CC BY
14
УДК 616.015.348:616.699-078.73-091.7
ОСОБЛИВОСТ1 ЕКСПРЕСП ПРОТЕШУ СЬЛШШ 11 ТА СТАН ГЕМАТОТЕСТИКУ-ЛЯРНОГО БАР'еРУ ПРИ Р1ЗНИХ ФОРМАХ ЧОЛОВ1ЧО1 НЕПЛ1ДНОСТ1
Вивченi iмуногiстохiмiчнi (1ГХ) особливостi експресп протешу С1аиё1п 11 в тканиш яечка 28 хворих при екскреторно-обтурацшнш та секреторнiй формах чоловiчоi неплщносп. Виявлене достовiрне зиження рiвня 1ГХ експресп протешу С1аиё1п 11 при секреторнш формi чоловiчоi неплiдностi та синдромi "лише клiтини СертолГ', порiвняно iз екскреторно-обтурацiйною неплiднiстю. Результати свщчать про значнi порушення гематотестикулярного бар'еру, як е основою розвитку додаткового iмунного компоненту та поглиблення патолопчинх змiн тканини яечка у хворих при секреторнш формi чоловiчоl неплщность
Ключов! слова: чолсдача нешпдшсть, протеш С1аис1т 11, гематотестикулярний бар'ер.
Робота е фрагментом НДР «Вивчити молекулярно-клтинш мехашзми порушень сперматогенезу при чоловiчiй неплiдностi раноХ ет^огИ та розробити новi методи дiагностики i л^вання». № ДержавноХ реестращХ 0107и000752.
В чолов1чш репродуктивнш систем1 юнуе гематотестикулярний бар'ер, утворений щшьними контактами м1ж кштинами Сертол1 (головний компонент) та структурами, яю вщокремлюють зрш сперматозо1ди вщ перифер1йно! кров1 { запоб1гають !х взаемодп з 1мунокомпетентними кштинами. Р1зш фактори, що порушують цей бар'ер, призводять до виникнення ¡мунних реакцш з утворенням в кров1 антитш до ештел1ю ам'яних канальщв та розвитку ауггамунно! неплдносп, осюльки сиерматозо!ди з'являються шд час статевого дозр1вання вже тсля того, як сформувалась 1мунна толерантнють до власних тканин оргашзму. Антиспермальш антитша - це ¡муноглобулши О, А та М, яю при взаемодп з1 сперматозоидами здатт !х 1мобшзувати, аглютишзувати, блокувати процес пенетращ (проникнення) в яйцекштину, унеможливлюючи процес запшднення, або блокувати процес ¡мплантацп ембрюна, навггь при використанш допом1жних репродуктивних технологш [2, 3]. Лабораторна д1агностика ¡мунно! непшдносп на сьогодшшнш день включае в себе дослщження кров1 та с1м'яно! рщини на антиспермальш антитша - 1муноглобулши О, А та М, хоча щ 1муноглобушни не е специф1чними маркерами ауггамунно! неплщносп [4, 5]. Кр1м того, гематотестикулярний бар'ер виконуе троф1чну функщю, а також забезпечуе в канальцях специф1чне гормональне середовище, необхщне для сперматогенезу. В зв'язку з цим, порушення гематотестикулярного бар'еру - важливий чинник виникнення порушень сперматогенезу (олпо-, терато- 1 азооспермп). Тому, стан гематотестикулярного бар'еру - важливий д1агностичний { прогностичний фактор, який необхщно враховувати в лшувант чолов1чо! неплщносп.
Молекулярними дослщженнями останшх роюв встановлено, що трансмембранш бшки с1мейства c1audiпs складають основу м1жкттинних щшьних замикальних контакпв, як утворюють тканинш бар'ери, в тому числ1 - гематотестикулярний бар'ер, що юнуе в чолов1чш репродуктивнш систем1 [7, 10, 11, 13]. Нещодавш дослщження показали, що протеш Qaudiп 11, який експресуе переважно в щшьних контактах м1ж кттинами Сертол1 вщграе важливу роль в регуляцп гематотестикулярного бар'еру та може слугувати як маркер стану гематотестикулярного бар'еру та сперматогенезу при чолов1чш неплщност р1зно! етюлогп [8, 12].
