CC BY
8УДК 582.548.25: 57.085.23
ОСОБЕННОСТИ ВОДНОГО РЕЖИМА CANNA х HYBRIDA HORT. EX BACKER В РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Тевфик А. Ш.1,2, Браилко В. А1
1Ордена Трудового Красного Знамени Никитский ботанический сад - Национальный научный центр РАН, Ялта, Республика Крым, Россия
2Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма, Симферополь, Республика Крым, Россия, tevfik. arzy@yandex. ru
Представлены основные этапы клонального микроразмножения канны садовой: введение в культуру in vitro вегетативных почек, адвентивное побегообразование, образование меристемоидов, регенерация микропобегов и растений из меристемоидов и последующая адаптация in vivo. Показаны изменения параметров водного режима трех сортов канны, таких как Суевия, Дар Востока и Ливадия в зависимости от условий культивирования in vitro, in vivo и ex situ.
Ключевые слова: канна садовая, меристемоид, регенерация, водный режим, in vitro, in vivo, ex situ.
ВВЕДЕНИЕ
Одними из наиболее отзывчивых сторон метаболизма растений при изменяющихся условиях культивирования являются характеристики водного режима. Вода - основной компонент растительных клеток и тканей, ее содержание варьирует в зависимости от особенностей конкретной культуры и от способности адаптироваться к экзогенным абиотическим факторам (Кушнеренко, Печерская, 1991). Ряд исследователей считает, что особенность регулирования водообмена - один из основных факторов, ограничивающих рост и развитие растений ex situ (Chaves et al., 2009). В работе Flexas et al. (2006) показано, что водный стресс и изменения в водном балансе в первую очередь влияют на ассимиляцию CO2, ограничивая процессы роста. Так как клональное микроразмножение направлено на получение большего количества растительного материала в нормальном функциональном состоянии, способного достаточно быстро развиваться и расти, актуальным является вопрос регуляции водного режима растений в условиях in vitro, in vivo и ex situ.
Известно, что морфогенез канны садовой при культивировании в асептических условиях может проходить через образование меристемоидных кластеров, а затем через регенерацию микропобегов из меристемоидов. В связи с этим, целью наших исследований было изучение оводненности тканей меристемоидов in vitro, микропобегов и растений Canna х hybrida hort. ex Backer в условиях абсолютной влажности in vitro, в защищенном грунте (in vivo) при контролируемых значениях относительной влажности воздуха и при выращивании растений в открытом грунте на коллекционных участках (ex situ), для составления прогноза их адаптационных способностей к водному стрессу и выделению среди изучаемых сортов наиболее устойчивых генотипов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследовании использовалиперспективные сорта канны садовой (С. х hybrid hort.) из коллекции ФГБУН «Ордена Трудового Красного Знамени Никитский ботанический сад -Национальный научный центр РАН» (ФГБУН «НБС-ННЦ»): 2 сорта селекции ФГБУН «НБС-ННЦ» (Дар Востока и Ливадия) и 1 сорт зарубежной селекции (Суевия).
Эксперименты проводили в лаборатории биотехнологии и вирусологии растений ФГБУН «НБС-ННЦ». В работе использовали методы культуры органов и тканей растений общепринятые (Бутенко, 1999; Kyte et al. 2013) и разработанные в отделе биотехнологии растений (Митрофанова, 2011; Митрофанова и др., 2014).
Для стерилизации вегетативных почек использовали 2 схемы ступенчатой стерилизации с применением таких антисептиков как этанол (C2H5OH), коммерческий препарат Domestos
2017 Ekosistemy, 11: 53-59
Published by Federal state autonomous education institution of higher education "V.I. Vernadsky Crimean Federal University"
(Великобритания), коммерческий препарат ДезТаб (КНР), фунгицид Thimerosal (Merk, Германия) с разной экспозицией (Тевфик, 2012).
