CC BY
16
▲1
5щ
УДК: 614.24-002.2/.4-074
ОСОБЕННОСТИ СЫВОРОТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ РАСТВОРИМЫХ ФОРМ АИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫХ АНТИГЕНОВ СD8 И ИХ СВЯЗЬ С НАРУШЕНИЯМИ ЛЕГОЧНОЙ ВЕНТИЛЯЦИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ
Е.В. Макарова, С.С. Пластинина, Г.Н. Варварина, Н.А. Любавина,
ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия»,
ГБУЗ НО «Городская клиническая больница № 10 Канавинского района г. Нижнего Новгорода»
Макарова Екатерина Вадимовна - e-mail: [email protected]
Цель: изучить особенности взаимосвязей между сывороточным содержанием растворимых (soluble, s-) форм молекул CD8 и обструктивными нарушениями легочной вентиляции у больных хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ). Были обследованы 50 больных ХОБЛ. Всем больным проводилось общеклиническое обследование, спирометрия. Сывороточное содержание антигенов sCD8 изучали с помощью иммуноферментного метода, результаты сравнивали с образцами сыворотки 30 здоровых доноров. Было показано, что низкий уровень молекул sCD8 является фактором риска тяжелого течения ХОБЛ. Разработанная аналитическая модель взаимосвязи sCD8 и ОФВ1 может быть использована в широкой клинической практике с целью ориентировочной скрининговой оценки иммунного статуса пациента.
Ключевые слова: растворимые формы мембранных молекул, хроническая обструктивная
болезнь легких, бронхиальная обструкция.
Objective: to study the relationship between serum content of soluble (s-) forms of the CD8 molecules and obstructive disorders of pulmonary ventilation in patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). The study involved 50 patients with COPD. All the patients underwent physical examination, spirometry. The serum levels of sCD8 antigens were investigated using ELISA method; results were compared with serum samples of 30 healthy donors. It has been shown that low level of sCD8 molecules is a risk factor for severe COPD. An analytical model of the relationship between FEV1 and sCD8 can be used in clinical practice for the purposes of the screening assessment of the immune status of the patients.
Key words: soluble forms of membrane molecules, sCD8, chronic obstructive
pulmonary disease, bronchial obstruction.
Актуальность
В настоящее время хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) продолжает оставаться одной из ведущих проблем клинической медицины. Уже сегодня в мире насчитывается 210 миллионов пациентов с ХОБЛ, и эта цифра постоянно увеличивается. В настоящее время ХОБЛ -четвертая по распространенности причина смертности в мире. Если не уделить профилактике и лечению заболевания самое пристальное внимание, то, по прогнозам ВОЗ, к 2020 году ХОБЛ может занять третье место в этом печальном списке. Смертность среди больных ХОБЛ после выписки из стационара составляет 43% в течение одного года и 49% в течение двух лет. Таким образом, в настоящее время вопросы диагностики, прогнозирования и лечения ХОБЛ являются одними из наиболее актуальных.
Практически все клеточные элементы респираторной системы под влиянием этиологических факторов активируются и участвуют в воспалительной реакции, но основная роль принадлежит нейтрофилам. Нейтрофилы, проникая в межклеточное пространство, наряду с выделением ряда провоспалительных медиаторов, обладающих хемо-таксическим действием, выделяют протеазы и кислородные радикалы, обладающие мощным деструктивным потенциалом, действующим практически на все молеку-
лярные компоненты тканей: липиды, белки, нуклеиновые кислоты [1]. Гистопатологические исследования показывают увеличение содержания Т-лимфоцитов, особенно клеток CD8 (цитотоксических) во всех отделах легких. И хотя их роль в формировании воспаления при ХОБЛ полностью не установлена, имеются данные о том, CD8 клетки могут быть ответственными за выделение перфорина, гранзима-В и ФНО-а, которые вызывают цитолиз и апоп-тоз клеток альвеолярного эпителия, что способствует пер-систенции воспаления [1]. Известным является тот факт, что антиген CD8 - дифференцировочный маркер цитотоксических лимфоцитов - может существовать не только в связанной с мембраной, но и в растворимой (soluble, s-) форме, что делает возможным изучение его содержания в периферической крови.
Таким образом, в настоящее время изучение роли молекулярных биомаркеров и их взаимосвязей с клиническими особенностями ХОБЛ является актуальной и малоизученной проблемой.
Цель исследования: изучить особенности взаимосвязей между сывороточным содержанием растворимых (soluble, s-) форм молекул CD8 и обструктивными нарушениями легочной вентиляции у больных хронической обструктивной болезнью легких.