Метою роботи було визначити особливост стану гематотестикулярного бар'еру за 1муногютох1м1чною експрешею протешу Qaudiп 11 у хворих ¡з ексреторно-обтурацшною та секреторною формами чолов1чо! неплщносп.
Матерiал та методи дослщження. Дослщжено матер1ал 28 хворих ¡з азоосперм1ею, отриманий тд час шцизшно! бюпсп, з наступним гютолопчним та 1муногютох1м1чним дослщженням бюптату. Для встановлення клшчного д1агнозу форми неплщност користувались загальноприйнятою класифшащею [1]. При визначенш заключного д1агнозу враховували даш морфолопчного дослщження бюптату яечка та результати гормональних дослщжень. Згщно встановленого д1агнозу пащенпв було розподшено на три групи: 1 група - 11 хворих, у яких було встановлено д1агноз екскреторно-обтурацшно! неплщность Середнш в1к хворих - 33,6 роюв. 2 група - 12 пащет1в, у яких було встановлено д1агноз секреторно! неплщност !з блоком сперматогенезу на р1вш сперматогонш, сперматоципв 1 { 2 порядку чи сперматид. Середн1й в1к хворих - 29,5 роюв. 3 група - 5 пащенпв, у яких було встановлено д1агноз секреторно! непл1дност1 ¡з синдромом «лише кл1тини Сертол1». Середнш в1к хворих - 28,5 роюв.
Для пстолопчного дослщження бюптати тканини яечка фшсували в рiдинi Буена i заливали в парафш. 1з парафiнових блоюв виготовляли зрiзи завтовшки 5 мкм, яю фарбували гематоксилiн-еозином.
Iмуногiстохiмiчний (1ГХ) аналiз здiйсювався з використанням стандартного авщин-бiотинового методу. Для 1ГХ дослiдження бiоптати фiксували у 12% забуференому формалiнi, заливали в парафш i виготовляли зрiзи товщиною до 5 мкм. Зрiзи iнкубували з первинними антитiлами Claudin 11 (DAKO, Glostrup, Датя) в розведеннi 1:50. Наприюнщ препарати проявляли 1-2 хвилини у 0,05% розчинi дiамiнбензидину (DAB), дофарбовували гематоксилiном та заключали в канадський бальзам. Як позитивний контроль використовували зрiзи тканин iз вщомим заздалегiдь високим вмiстом Claudin 11. Ti ж зрiзи служили як негативний контроль, але без обробки первинними антитiлами. В кожному випадку для 1ГХ дослiдження аналiзували 12-16 зрiзiв. Розповсюдженiсть та iнтенсивнiсть 1ГХ реакцп оцiнювали за напiвкiлькiсним методом в балах [9]. Розповсюджешсть реакцп або кiлькiсть забарвлених ядер чи цитоплазми клiтин оцiнювали вiд 0 до 3 балiв за такими критерiями: 0 - вiдсутнiсть клггин iз видимим забарвленням, 1 - забарвлено менше 10% клiтин, 2 - забарвлено бшьше 10%, але менше 50% клггин, 3 - рiвномiрно забарвлено бiльше 50% клггин клiтинного шару. Iнтенсивнiсть забарвлення ядер або цитоплазми ощнювали за такими критерГями: 0 - вщсуттсть видимого забарвлення, 1 - слабо забарвлеш ядра або цитоплазма, 2 - помГрно забарвлеш ядра або цитоплазма, 3 - штенсивно забарвлеш ядра або цитоплазма. Загальний результат 1ГХ реакцп визначався за показниками Гмунопстох1мГчного коефщенту (1ГХК) вгд 0 до 9 балГв, який одержували перемножуванням ощнок розповсюдженосп та штенсивносп забарвлення. Проводився статистичний аналГз отриманих результата.