Экспланты помещали на модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга [МС] (Murashige, Skoog, 1962) с 3,0 % сахарозы, 1,0 % агар-агара (Panreac, Испания) с добавлением 6-бензиламинопурина (БАП, Sigma, США) и гибберелловой кислоты (ГКз, Sigma, США). Пробирки с эксплантами культивировали при температуре 24 ± 1 С, 16-часовом фотопериоде и освещенности 2-3 клк. Для адвентивного побегообразования канны в питательную среду МС добавляли цитокинины тидиазурон (ТДЗ, Sigma, США) и БАП. Для адаптации регенерантов к условиям in vivo использовали перлит, смесь перлита и стерильного почвенного субстрата (1:1), и смесь перлита и торфа (1:1). Адаптацию проводили на СУВРе. Для поддержания 100 % влажности в качестве изоляторов применяли стеклянные и полиэтиленовые стаканы. Опыты проводили трижды в десятикратной повторности, определяли среднее, отклонение от среднего, подсчитывая количество образовавшихся меристемоидов и микропобегов. Обработку данных осуществляли с помощью программы STATISTICA forWindows, 6.0 (StatSoft, Inc., 2013).
Оценку оводненности проводили методом термической сушки при 105 °С до постоянного веса, фракционный состав воды изучали при помощи метода Маринчика-Гусева (Лищук, 1991). Анализ водного дефицита и водоудерживающая способность тканей листа был проведен для растений, произрастающих в условиях открытого грунта арборетума НБС (Кушнеренко, 1991).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Одним из факторов, который имеет значительное влияние на эффективность клонального микроразмножения, является состав питательной среды. В зависимости от типа экспланта и поставленных задач, на каждом этапе микроразмножения подбирается определенная питательная среда, в частности концентрации и комбинации регуляторов роста растений (Бутенко, 1999; Митрофанова, 2011; Mitrofanova et al., 2016).
Для введения в культуру in vitro вегетативных почек была использована питательная среда МС с 4 мг/л БАП и 1 мг/л ГКз. Среди изучаемых нами сортов у Дар Востока и Суевия удалось индуцировать образование дополнительных микропобегов. При этом коэффициент размножения не превышал 1,6 шт./эксплант, поэтому в дальнейшем для активизации адвентивного побегообразования использовали питательную среду МС с добавлением ТДЗ.
Как показали наши исследования, применение низкой концентрации ТДЗ не повышало частоту адвентивного побегообразования у сортов Дар Востока и Суевия, по сравнению с результатами, полученными на среде, используемой для введения эксплантов. Вместе с тем у 69 % и 95 % эксплантов сорта Ливадия удалось индуцировать образование дополнительных побегов при повышении концентрации ТДЗ до 1,27 и 1,91 мг/л соответственно (рис. 1). Однако высокое содержание ТДЗ (2,54 мг/л) снижало частоту адвентивного побегообразования, а при длительном культивировании вызывало активное образование каллуса темно-зеленой окраски у эксплантов двух сортов: Суевия и Дар Востока.
При добавлении в питательную среду ТДЗ в концентрации 1,27 и 1,91 мг/л у сорта Суевия (рис. 2) наблюдали активную регенерацию дополнительных эксплантов (более 4 шт./экплант) по сравнению с другими сортами (до 2,75±0,29 шт.).
Наряду с этим длительное культивирование (более 60 суток при пассаже каждые 30 суток на аналогичную питательную среду) микропобегов изучаемых сортов на средах с ТДЗ индуцировало появление меристемоидов в их основании. У сортов Суевия (рис. 3Б) и Дар Востока (рис. 3А) с каждым субкультивированием на свежеприготовленную среду с 1,27 мг/л ТДЗ повышался коэффициент размножения. На 180 суток отмечали в среднем образование 20,25±0,55 и 25±1,9 меристемоидов на эксплант у сортов Суевия и Дар Востока соответственно. Вместе с тем, экспланты сорта Ливадия на 180 сутки культивирования образовывали в среднем 40±5,62 меристемодов на питательной среде, дополненной 1,91 мг/л ТДЗ (рис. 3В).
