( бiльше 10 см) у людини, оск1льки 1 см дефекту у кроля вщповвдае приблизно 1/3 довжини стегна. Гiстологiчнi дослвдження подтвердили регенеративнi процеси у зонi пластики нерва i у дистальних сегментах, проте ступiнь вiдновлення нерва суттево вiдрiзнявся мiж групами порiвняння. Так, у зош трансплантату в уах групах нервовi волокна регенерували до дистального шва, а при застосуванш клiтинних суспензiй к1льк1сть осьових цилiндрiв був достовiрно бiльшим в 22,5 рази. У дистальний сегмент ушкодженого нерва ознаки проростання фасцикул та репаративного вщновлення зареестровано лише у при застосуванш суспензп к1сткового мозку (табл. 1)
Таблиця 1
Регенеращя нервових сiдничого нерва п1сля аутопластики_
Група/сегмент Шдльшсть нервових волокон, од/мм3
Проксимальний Аутопластика Дистальний
Контроль 9601,0±285,5
Травма 4895,1±331,7а 1501,0±121,1а -
ТЖТ 6693,7±269,8а,Ь 3029,0±206,8а,Ь -
ТКМ 7004,7±350,6а,Ь 3245,4±200,5а,Ь 851,9±54,3а,Ь
Комплекс 7586,2±456,1а,Ь 3786,3±210,7а,Ь,с4 906,0±54,4а,Ь,с
Примтка: ТЖТ - трансплантащя жирово1' тканини; ТКМ - транспланташя к1сткового мозку; a - достовiрно до контролю (p<0,05); b - достовiрно до травми (p<0,05); с - дост^рно до ТЖТ (p<0,05); d - достовiрно до ТКМ (p<0,05)
Аналiз метаболiчних змiн полягав у оцшш змiн маркерiв енергетичного профiлю, окиснювального стресу, прооксидантно-антиоксидантно1' рiвноваги. Основними показниками цих розладiв е:
1) утворення ТБК - активних продукпв (продукти ПОЛ, що взаемодшть з тiобарбiтуровою кислотою), основним компонентом яких е МДА;
2) утворення ДК;
3) поява карбошльних груп в ушкоджених протешах;
4) ушкодження та зменшення рiвня метабол1чно активних вiльних низькомолекулярних SH-груп, основним компонентоя яких е глутатюн;
5) актившсть БТ^афорази (NAD(P)H-хiноноксидоредуктази; номенклатура ферментiв:EC 1.6.99.2) - ензим, який задiяний у вiдновленнi хiнонiв;
6) актившсть глутатюнпероксидази (GPx; номенклатура ферменпв: EC 1.11.1.9) - за
учасп глутатюну вiдновлюe перекис водню до води;
7) активнють глутатiонредуктази (GR; номенклатура ферментiв: EC 1.8.1.7) -фермент, який вiдновлюe дисульфiдний зв'язок окисленого глутатiону GSSG до його сульфпдрильно! (метаболiчно активно!) форми GSH;
8) активнiсть каталази (номенклатура ферменпв:ЕС 1.11.1.6) - нейтралiзуe перекис водню;
9) загальний рiвень бiлка - стутнь атрофiчних, гiпотрофiчних i дистрофiчних змш органу.
Бiохiмiчнi дослвдження засвiдчили, що в ушкодженому нервi рiвень ТБК - активних продукпв збiльшився у 2,7 разiв (р<0,05), ДК - у 3 рази (р<0,05), карбонiльних груп - у 2,7 разiв (р<0,05), а вмiст вiльних низькомолекулярних SH-груп був меншим щодо контрольного показника - у 3,8 разiв (р<0,05). Цi данi вказують на розвиток прогресуючого окиснювального стресу та ушкодження бiлкових i лiпiдних компонентiв клтгинних структур ушкодженого нерва (табл. 2).