Результати дослiдження та Тх обговорення. При дослщженш 1ГХ експресп протешу Claudin 11 в груш хворих на екскреторно-обтурацшну неплщшсть Гз збереженим сперматогенезом (всього 11 пащенпв), спостерпалось помГрне мембранозно-цитоплазматичне зафарбування (4-6 бали) кттин СертолГ в 6-ти спостереженнях (54,5%), в п'яти випадках (45,5%), було виявлено виразну мембранозно-цитоплазматичну експресГю протешу Claudin 11 (7-9 бали) (Рис.1). Середне значення 1ГХК дорГвнювало 7,4 ± 0,45 бали. КлГтини сперматогенного ештелда - сперматогонп, сперматоцити 1 i 2 порядку виявляли слабку мембранозно-цитоплазматичну експресГю протешу Claudin 11 в 1-3 бали в усГх 11 спостереженнях (100%) дано! групи. Cередне значення 1ГХК становило 2,1 ± 0,18. Необхщно зазначити, що сперматиди та зрш сперматозо!ди характеризувались вщсутшстю 1ГХ експресп протешу Claudin 11 (0 балГв) в усГх 11 випадках (100%). В ендотелГальних кттинах перитубулярних гемокапшярГв виявлялась виразна мембранозно-цитоплазматична експресГя проте!ну Claudin 11 (7-9 бали) в п'яти випадках (45,5%), а в шести спостереженнях (54,5%) дано! групи спостерпалась помГрна мембранозно-цитоплазматична експресГя протешу Claudin 11 в 4-6 балГв. Cередне значення 1ГХК дорГвнювало 7,2 ± 0,45 бали (Таблиця 1).
Таблиця 1
Показники 1ГКХ експресп протеТну Claudin 11 в бшптатах яечка у хворих на pi3Hi форми
чоловiчоl неплiдностi
Структуры елементи бюптата яечка Форми непл1дност1 у чоловшв
Екскреторно-обтурацшна, n = 11 Секреторна, n = 12 Синдром "лише кл1тини СертолГ', n = 5
Кттини Сертол1 7,4±0,45* 5,3 ±0,42* 0,8±0,6*
Ендотелш гемокапшяр1в 7,2±0,45* 5,3 ±0,42* 0,8±0,6*
Сперматогонп 2,1±0,18 1,5±0,17 -
Сперматоцити 2,1±0,18 1,5 ±0,17 -
Сперматиди 0 0 -
Сперматозо'щи 0 - -
* - достов1рно ]шж групами; р< 0,001.
В груш хворих на секреторну неплщнють Гз блоком сперматогенезу на рГвш сперматогонш, сперматоцинв 1 i 2 порядку чи сперматид (всього 12 пащенпв), спостерпалась помГрна мембранозно-цитоплазматична експресГя проте!ну Claudin 11 (4-6 бали) в кттинах СертолГ у восьми спостереженнях (66,7%) (Рис.2) в чотирьох випадках (33,3%) було виявлено слабку мембранозно-цитоплазматичну експресда протешу Claudin 11 (1-3 бали) в сустентоцитах. Cередне значення 1ГХК становило 5,43 ± 0,42. Клпини сперматогенного ештелда - сперматогонп та сперматоцити 1 i 2 порядку, що виявлеш в цш груш пащенпв, характеризувались слабкою