I Суевия
ИДар Востока
I Ливадия
« $
ю
о С н ^
о SJ
- о
о S и s Tf es S
н s V № S
а S
Э « ffl
« о M
н «
о &
н и « ю о
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
0,64 1,27 1,91
Концентрация тидиазурона, мг/л
2,54
Рис. 1. Влияние сорта и концентрации ТДЗ в питательной среде на частоту адвентивного побегообразования канны садовой
и 2 s
И
s
H
s
<ц ta Cû О 4 u « <U Ю
о
о и
H о <u
т s
ч
о
И
Суевия
Дар Востока
Ливадия
0,64
1,27 1,91
Концентрация тидиазурона, мг/л
2,54
Рис. 2. Зависимость образования адвентивных микропобегов канны садовой от культивируемого сорта и концентрации ТДЗ в питательной среде
А Б В
Рис. 3. Сформовавшиеся меристемоиды канны садовой у сортов Дар Востока (А), Суевия
(Б), Ливадия (В); масштабный отрезок 1 см
6
5
4
3
2
1
0
Гистологические исследования позволили нам зафиксировать и подтвердить образование меристемоидов в основании микропобегов двух сортов канны садовой: Суевия и Ливадия (Тевфик и др., 2014а, 2014б). Анализ литературных источников показал, что подобные гистологические исследования немногочисленны. Так, имеются ряд публикаций, касающихся гистологического изучения образовавшихся меристемоидов у таких культур: Anthurium andraeanum Linden (Bhattacharya et al., 2015), Abies fraseri (Pursh) Poir. (Saravitz et al., 1993), Tacitus bellus (Spasicet al., 2015), Passiflora edulis Sims (Gloria et al., 1999) и Paulownia tomentosa Steud. (José et al., 2014).
Необходимо отметить, что после перенесения меристемоидов канны садовой, культивируемых на питательной среде, содержащей ТДЗ, на безгормональную питательную среду MC нам удалось индуцировать и пролонгировать процесс образования новых меристемоидов. Так, в основании меристемоидов сорта Суевия и Ливадия на 40-е сутки культивирования на безгормональной среде формировалось до 4 и 10 меристемоидов на эксплант соответственно. Однако, длительное культивирование не приводило к образованию новых меристемоидов. Это может свидетельствовать о том, что ТДЗ обладает пролонгирующим действием, которое при более продолжительном культивировании (более 50 суток) на среде без регуляторов роста угасает.
Для регенерации микропобегов из меристемоидов использовали питательную среду MC с 1,5 мг/л БАП и 1,5 мг/л ИУК, на которой в первые 50 суток культивирования отметили образование новых меристемоидов. При более длительном культивировании (при субкультивировании каждые З0 суток на аналогичную питательную среду) из меристемоидов формировались вегетативные почки, а затем микропобеги (рис. 4А) и полноценные растеньица, пригодные к высадке в условия in vivo (рис. 4Б). Нам также удалось исключить специальный этап ризогенеза при разработке схемы клонального микроразмножения канны садовой.
А Б
Рис. 4. Регенераты in vitro (А) и высаженные растения канны садовой сорта Суевия
в условия in vivo (Б)
Среди используемых нами видов субстрата для высадки на адаптацию in vivo, наиболее эффективным оказалось применение смеси перлита и стерильного почвенного субстрата. Однако приживаемость высаженных регенерантов была невысокой, поэтому необходимо было выяснить, как быстро происходит восстановление метаболизма за счет изменения водного режима растений канны от условий in vitro к условиям in vivo.
Меристемоиды Canna х hybrida были в значительной степени обводненными: 90-96 % от их сырого веса составляла вода, из которой фракция свободной - 67-83 %. Меристемоиды сорта Суевия содержали больше связанной воды, чем сорта Ливадия и Дар Востока (табл. 1).