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
Материал и методы
Исследование проведено на базе кафедры пропедевтики внутренних болезней Нижегородской государственной медицинской академии и пульмонологического отделения городской клинической больницы № 10 Нижнего Новгорода; получено одобрение Локального этического комитета ГБУЗ НО «Городская клиническая больница № 10». В исследование включались пациенты с ХОБЛ, бывшие или настоящие курильщики, давшие информированное согласие. Не включались пациенты с бронхиальной астмой и другими заболеваниями нижних дыхательных путей (пневмония, интерсти-циальные заболевания легких, тромбоэмболия легочной артерии и т. д.), тяжелыми декомпенсированными заболеваниями внутренних органов и другими состояниями, которые могли влиять на результаты исследования.
Диагноз ХОБЛ был установлен на основании анамнеза и данных спирометрии в соответствии с критериями «Глобальной стратегии диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких» (GOLD) [1, 2].
В исследование были включены 50 больных ХОБЛ в стадии обострения в возрасте от 40 до 79 лет (средний возраст 60±10 года), из них 36 мужчин (72%) и 14 женщин (28%). Продолжительность заболевания у обследованных пациентов составила от 4 до 40 лет (15 [7; 20]), анамнез курения составил от 10 до 66 лет. Двадцать два пациента имели степень тяжести бронхообструктивных нарушений GOLD II и 28 пациентов - GOLD III.
При обследовании пациентов был использован комплекс клинико-функциональных, лабораторных и инструментальных методов. У пациентов уточнялась частота обострений болезни за предшествующие 12 месяцев. Выраженность одышки оценивалась с использованием модифицированного вопросника Британского медицинского исследовательского совета (Modified British Médical Research Council (mMRC) questionnaire).
Для исследования сывороточного уровня растворимых дифференцировочных молекул CD8 проводился забор крови из локтевой вены (утром натощак). Определение уровня растворимых молекул CD8 проводили иммунофер-ментным методом с использованием поликлональных антител, специфичных к мембранным антигенам монону-клеарных клеток крови человека, и моноклональных антител ИКО-31. Концентрацию растворимых форм мембранных антигенов определяли с помощью прибора для имму-ноферментного анализа СТАТ-ФАКС-2100 с длиной волны 450 и 630 нм, полученные данные выражали в условных единицах (U/ml). При оценке уровня растворимых молекул CD8 образцы сыворотки крови больных сопоставлялись с результатами обследования контрольной группы, в которую вошли 30 здоровых некурящих доноров (контрольная группа, лица без ХОБЛ), сопоставимых по полу и возрасту.
Исследование функции внешнего дыхания проводилось с использованием пневмотахометрического датчика, регистрирующего объемную скорость потока воздуха. Последующий автоматический компьютерный анализ инспи-раторной и экспираторной части петли поток-объем производился с использованием аппарата «Flow screen» (фирма «JAEGER», Германия). Оценивались постбронходилатацион-ные параметры: объем форсированного выдоха за 1 секунду
(ОФВ1), форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ), максимальная объемная скорость выдоха на уровне 25%, 50% и 75% ФЖЕЛ (МОС25, МОС50 и МОС75), отражающая проходимость на уровне крупных, средних и мелких бронхов. Расчёт должных величин производился автоматически с учетом пола, возраста, роста и веса пациента.
Статистический анализ производился с помощью программы STATISTICA 6.0. Характер распределения данных оценивался критериями Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилкса. В случае если распределение признака принималось приближенно нормальным, результаты представлялись в виде М±т, где М - среднее, m - среднеква-дратическое отклонение, для анализа использовались параметрические критерии. При распределении результатов отличном от нормального данные представлялись в виде медианы и 25- и 75-перцентилей (Me [25p; 75p]), анализ проводился с помощью методов непараметрической статистики. Анализ корреляционных взаимоотношений между исследуемыми показателями осуществлялся с помощью критерия Спирмена с обязательным визуальным контролем диаграмм рассеяния и исключением выбросов. При сравнении частот был использован критерий кси-квадрат (х2). Для оценки аналитической зависимости признаков (модели) использовался метод простого регрессионного анализа. За уровень статистической значимости принималась величина р<0,05 [3].
Результаты и их обсуждение
На первом этапе было проанализировано содержание растворимых форм дифференцировочных молекул CD8 в зависимости от степени тяжести ХОБЛ. Спирометрическая характеристика обследованных больных ХОБЛ и концентрации растворимых дифференцировочных антигенов CD8 в сыворотке крови представлены в таблице 1. Несмотря на достоверные различия спирометрических показателей, средние концентрации тестируемых молекул у пациентов среднетяжелой и тяжелой ХОБЛ между собой существенно не различались. Однако, у больных с тяжелой формой болезни уровень sCD8 был достоверно ниже (р=0,01) при сравнении со значениями доноров, в то время как при GOLD II отмечалась лишь тенденция к снижению по сравнению с контрольной группой (р=0,07).