При трансплантацi! жирово! тканини (ТЖТ) i к1сткового мозку (ТКМ) встановлено позитивний вплив застосованих засобiв. Так, рiвень ТБК-активних продуктiв зменшився у 2 i 1,2 рази (р<0,05), ДК - у 1,5 i 1,4 рази (р<0,05), карбошльних груп - у 2,4 ^,2 рази (р<0,05). Разом з тим вмют вiльних низькомолекулярних SH-груп достовiрно збiльшився у 1,9 i 1,6 разiв. Тобто за всiма параметрами оцшки окисного стресу ТЖТ була бтш виражений вплив на патолопчш окиснi процеси в ушкодженому нервг При цьому комбiноване застосування цих засобiв позитивно вплинуло на рiвень утворення/ввдновлення вiльних низькомолекулярних SH-груп (на 36,3% щодо ТЖТ i на 68,9% щодо ТКМ, р<0,05), що вказуе на активацш ендогенних антиоксидантних метаболiчних шляхiв пiсля аутопластики.
Активнiсть GPx пiсля травми та аутопластики зменшилася у 1,5 разiв (р<0,05), що вказуе на порушення ще! системи, тобто зменшення вмiсту ферменту або його власна пероксидащя пiд дiею АФК та втрати активностi (табл. 2). При застосуванш ТЖТ i ТКМ встановлено компенсаторну активацiю GPx: активнiсть ферменту зросла у 2,8 i 1,7 разiв (p<0,05).
Рiвень активностi GR у нервi був меншим контрольних значень майже у 2 рази (р<0,05), що пояснюе причиню низького рiвня ввдновленого глутатюну. Разом з тим за умов ТЖТ актившсть GR достовiрно збтшилась у 2,8 разiв (р<0,05), а тсля ТКМ - у 2,1 рази (р<0,05).
Активнiсть каталази пiсля аутопластики збiльшилась у 2 рази (р<0,05), що е компенсаторною реакщею у вiдповiдь на прогресуючу продукцш ендогенних цитотоксичних метаболiтiв. Пюля ТЖТ i ТКМ встановлено зменшення активносп каталази у 1,6 i 1,3 рази (р<0,05), що е показником зменшення продукци перекису водню ^ як наслiдок, зменшення продукування самого ензиму, тобто ввдбуваеться репаративне вщновлення ушкодженого нерва.
Активнiсть DТ-дiафорази тсля травми була достовiрно меншою щодо контрольного показника у 4,4 рази (р<0,05), при ТЖТ i ТКМ достовiрно зросла у 1,2 i 3,3 рази (р<0,05), а при !х комбiнацi! збiльшилася у 3,6 разiв (р<0,05) i досягла рiвня контрольно! групи, тобто вiдбувала виражена активацiя DТ-дiафорази пiд дiею введення клiтин червоного к1сткового мозку. Тобто застосування ТЖТ шдвищувало вплив ТКМ i позитивно вплинуло на рiвень продукцi!' ДК (р<0,05), ввдновлення вшьних низькомолекулярних SH-груп (р<0,05) i актившсть DТ - дiафорази (р<0,05).
Метаболiчний профiль денервованого скелетного м'язу мав схож1 тенденцi! з вiдповiдними показниками хiрургiчно вiдновленого сiдничого нерва. Так, концентращя ТБК-активних продуктiв, головним чином малонового дiальдегiду (продукту ПОЛ) в м'язах на рiвнi стегна була б№ше контрольних значень у 1,9 разiв, а на рiвнi гомiлки в 3,1 рази (р<0,05) (табл. 3) Рiвень продукцi!' дiенових кон'югапв, тобто окиснених жирних кислот, також зростав у дистальних м'язах щодо мюця ауопластики сiдничого нерва. На рiвнi стегна концентращя дiенових кон'югапв була бшьшою в середньому у 2 рази, а на рiвнi гомшки у 2,5 рази (р<0,05). Ступiнь окиснення бiлкових молекул за показником концентрацп карбонiльних груп зрю у 2 i 3,1 разiв (р<0,05). Разом з тим рiвень вiльних низькомолекулярних пептидних носi!в SH-груп в м'язах гомiлки був достовiрно меншим порiвняно до м'язiв стегна на 64,7%, а порiвняно до контрольного показника у 1,7 i 2,8 разiв
(р<0,05) ввдповвдно.