Таблица 1
Оводненность меристемоидов и листьев Canna х hybrida при различных условиях
культивирования
Условия культивирования Сорт
Суевия Ливадия Дар Востока
Доля содержания воды / доля связанной воды, % M±m
in vitro ткани меристемоидов 92±4 I i5 ±2 SS±2 I 2S ±5 90±5 I 1б ±3
листья микропобегов 95±2 I S ±2 9б±2 I 30 ±2 94±3 I 42 ±5
in vivo листья регенерантов 92±4 I Зб ±2 S4±6 I 45 ±i 90±4 I 47 ±3
ex situ, листья июль 87±3 I 4б ±5 S5±4 I бЗ ±7 SS±5 I 5S ±4
август S4±4 I 5б ±2 S1±6 I 7б ±б S6±4 I 60 ±3
Общее содержание воды в тканях листьев микропобегов канны садовой in vitro также очень высокое, оно составило 91 -98 %, при этом на долю связанной фракции пришлось 10-47 % ее содержания (максимальный показатель у регенерантов сорта Ливадия). Исследования фракционного состава воды регенерантов in vivo продемонстрировали увеличение связанной воды до 31-50 %, при сходном уровне оводненности листьев (91-93 %).
Ранее нами были изучены анатомо-морфологические особенности регенерантов канны садовой (Tevfik et al., 2015; Mitrofanova et al., 2017a, Mitrofanova et al., 2017b), что позволило выявить наличие гидроморфной структуры вегетативных органов с множественными очагами гистогенеза в меристемоидах и недифференцированным мезофиллом листьев у микропобегов in vitro. И только на этапе корнеобразования и выращивания в теплице формируются кутикулярный покров, палисадный и губчатый мезофилл; клетки эпидермы становятся мельче и приобретают правильную форму. Для определения характера зависимости изменения морфометрических и структурных показателей листьев с фракционным составом воды в условиях культивирования in vitro и адаптации in vivo был проведен корреляционный анализ, который установил наличие тесной обратной корреляции между количеством устьиц на адаксиальной и абаксиальной эпидерме с долей связанной воды (r=-0,91 и -0,96). Также установлена положительная корреляция между толщиной листа и фракцией упорядоченной воды (r=0,80), положительная корреляция характерна для толщины мезофилла и содержанием связанной воды (r=0,73). Стоит отметить, что вегетативные органы регенерантов сортов Суевия и Дар Востока обладают наиболее изогидратными характеристиками: при изменяющихся условиях культивирования оводненность их тканей in vitro и in vivo более стабильна. При этом у сорта Ливадия установлена анизогидратная тенденция в регуляции параметров водного режима: при стабильно высокой оводненности доля связанной воды в процессе культивирования становится больше, что указывает на более высокий адаптационный потенциал водообмена регенерантов данного сорта.
На коллекционном участке НБС растения канны садовой находятся при соответствующем агротехническом уходе и постоянном поливе. Таким образом, во время вегетации возможно воздействие только атмосферной, а не почвенной засухи. В связи с этим листья отбирали во время максимального напряжения гидротермического стресса: в третьей декаде июля (среднесуточная температура воздуха только составила 23,5 °С, максимальная достигала 28,4 °С, минимальная относительная влажность воздуха - 46 %) и третьей декаде августа (23,8 и 27,4 °С, минимальная относительная влажность - 27 %). Общее содержание
воды в листьях канны садовойв период вегетации находилось в среднем в пределах от 82 до 93 %. Отмечено варьирование водного режима в зависимости от сорта. Максимальная оводненность тканей в течение периода вегетации отмечена у сорта Дар Востока, минимальная - у сорта Ливадия. Определение форм воды в динамике показало, что у всех сортов при нарастании стресса увеличивается доля связанной воды (до уровня 55-76 %, максимальные значения у сорта Ливадия). Водный дефицит в тканях листа был незначительный. Его величина составляла 3-8 % (максимальные значения характерны для сорта Суевия: 7-8 %).
Это также может быть связанно с наличием у листьев канны ex situ мощной кутикулы, развитой аэренхимы, плотного мезофилла с мелкими межклетниками (Палий и др., 2016).