мембранозно-цитоплазматичною експрешею протешу Claudin 11 в 1-3 бали в ycix спостереженнях (100%) дано! групи. Середне значення 1ГХК для цих клiтин сперматогенного ештелда становило 1,5 ± 0,17. В ендотелiальних клiтинах перитубулярних гемокапiлярiв виявлялась помiрна мембранозно-цитоплазматична експресiя проте'ну Claudin 11 (4-6 бали) у восьми випадках (66,7%), а в чотирьох випадках (33,7%) дано! групи спостериалась слабка мембранозно-цитоплазматична експрешя проте'ну Claudin 11 в 1-3 бали. Середне значення 1ГХК дорiвнювало 5,3 ± 0,42 бали (Таблиця 1). В груш хворих на секреторну неплщшсть iз синдромом "лише кттини СертолГ' (всього 5 пащенпв), в клiтинах Сертолi спостерiгалось слабке мембранозно-цитоплазматичне зафарбування проте'ну Claudin 11 в 1-3 бали в 2 спостереженнях (40%) (Рис.3), в трьох випадках (60%) мембранозно-цитоплазматична експрешя проте'ну Claudin 11 в сустентоцитах була вщсугая (0 балiв). Cередне значення 1ГХК становило 0,8 ± 0,6 бали. В ендотелiальних кл^инах перитубулярних гемокапiлярiв спостерiгалась слабка мембранозно-цитоплазматична експрешя проте'ну Claudin 11 в 1-3 бали у двох спостереженнях (40%) дано! групи; в шших 60% випадюв експрешя проте'ну Claudin 11 була вiдсyтня (0 балiв). Cередне значення 1ГХК також дор1внювало 0,8 ± 0,6 бали (Таблиця 1).
Рис.
1 Екскреторно-обтурацшна Рис. 2 Секреторна неплщшсть ¡з блоком Рис. 3 Секреторна неплщшсть 1з
неплщшсть. Виразна мембранозно-цитоплазматична експреая протешу Claudin 11 (8 бал1в) в кл1тинах Сертсш. 1мунопероксидазний АВС-метод. х 200.
сперматогенезу на р!вш сперматоципв 1 порядку. Пом1рна мембранозно-цитоплазматична експреая протешу Claudin 11 (4 бали) в клггинах Сертсин. Тмунопероксидазний АВС-метод. х 200.
синдромом "лише кл1тини Сертсш". Слабка мембранозно-цитоплазматична експреая протешу Claudin 11 (2 бали) в кл^инах Сертоль ¡мунопероксидазний АВС-метод. х 200.
Таким чином, встановлено статистично достовiрне зниження показникiв 1ГХК експресн проте'ну Claudin 11 в кттинах Сертолi та ендотелiальних клiтинах перитубулярних гемокапiлярiв в групах хворих на секреторну неплщшсть iз блоком сперматогенезу на рiвнi сперматогонш, сперматоцитiв 1 i 2 порядку чи сперматид та iз синдромом "лише кттини СертолГ' порiвняно iз пацiентами iз екскреторно-обтyрацiйною неплщшстю.
Сучасними молекулярними дослiдженнями встановлено, що протеши сiмейства claudins -це трансмембранш бiлки, якi е найважлившим компонентом мiжклiтинних щiльних замикальних контакпв, що виконують бар'ерну фyнкцiю, утворюючи тканиннi бар'ери в рiзних органах. Крiм них, у складi щшьних контактiв виявляються трансмембранний проте'н occludin, цитоплазматичнi бiлки zonula occludens (ZO-1, ZO-2, ZO-3) та junctional adhesion molecule (JAM), але в значно в меншш кiлькостi. Отже, клаудши е головним компонентом мiжклiтинних щшьних замикальних контакпв, молекула клаyдiнy мае чотири трансмембранних домени, двi позаклггинш та одну внyтрiшньоклiтиннy петлi та N- i С- кiнцi, що розташовуються в цитоплазмi. У людини вiдомi 24 члени цього шмейства. Але, саме Claudin 11 експресуе в щшьних контактах мiж кттинами Сертолi. Це специфiчний для гематотестикулярного бар'еру проте'н [6, 7, 10, 11, 13, 14].