Аналiз змiн рiвня загального бiлка в гомогенатах м'язiв засвщчив атрофiчнi процеси на рiвнi гомшки: вмiст проте!нiв був достовiрно меншим контрольних значень на 12,2% (р<0,05). Разом з цим встановлено компенсаторну активацiю ензимiв системи антиоксидантiв. Активнють каталази на рiвнi стегна збшьшилась у 1,8 разiв (р<0,05), а глутатюн пероксидази i глутатiон редуктаза в середньому у 1,6 разiв (р<0,05). У м'язах гомiлки встановлено активащю лише каталази в 2,5 разiв щодо контрольного показника (р<0,05). При цьому активнiсть DT-дiафорази в обох випадках достовiрно зменшилась в 2 i 3,5 разiв, що також е проявом дистрофiчних змш органу (р<0,05). Отриманi данi вказують на те, що у тривало денервованих скелетних м'язах вшбуваеться порушення рiвня i напрямку окисно-вiдновних реакцш, що спричинюе окиснення бiологiчних мембран клтган i проте!шв (не лише структурних, але i ензимiв) на та продукування перекису водню, в№них радикалiв та !х цитотоксичних похадних. На нашу думку метаболiчнi розлади лежать в основi вторинних дистрофiчних змiн скелетних м'язiв, що встановлено на рiвнi м'язiв гомiлки. При цьому регенерац1я ушкодженого нерва активувала репаративнi процеси у м'язах на рiвнi проростання нервових волокон, в основному на рiвнi невроми, що позитивно вплинуло на темпи !х атрофi! i дистрофп.
У груш тварин ТЖТ навколо сiдничого нерва на рiвнi пластики встановлено позитивну динамiку вiдновлення метаболiчного статусу тривало денервованого м'язу. У м'язах шнщвки на рiвнi мiсця пластики рiвень утворення ТБК-активних продуктiв зменшився на 29,8%, концентращя дiенових кон'югатiв на 34,4%, а концентращя карбонiльних груп на 15,4% (р<0,05). На рiвнi дистальних м'язiв, тобто гомiлки, вадповадш показники зменшилися вiдповiдно на 46,7%, 33,1% i 34,9%, тобто суттево менше. При цьому встановлено збшьшення рiвня низькомолекулярних SH-вмiсних антиоксидантiв на 34,0% у м'язах стегна i 61,3% у м'язах гомiлки, що головним чином реалiзуеться за механiзмiв активацп !х синтезу та ввдновлення окиснених продуктiв пероксидацп (за учасп GPx i GR).
Ферментативнi системи детоксикацп продуктiв ПОЛ (каталаза, GPx i GR) вiдновилися до рiвня контрольних показник1в на рiвнi аутопластики (р<0,05), а на рiвнi гомiлки ввдшчено ознаки компенсаторно! активацi!' цих ензимiв, що можна розглядати в якосп активацi! захисного механiзму в м'язах щодо попередження розвитку оксидативного стресу i вторинних метаболiчних розладiв з метою падтримки м'язiв на етат репаративно! регенерацi! сiдничого нерва, тобто до решнервацп м'язiв.
В дистальних м'язах щодо рiвня аутопластики актившсть DT-дiафорази не досягала контрольного рiвня, але була бiльше порiвняно групи без корекцi!' майже в 2,6 разiв (р<0,05). Про позитивний вплив ТЖТ вказуе також незмшений рiвень загального бiлка в гомогенатах дослшжуваних м'язiв. Одним iз можливих механiзмiв протекторного впливу ТЖТ е паракринна регулящя оточуючих тканин шнщвки, а також пряма детоксикацiя ПНЖК дисперговано! жирово! тканини, що зменшуе концентрац1ю вiльних радикалiв шляхом !х прямо! нейтралiзацi! i вiдповiдно здшснюе опосередкований цитопротекторний ефект.