Водоудерживающая способность тканей листьев изученных сортов высокая, - за 24 часа завядания водоотдача составила 36-41 % у сорта Суевия, у остальных сортов достигла 14-29 % от состояния полного насыщения. Существенная разница среди сортов была отмечена через 48 часов завядания, когда листья у сортов Суевия и Ливадия потеряли 38-54 %. Для сорта Дар Востока характерна водоотдача 29-38 %. Несмотря на низкую водоудерживающую способность при 48-часовом завядании листья сорта Ливадия проявляют значительную репарационную способность, на 72 % восстанавливая тургор при повторном насыщении.
Таким образом, благодаря исследованиям параметров водного режима листьев канны садовой во время культивирования в открытом грунте можно выделить сорта, обладающие более высокими способностями переносить атмосферную засуху: Дар Востока и Ливадия.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты экспериментов продемонстрировали особенности клонального микроразмножения канны садовой, на этапе собственно микроразмножения которого, кроме образования дополнительных микропобегов, также проходит множественное образование меристемоидов.
Определены оптимальные концентрации регуляторов роста: для адвентивного побегообразования - 1,27 мг/л ТДЗ (сорта Дар Востока и Суевия) и 1,91 мг/л (сорт Ливадия); для регенерации меристемодов и корнеобразования - 1,5 мг/л БАП и 1,5 ИУК.
Изучение показателей водного режима 3 сортов канны садовой позволили выявить, что минимальная устойчивость к гидротермическому стрессу характерна для сорта Суевия.
Исследования выполнены при поддержке гранта Российского научного фонда № 14-50-00079.
Список литературы
Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений и биотехнологии на их основе: учеб. пособие. - М.: ФРК -Пресс, 1999. - 160 с.
Кушниренко М.Д., Печерская С.Н. Физиология водообмена и засухоустойчивости растений. - Кишинёв: Штиинца, 1991. - 306 с.
Лищук А. И. Методика определения водоудерживающей способности к обезвоживанию листьев плодовых культур. Физиологические и биофизические методы в селекции плодовых культур: методические рекомендации. М.: ГНБС. - 1991. - С. 33-36.
Митрофанова И. В. Соматический эмбриогенез и органогенез как основа биотехнологии получения и сохранения многолетних садовых культур. - К.: Аграрна наука. - 2011. - 344 с.
Митрофанова О. В., Митрофанова И. В., Лесникова-Седошенко Н. П., Иванова Н. Н. Применение биотехнологических методов в оздоровлении растений и размножении безвирусного посадочного материала перспективных цветочно-декоративных культур // Сборник научных трудов ГНБС. - 2014. - Т. 138. - С. 5-56.
Палий А. Е., Митрофанова И. В., Браилко В. А., Гребенникова О. А., Зубкова Н. В., Челомбит С. В. Морфологические изменения и метаболические процессы, происходящие в вегетативных органах Canna х hybrida hort. ex Backer при поражении вирусными патогенами // Бюллетень ГНБС. - 2016. - Вып. 120. - С. 62-68.
Тевфик А. Ш. Регенерация растений канны садовой (Canna х hybrida hort.) в культуре вегетативных почек in vitro // Труды Никитского ботананического сада. - 2012. - Т. 134.- С. 426-435.
Тевфик А. Ш., Митрофанова И. В., Кузьмина Т. Н. Влияние регуляторов роста на регенерационную способность канны садовой (Canna х hybrida hort.) II Вестник Нижегородского университета им. Н. И. Лобачевского. - 2014а. - N 3(3). - С. 124-127.
Тевфик А. Ш., Митрофанова И. В., Кузьмина Т. Н. Особенности клонального микроразмножения канны садовой (Canna х hybrida hort.) // Biotechnologia Acta. - 20146. - Vol. 7, N 5. - С. 71-76.
Bhattacharya M., Sen A. Rapid in vitro multiplication of disease-free Zingiber officinale Rose. Indian Journal of Plant Physiology. - 2006. - Vol. 11, N 4. - Р. 379-384.
Chaves M. M., Flexas J., Pinheiro C. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Ann. Bot. - 2009. - Vol. 103. - P. 551-560. doi: 10.1093/aob/mcn125.