Виявлеш в нашому дослщженш особливостi 1ГХ експресн проте'ну Claudin 11, якi характерш для рiзних форм чоловiчоi' неплщносп, свiдчать про значнi порушення гематотестикулярного бар'еру в групах хворих на секреторну неплщшсть iз блоком сперматогенезу на рiвнi сперматогонш, сперматоципв 1 i 2 порядку чи сперматид та iз синдромом "лише кттини СертолГ' порiвняно iз пацiентами iз екскреторно-обтyрацiйною неплiднiстю. Враховуючи важливi функцп, якi виконуе Claudin 11 у формуванш цiлiсностi гематотестикулярного бар'еру, стае очевидним, що пошкодження компоненнв цього бар'еру лежать в основi розвитку iмyнного компоненту та поглиблення патолопчних змiн тканини яечка при чоловiчоi' неплiдностi.
1. Дослiджения проте'ну Claudin 11 виявило статистично достовiрне зниження показниюв експресii' 1ГХК в кттинах Сертолi та ендотелiальних клiтинах перитубулярних гемокапiлярiв в групах хворих на секреторну неплщшсть iз блоком сперматогенезу на рiвнi сперматогонiй,
сперматоципв 1 i 2 порядку чи сперматид та i3 синдромом "лише кл^ини СертолГ', ropÎB^HO з пацieнтами i3 екскреторно-обтурацiйною неплiднiстю.
2. Зиження рiвня 1ГХ експресiï протешу Claudin 11 при секреторнш формi чоловiчоï неплiдностi та синдромi "лише клггини СертолГ' свiдчить про значнi порушення гематотестикулярного бар'еру, яю е основою розвитку додаткового iмунного компоненту та поглиблення патолопчних змiн тканини яечка у хворих при цих формах чоловiчоï неплщносп.
3. При морфолопчному дослiдженнi бiоптату яечка доцiльно визначення стану гематотестикулярного бар'еру за 1ГХ експрешею протеïну Claudin 11, як важливого дiагностичного i прогностичного показника стану гематотестикулярного бар'еру, що дозволяе визначати наявшсть або вщсутшсть iмунного компоненту та обирати патогенетично обумовлене лшування чоловiчоï неплiдностi i корекщю порушень в кожному конкретному випадку та визначати подальший прогноз щодо вiдновлення сперматогенезу.
Перспективи подальших розробок у даному напрямку. Висока nymnueicmh та дiагностична цштсть сучасних 6ioMapKepie обумовлюе широт перспективи дожджень патогенезу найскладнших захворювань на молекулярному pieHi з використанням iмуногiсmохiмiчних (1ГХ) меmодiв дотдження.
1. Юнда И.Ф. Бесплодие в супружестве / И.Ф. Юнда, Л.И. Иванюта, Л.П. Имшинецкая // - Киев: Здоровье. - 1990. - 464 с.
2. Allegrucci C. Circulating human antisperm antibodies recognize prostasomes / C. Allegrucci, G. Ronquist, B. Ove Nilsson [et al.] // American Journal of Reproductive Immunology. - 2001. - Vol.46, N3. - P. 211-219.
3. Bohring C. Isolation and identification of sperm membrane antigens recognized by antisperm antibodies, and their possible role in immunological infertility disease / C. Bohring, E. Krause, B. Habermann [et al.] // Molecular Human Reproduction. -2001. - Vol.7, N2. - P. 113-118.
4. BohringC. Immune infertility: towards a better understanding of sperm (auto)-immunity. The value of proteomic analysis // C. Bohring, W. Krause // Human Reproduction. -2003. - Vol.18, N5. - P. 915-924.
5. Chiu W.W. Use of antisperm antibodies in differential display Western blotting to identify sperm proteins important in fertility / W.W. Chiu, L.W. Chamley // Human Reproduction. -2002. - Vol. 17, N4. - P. 984-989.
6. Chihara M. Molecular dynamics of the blood-testis barrier components during murine spermatogenesis / M. Chihara, S. Otsuka, O. Ichii [et al.] // Molecular Reproduction and Development. - 2010, - Vol. 77, N 7. - P. 630 - 639.