Аналiз змiн концентрацп маркерiв окиснювального стресу у скелетних м'язах шнщвки тсля аутопластики великого дефекту сщничого нерва та введения ТКМ засвщчив певнi рiзницю впливу запропонованого способу корекцi! метаболiчних розладiв щодо ТЖТ. За загальним рiвнем бiлка в зразках вiдмiчено лише тенденщю щодо попередження гiпотрофiчних змш м'язiв, достовiрно! рiзницi на рiвнi стегна та гомiлки iз групою без ТКМ не встановлено. Рiвень генерацi!' продуктiв ПОЛ зменшувався щд впливом ТКМ: концентрацiя дiенових кон'югапв була меншою на 25,1% i 20,3% (р<0,05) залежно ввд рiвня скелетного м'язу щодо аутопластики, концентрац1я ТБК-активних продуктiв зменшилася -на 12,7% i 22,1% (р<0,05), а карбонiльних груп - на 32,1% i 25,8% (р<0,05) вiдповiдно. Проте в загальному вимiрi цих даних рiвень утворення зазначених продуктiв дисметаболiчних реакцiй при ТЖК був меншим за виключенням ступеню утворення карбошльних груп в м'язових бiлках.
Концентращя низькомолекулярних пептидних SH-груп в м'язах гомшки достовiрно зменшився на 38,2% i 37,2% (р<0,05). При цьому стутнь нейтралiзацi! ендогенного аитиоксидаиту у м'язах гомiлки був суттево вищим порiвняно до м'язiв стегна (в середньому на 38,3%). В порiвнянi iз впливом ТЖТ на рiвень утворення
низькомолекулярних пептидних SH-груп, останнiй мав достовiрно бiльший вплив на рiвнi м'язiв гомiлки (на 14,9%).
Система ензиматичного антиоксидантного захисту шд впливом ТКМ характеризувалася неоднозначними змiнами вiдновлення цитопротекторний механiзмiв детоксикаци продуктiв ПОЛ. Так, на рiвнi м'язiв стегна актившсть глутатiон пероксидази i глутатiон редуктаза була меншою як до групи без ТКМ, так i до групи контролю, а активнiсть каталази лише наближалась до контрольних показнишв. На рiвнi м 'язiв гомiлки достовiрноl рiзницi щодо групи без ТКМ не встановлено. Отриманi даш можуть вказувати на прояви виснаження дослщжувано1 системи детоксикаци. У вщповвдь на цi явища в м'язах гомiлки зареестровано компенсаторне збiльшення активносп DТ-дiафорази (майже в 4,1 разiв, а в м'язах стегна ввдновлення до контрольних значень). Тобто, вплив ТКМ позитивно впливае на короткотермшову генерацш реакцiй та вiдповiдних продукпв оксидативного стресу, що вичерпуе ендогенний пул цитопротекторний антиоксидантiв i зареестровано нами у виглядi зменшення концентрацп окиснених продуктiв бiлкiв i жирних кислот. Незважаючи на це потенщалу трансплантованих бластних клiтин не вистачае для тривало! пiдтримки достатнього рiвня ферментативних систем детоксикаци, що завершуеться !х виснаженням.
Порiвняльний аналiз впливу комбшовано1 трансплантацп i iзольованоl ТЖТ i ТКМ не показав суттево1 рiзницi мiж цими групами порiвняння. Сумарний позитивний вплив вiдмiчено лише на показнику активносп каталази, дiенових кон'югатiв, низькомолекулярних пептидних SH-груп. Змша iнших показник1в була в межах статистично1 похибки груп порiвняння.