Flexas J., Bota J., Galmes J., Medrano H., Ribas-Carbô M. Keeping a positive carbon balance under adverse conditions: responses of photosynthesis and respiration to water stress. Physiol Plant. - 2006 - Vol. 127. - P. 343-352. doi: 10.1111/j.1399-3054.2006.00621.
Gloria B. A., Vieira M. L. C., Dornelas M. C. Anatomical studies of in vitro organogenesis induced in leaf-derived explants of passionfruit // Pesq. agropec. bras., Brasilia. - 1999. - Vol. 34, N 11. - Р. 2007-2013.
José M.C.S., Cernadas M.J., Corredoira E. Histology of the regeneration of Paulownia tomentosa (Paulowniaceae) by organogenesis // Rev. Biol. Trop. - 2014. - Vol. 62 (2). - P. 809-818.
Kyte L., Kleyn J., Scoggins H., Bridgen M. Plants from Test Tubes: An introduction of Micropropagation, 4th edn Portland, OR, US:Timber Press, 2013. - 274 p.
Mitrofanova I. V., Brailko V. A., Kuzmina T. N. Some histological and physiological features of meristemoid formation in Canna lily (Canna x hybrida hort.) //Acta Hort. - 2017a. - N 1167. - P. 63-68 doi: 10.17660 / Acta Hortic.2017.1167.9
Mitrofanova I., Brailko V., Lesnikova-Sedoshenko N., Mitrofanova O. Clonal micropropagation and some physiology aspects of essential oil roses valuable cultivars regeneration in vitro // Agriculture and Forestry (Poljoprivredaisumarstvo). - 2016. - Vol. 62, N 4. - P. 73-81 doi: 10.17707/Agricult Forest.62.4.09
Mitrofanova I. V., Tevfik A.Sh., Mitrofanova O. V, Brailko V. A., Lesnikova-Sedoshenko N. P. Features of Canna regeneration in vitro and plantlets adaptation in vivo // Acta Hort. - 2017b. - N 1155. - P. 447-454 doi: 10.17660/Acta Hortic.2017.1155.66
Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 15, N 3. - P. 473-497.
Saravitz C. H., Blazich F. A., Amerson H. V. Histology of in vitro adventitious bud development on cotyledons and hypocotyls of fraser fir // J. Amer. Soc. Hort. Sci. - 1993. - Vol. 118 (1). - P. 163-167.
Spasic S. Z., Mitrovic A. L. J., Janosevic D., Budimir S. Estimation of meristemoid complexity during Tacitus bellus in vitro shoot organogenesis by 2D fractal analysis // Botanica Serbica. - 2015. - Vol. 39 (2). - P. 137-142.
StatSoft, Inc. (2013). Электронное статистическое пособие. Талса, ОК: StatSoft. WEB: http: //www.statsoft.com/textbook/
Tevfik A. Sh., Mitrofanova I. V. Mitrofanova O. V, Lesnikova-Sedoshenko N. P., Brailko V. A. The biotechnology approaches of Canna (Canna x hybrida hort.) regenerants obtaining and its adaptation in vivo // Book of Abstracts 6th International ISHS symposium. Production and Establishment of Micropropagated Plants. (Sanremo, Italy, 19-24 April, 2015). - Sanremo: IRF, 2015. - P. 201.
Tevfik A. Sh., Brailko V. A. The peculiarities of Canna x hybrid hort. ex Backer water regime at different culture conditions // Ekosystemy. 2017. Iss. 11 (41). P. 53-59.
The main stages of garden canna clonal micropropagation: introduction in culture in vitro of vegetative buds, adventive shoot formation, meristemoids formation, microshoots and plantlets regeneration from meristemoids and following acclimatization in vivo are presented. Changes of the three canna cultivars (Suevia, Dar Vostoka and Livadia) water regime parameters depending on culture conditions (in vitro, in vivo, ex situ).
Key words: Canna lily, meristemoid, regeneration, water regime, in vitro, in vivo, ex situ.
Поступила в редакцию 30.10.2017