7. Florin A. Androgens and postmeiotic germ cells regulate claudin-11 expression in rat Sertoli cells / A. Florin, M. Maire, A. Bozec [et al.] // Endocrinology. - 2005. - Vol. 146, N3.- P. 1532-1540.
8. Fink C. Claudin-11 is over-expressed and dislocated from the blood-testis barrier in Sertoli cells associated with testicular intraepithelial neoplasia in men // C. Fink, R. Weigel, L. Fink // Histochemistry and Cell Biology. - 2009. - Vol. 131, N6. - P. 755 - 764.
9. Malmstrum P.U. Expression of ABH blood group isoantigen as a prognostic factor in transitional cell bladder carcinoma / P.U. Malmstrum, C. Busch, B.J. Norben [et al.] // Scandinavian Journal of Urology and Nephrology. - 1998. - Vol. 22.- P. 265-270.
10. Mazaud-Guittot S. Claudin 11 deficiency in mice results in loss of the Sertoli cell epithelial phenotype in the testis / S. Mazaud-Guittot, E. Meugnier, S. Pesenti [et al.] // Biology of Reproduction. - 2010. - Vol. 82, N1. - P. 202-213.
11. Mazaud-Guittot S. Phenotyping the claudin 11 deficiency in testis: from histology to immunohistochemistry / S. Mazaud-Guittot, A. Gow, B. Le Magueresse-Battistoni // Methods in Molecular Biology. - 2011. - Vol. 763. - P. 223-236.
12. Nah W.H. Claudin-11 expression increased in spermatogenic defect in human testes / W.H. Nah, J.E. Lee, Y.J. Park [et al.] // Fertility and Sterility. - 2011. - Vol. 95, N 1. - P. 385 - 388.
13. Wu X. Transgene-mediated rescue of spermatogenesis in Cldn11-null / X. Wu, M. Peppi, M.J. Vengalil [et al.] // Biology of Reproduction. - 2012. - Vol. 86, N5.- P. 1-11.
14. Xu J. Zona occludens-2 is critical for blood-testis barrier integrity and male fertility / J. Xu, F. Anuar, S.M. Ali [et al.] // Molecular Biology of the Cell. - 2009. - Vol. 20, N 20. - P. 4268 - 4277.
ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ПРОТЕИНА CLAUDIN
11 И СОСТОЯНИЕ ГЕМАТОТЕСТИКУЛЯРНОГО БАРЪЕРА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ МУЖСКОГО БЕСПЛОДИЯ Базалицкая С. В.
Изучены иммуногистохимические (ИГХ) особенности экспрессии протеина С1а^т 11 в ткани яичка 28 больных при экскреторно-обтурационной и секреторной формах мужского бесплодия. Выявлено достоверное снижение уровня ИГХ экспрессии протеина С1а^т 11 при секреторной форме мужского бесплодия и синдроме «только клетки Сертоли», по сравнению с экскреторно-обтурационным бесплодием. Результаты свидетельствуют о значительных нарушениях гематотестикулярного баръера, которые являються основой рвзвития дополнительного иммунного компонента и углубления патологических изменений у больных при секреторной форме мужского бесплодия.
Ключевые слова: мужское бесплодие, протеин C1audiп 11, гематотестикулярный баръер.
FEATURES OF PROTEIN CLAUDIN 11 EXPRESSION AND CONDITION OF BLOOD-TESTIS BARRIER AT VARIOUS FORMS OF MALE INFERTILITY Bazalytska S. V.
Immunohistochemical (IHC) features of an expression of protein Claudin 11 in testicular tissue of 28 patients with obstructive and secretory forms of male infertility are studied. Authentic depression of level IHC of an expression of protein Claudin 11 at the secretory form of male infertility and a syndrome «only Sertoli cells» is taped in comparison with obstructive form of male infertility. Results testify to appreciable disturbances of blood-testis barrier, which a basis of development additional immune component and excavation of pathological changes in patients at the secretory form of male infertility.
Key words: male infertility, protein Claudin 11, blood-testis barrier.