Аналiз результатiв досл1дження
Експериментальнi дослвдження дозволили порiвняти та отримати залежнiсть рiвня регенерацп ушкодженого нерва та метаболiчних змiн тривало денервованих м'язiв. Встановлено, що вдале х1рурпчне ввдновлення нерва запобйае розвитку дисметаболiчних порушень м'язiв кiнцiвки i травмованого нерва. Разом з тим регенеращя травматично ушкодженого нерва ^зь трансплантат е досить ускладненою в зв'язку з формуванням глiального та сполучнотканинного рубця у шсщ шва фрагментiв нерва i вiдповiдно рiзний рiвень проростання нервових волокон в дистальному сегментi нерва. При цьому застосування аутологiчних тканинних продукпв - суспензи активованих адипоцитов та к1сткового мозку - дозволяе активувати репаративш процеси, пришвидшити рiвень вiдновлення нерва. Проте це не зупиняе розвиток окиснювального стресу i наступне перекисне окиснення структурних компоненпв клiтин (лiпiдiв плазматичних мембран, бшшв та нуклеопротещв) i продукци цитотоксичних продуктiв.
Найбiльш iнформативними показниками цих порушень е утворення дiенових кон'югапв (ДК) iз окиснених полiненасичених жирних кислот (ПНЖК), малонового дiальдегiду (МДА) та поява карбоншьних груп протешв, як наслвдок окисно1 модифжаци бшшв (ОМБ). Особливо легко окиснюються бшки, що мiстять у своему полшептидному ланцюгу амiнокислоти з SH-групами. В свою чергу вiльнi низькомолекулярнi SH-групи, зокрема глутатiон, виконують роль ендогенних антиоксидантiв i в гострiй фазi травматично1 хвороби нейтралiзують вiльнi радикали. Так, глутатiонпероксидаза за участi глутатюну вiдновлюе перекис водню до води, ввдновлюе органiчнi продукти пдропероксидацп до вщповщних спиртiв. Активащя глутатюнзалежно1 антиоксидантно1 ферментно1 системи нейтралiзуе реакцп ПОЛ i пiдтримуе у ввдновленому сташ SH-групи протешв, забезпечуючи цим !х функцiональну активнiсть. Додатково до утилiзацil цитотоксичного перекису водню залучаеться каталаза, гшерактившсть яко! встановлено нами при травмi у нервi та м'язах, що вказуе також на достатнш рiвень функцiонування цитопротекторних механiзмiв.
Узагальнюючи результати дослiджень метаболiчного профiлю ушкоджених органiв кiнцiвки можна стверджувати про те, що головним бiохiмiчним проявом та механiзмомо патологiчних змiн е порушення редокс-статусу тканин, який асоцшований iз енергетичним обмiном, iшемiею, запаленням та репаративним вiдновленням. Застосування за цих умов аутолопчних клiтинних суспензш дозволяе частково нейтралiзувати патобiохiмiчнi порушення та сприяти тканинному в1дновленню: ТЖТ нейтралiзуе ПОЛ, позитивно впливае на рiвень утворення глутатiону, а застосування ТКМ додатково активуе енергетичний обмш. За даними бiохiмiчних дослiджень можна стверджувати, що ТЖТ i ТКМ попереджае
розвиток метаболiчних порушень в денервованих м'язах, метаболiчно тдтримуе м'яз на етат решнервацп, активуе компенсаторнi мехаиiзми цитопротекцп i супутню репарацш тканин. В порiвняльному планi ТЖТ е потенцшно бiльш перспективним аутологiчним матерiалом, що може бути застосований з метою пвдтримки скелетного м'язу при травматичнш хворобi периферiйного нерва.
Висновки
1. Аутопластика перифершного нерва на даний момент е оптимальним методом замщення дефекту нерва, який проте при великих дефектах забезпечуе часткову регенерацш ушкодженого нерва i дозволяе запоб^и гiпотрофiчним змiнам денервованих м'язiв. Проявом метаболiчних розладiв при травмуваннi нервiв та м'язiв е порушення окисно-вщновно! рiвноваги, компенсаторна активац1я систем антиоксидантного захисту нерва та м'язiв - каталази, системи обм^ глутатiону.
2. Використання сучасних методiв клiтинно! терапп мае позитивний вплив на репаративш процеси ушкодженого нерва, запобiгае гiпотрофiчним змiнам скелетних м'язiв. Суспензiя активованих адипоцитiв на метаболiчному рiвнi активуе синтез глутатюну та ферментiв його вщновлення, забезпечуе компенсацiю DТ-дiафорази; суспензiя клiтин червоного к1сткового мозку активуе регенерацш ушкодженого нерва у дистальний ввддш, частково активуе систему захисту ввд оксидативного стресу,активуе DТ-дiафоразу та обмш глутатiону, забезпечуе вадновлення про-та антиоксидантно! рiвноваги, що запобiгае дистрофiчним змiнам ушкоджених тканин.
3. Застосування аутологiчних тканинних продуктiв - суспензп активованих адипоцитiв та кiсткового мозку - дозволяе активувати репаративнi процеси, пришвидшити рiвень вадновлення нерва, зменшити агресивтсть фiброзного рубця на рiвнi дистального шва та навколо нерва цим самим покращуючи трофiку та зб№шуючи к1льк1сть нервових волокон, що проростають через дистальне мiсце шва.
4. Застосування технологш, що запропоноваш, дозволяе за рахунок комплексного впливу на процеси запалення та регенерацп знизити рiвень денервацiйних змiн у м'язах, та покращити виживання м'язу на перюд денервацп, що зб№шуе ймовiрнiсть ефективно! решервацп за умови пластики великого дефекту.
5. Комбшоване застосування суспензп жирових клiтин та мезенх1мальних клiтин червоного к1сткового мозку забезпечуе найбшьш оптимальну регенерацiю нерва ^зь сегмент аутопластики, формуе навколо нерва жирову муфту, що попережуе формування фiброзного рубця навколо нерву та покращуе трофiку та умови для вщновлення.
6. Комбiнуваиня клтшнних технологiй комплексно впливаючи на ва ланки регенерацi! активуе нейролемоцити нерва, активуе DТ-дiафоразу та вiдновлюе рiвень глутатiону, тобто нейтралiзуе пiслятравматичне оксидативне ушкодження, майже елiмiнуючи перший етап раневого процесу та пришвидшуючи його.
7. В другому етат раневого процесу велика кшьшсть факторiв росту та стовбурових клгшн значно стимулюе неоаигiогенез в зонi ушкодження, знижуючи рiвень iшемi!, що е критичною для регенерацп нерва.
8. Жирова тканина також виконуе функцiю мехашчного захисту шва, в той час як фактори росту та стовбуровi клгтини покращують !! iнтеграцiю та в мющ траисплаиатцi! формуючи шву ковзну систему нерва навколо мюця травми.
Taблиця 2
Метаболiчнi змши у диегальному фрагментi едничого нерва пicля аутопластики
Група Рiвень продукпв перекисного окиснення Вiльнi низькомолекуля рш SH-групи, нмоль/мг протешу Рiвень бiлкa, мг/мл Aктивнiсть ферменпв антиоксидантного профiлю Aктивнiсть ензиму DT-дiaфорaзи, нмоль/мг/хв
TБK-реaгyючi продукти, нмоль/мг протешу ДK, нмоль/мг протешу Kaрбонiльнi групи, нмоль/мг протешу Kaтaлaзa, нмоль/мг протешу GPx, нмоль/мг протешу GR, нмоль/мг протешу
Kонтроль 0,86±0,06 1,06±0,04 0,82±0,04 16,84±0,46 1,99±0,09 14,66±0,31 1,06±0,03 2,13±0,03 2,40±0,04
Tрaвмa 2,34±0,10 a 3,25±0,06 a 2,28±0,05 a 4,45±0,25 A 3,77±0,38 A 30,33±2,79 A 0,70±0,16 a 1,07±0,06 a 0,54±0,02 a
TЖT 1,13±0,07 a,b 2,16±0,10 a,b 1,54±0,09 a,b 8,69±0,25 a,b 2,98±0,22 a,b 18,65±1,82 a,b 2,00±0,36 a,b 3,07±0,59 b 0,67±0,03 a,b
TKM 1,97±0,04 a,b,c 2,35±0,04 a,b 1,80±0,09 a,b 7,02±0,38 a,b,c 3,03±0,33 a,b 22,38±1,13 a,b 1,24±0,03 a,b,c 2,33±0,02 b 1,77±0,04 a,b,c
Kомплекс 1,44±0,07 a,b,c,d 2,20±0,09 a,b 1,65±0,08 a,b 11,86±0,45 a,b,c,d 2,88±0,46 a,b 22,84±1,75 a,b 1,45±0,06 a,b,e 2,27±0,14 b 1,94±0,23 b,c
Примтка: TЖT - трaнсплaнтaцiя жирово1' тканини; TKM - трaнсплaнтaцiя шсткового мозку; ДТ - дieновi кон'югати; GPx - глyтaтiон пероксидаза; GR -глутатюн редуктаза; a - дост^рно до контролю (p<0,05); b - достовiрно до травми (p<0,05); с - достовiрно до TЖT (p<0,05); d - достовiрно до TKM (p<0,05)
Таблиця 3
Метаболiчнi змши cкелетних m^îïb на тлi аутоплаcтики ciдничого нерва
Грyпa Рiвень продyктiв перекисного окиснення Вiльнi низькомолекyля рнi sh-групи, нмоль/мг протешу Рiвень бшка, мг/мл Активнiсть ферментiв антиоксидантного профiлю Активнiсть ензиму D^ дiaфорaзи, нмоль/мг/хв
TБK-реaгyючi проекта, нмоль/мг протеïиy ДД, нмоль/мг протеïнy Kaрбонiльнi групи, нмоль/мг протеïиy Kaтaлaзa, нмоль/мг протешу GPx, нмоль/мг протешу GR, нмоль/мг протешу
М'язи стегна в мющ пластики
Kонтроль 0,74±0,03 1,73±0,07 1,85±0,04 13,27±0,28 7,31±0,41 4,03±0,12 1,35±0,05 1,32±0,03 0,85±0,02
Травма 1,41±0,06a 3,51±0,06a 3,77±0,04a 7,48±0,21a 7,12±0,18 7,28±0,62a 2,22±0,07a 2,12±0,07a 0,41±0,08a
ТЖТ 0,99±0,03a,b 2,30±0,06a,b 3,19±0,12a,b 10,03±0,11a,b 7,94±0,16b 4,04±0,29b 1,40±0,05b 1,42±0,01a,b 0,80±0,07b
ТЮМ 1,23±0,03a,b,c 2,63±0,03a,b,c 2,56±0,09a,b,c 10,34±0,17a,b 7,30±0,40 5,96±1,99 0,95±0,04a,b,c 1,05±0,02a,b,c 0,97±0,07b
Kомплекс 1,23±0,05a,b,c 2,21±0,04a,b 2,92±0,05a,b 10,63±0,34a,b,c 7,16±0,31 4,54±0,06a,b 1,42±0,02b,c,d 1,67±0,01a,b,c,d 0,82±0,06b
М'язи гомiлки
^^фоль 0,73±0,04 1,86±0,04 1,86±0,07 13,48±0,34 6,87±0,37 4,07±0,18 1,40±0,05 1,36±0,04 0,87±0,04
Травма 2,31±0,12a 4,71±0,18a 5,81±0,14a 4,65±0,36a 6,03±0,17a 10,34±0,40a 1,39±0,02 1,42±0,01 0,25±0,02a
ТЖТ 1,23±0,04a,b 3,15±0,13a,b 3,78±0,30a,b 7,5±0,31a,b 7,26±0,45b 12,15±0,31a,b 1,99±0,07a,b 2,19±0,04a,b 0,67±0,03b
TKM 1,80±0,09a,b,c 3,75±0,11a,b,c 4,31±0,20a,b 6,38±0,23a,b,c 6,36±0,14 9,74±0,03a,c 1,35±0,06c 1,40±0,01c 1,03±0,04b,c
Kомплекс 1,74±0,10a,b,c 3,76±0,15a,b,c 3,73±0,20a,b 6,36±0,25a,b,c 6,76±0,09b,d 8,70±0,29a,b,c,d 1,55±0,08b,c,d 1,56±0,05b,c,d 1,00±0,03b,c
Примтка: ТЖТ - трaисплaитaцiя жирово1' тканини; TKM - трaисплaнтaцiя шсткового мозку; ДТ - дieновi кон'югати; GPx - глyтaтiон пероксидаза; GR -глутатюн редyктaзa;a - достовiрно до контролю (p<0,05); b - достовiрно до травми (p<0,05); с - дост^рно до ТЖТ (p<0,05); d - достовiрно до ТОМ (p<0,05)
Лггератури / References:
1. Millesi H. Bridging defects: autologous nerve grafts / H. Millesi // Acta Neurochir. - 2007. - Vol. 100. - P. 37-38.
2. The basis for diminished functional recovery after delayed peripheral nerve repair / T. Gordon, N. Tyreman, M.A. Raji // J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. - 2011. - Vol. 31.
- P. 5325-5334.
3. Peripheral nerve regeneration: Experimental strategies and future perspectives / Alessandro Faroni, S. Atefeh Mobasseri, Paul J. Kingham, Adam J. Reid // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2015. - Vol. 82-83. - P. 160-167.
4. Autologous peripheral blood stem cell transplantation for myocardial regeneration: a novel strategy for cell collection and surgical injection / G. Pompilio, A. Cannata, F. Peccatori, [et al.] // Ann Thorac Surg. - 2004. - Vol. 78(5). - P. 1808-1812.
5. Protein measurement with Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.I. Randal // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193, № 1. - P. 265-275.
6. Aebi H. Catalase in vitro / H. Aebi // Meth. Enzymol. - 1984. - Vol. 105. - P. 121-126
7. M. Uchiyama, M. Mihara. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test // Anal. Biochem. - 1978. - Vol. 86(1). - P. 271-278.
8. Измерение диеновых конъюгатов в плазме крови по УФ-поглощению гептановых и изопропанольных экстрактов /В.Б. Гаврилов, А.Р. Гаврилова, Н.Ф. Хмара // Лабор. дело. - 1988. - № 2. - С. 60 - 63 [V. B. Gavrylov, A. R. Gavrylova, N. F. Hmara Measurement of diene conjugates in blood plasma by UV absorption of heptane and isopropanol extracts. // Laboratory work.- 1988. - № 2. - P. 60 - 63.
9. Ellman G. Tissue sulfhydryl groups / G. Ellman // Arch. Biochem. Biophys. -1959. - Vol. 82, № 1. - P. 70-77.
10. Paglia D.E., Valentine W.N. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase .// J. Clin. Med. - 1967. - Vol. 70. - P. 158169
11. Zaytseva O. V., Shandrenko S. G. Modification of spectrophotometry method of determination of protein carbonyl groups // Ukr. Biokhim. Zhurn. - 2012. - Vol. 84(5). - P. 112116.
12. The use of undifferentiated bone marrow stromal cells for sciatic nerve regeneration in rats / R. Mohammadi, S. Azizi, N. Delirezh, [et al.] // Int. J. Oral Maxillofac. Surg.
- 2012. - Vol. 41(5). - P. 650-656.
13. Very small embryonic-like stem cells: characterization, developmental origin, and biological significance / M.Z. Ratajczak, E.K. Zuba-Surma, M. Wysoczynski, [et al.] // Exp Hematol. 2008. - Vol. 36(6). - P. 742-751.
14. Angiogenesis induced by autologous whole bone marrow stem cells seeded on collagen scaffolds in silicone nerve tubes. An experimental study / Ahmad Farouk Abd El Azeem, Hatem Mostafa Hussin Al-Ahmady, Mustafa Ahmad Abdul Rahman, [et al.] // Tanta Dental Journal. - 2014. - Vol. 11, Issue 3. - P. 227-234.
Работа поступила в редакцию 23.03.2018 года.
Рекомендована к печати на заседании редакционной коллегии после рецензирования