В ходе дальнейшего анализа полученных данных все обследованные пациенты ХОБЛ были разделены на две подгруппы в зависимости от уровня растворимых молекул sCD8. Пациенты 1-й подгруппы (20 больных) имели нормальные или повышенные значения растворимых молекул sCD8. Во 2-й подгруппе (30 больных) содержание молекул было снижено как по сравнению с донорскими значениями, так по сравнению с пациентами 1-й подгруппы (таблица 2). При этом были обнаружены и различия клинических характеристик пациентов в подгруппах. В подгруппе 2 выраженная одышка (3-4 балла по mMRC) отмечалась практически у всех обследованных больных, т. е. достоверно чаще, чем в подгруппе 1. Также и частота обострений за предшествующие 12 месяцев у пациентов с низкими значениями sCD8 оказалась выше, чем в подгруппе с нормальным или высоким уровнем антигена sCD8. Таким образом, была выявлена зависимость между содержанием растворимых молекул sCD8 и тяжестью течения болезни.
▲1
SSM
ТАБЛИЦА 1.
Спирометрические показатели и сывороточное содержание растворимых молекул sCD8 у больных ХОБЛ разной степени тяжести. M±m, Me [25p; 75p]
Примечания: * р<0,05 в сравнении со здоровыми донорами. ФВД - функция внешнего дыхания, ОФВ1 - объем форсированного выдоха за 1 сек., ФЖЕЛ - форсированная жизненная емкость легких, МОС 25 - максимальная объемная скорость при выдохе 25% ЖЕЛ (л/с), МОС 50 - максимальная объемная скорость при выдохе 50% ЖЕЛ(л/с), МОС 75 - максимальная объемная скорость при выдохе 50% ЖЕЛ (л/с).
ТАБЛИЦА 2.
Клинические показатели и содержание растворимых дифференцировочных молекул sCD8 в сыворотке больных ХОБЛ (1-я и 2-я подгруппы)
Сниженный уровень растворимых антигенов sCD8 у больных ХОБЛ 2-й подгруппы, скорее всего, указывает на уменьшение мембранной экспрессии этих молекул и угнетение цитотоксического звена иммунитета. Наблюдавшееся более высокое сывороточное содержание sCD8 молекул в подгруппе 1 позволяет сделать предположение об активации цитотоксического пула клеток, а также иммунных механизмов супрессии у пациентов со среднетяжелым течением заболевания.
Кроме того, с нарастанием тяжести бронхиальной обструкции и снижением ОФВ1 отмечалось прогрессивное уменьшение содержания антигена бСОБ, на что указывала выявленная положительная корреляционная связь между этими показателями (г=0,57 р=0,03). Полученные нами данные согласуются с данными других исследователей, подтверждающих наличие тесной взаимосвязи между содержанием в сыворотке крови бСЭБ и значением ОФВ1 [4]. Известно, что растворимый антиген бСЭБ продуцируется активированными цитотоксическими Т-клетками и служит маркером их активации. С одной стороны, способность растворимого антигена СЭ8 связываться с мембранными и
растворимыми молекулами НЬД-1 определяет его иммуно-модулирующие функции [5, 6]. С другой стороны, взаимодействие бСЭ8 со своим лигандом Н1_Д-1 препятствует активации и пролиферации цитотоксических клеток. Таким образом, при тяжелом прогрессирующем течении ХОБЛ угнетаются процессы цитолиза клеток и нарушаются механизмы сдерживания избыточного иммунного ответа.
Наряду с этим высокое содержание бСЭ8 у пациентов 1-й подгруппы (при более ранних стадиях заболевания) может свидетельствовать об активации пула цитотоксиче-ских СЭ8+ клеток. Повышение количества СЭ8+ лимфоцитов считают биологическим маркером ХОБЛ [7], причем СЭ8+ клетки при ХОБЛ активированы абнормально и могут продуцировать провоспалительные медиаторы смешанного профиля Т-хелперов I и II порядка [8].
Учитывая вышеизложенное, факт тесной взаимосвязи бронхиальной обструкции и сывороточного содержания бСЭ8 позволил предположить наличие аналитической связи между данными показателями. На основании простого линейного регрессионного анализа (программа Statistica 6.0) нами был установлен не только факт взаимосвязи ОФВ1 и sCD8, но и выявлена аналитическая зависимость между ОФВ1 и уровнем sCD8. Аналитическое уравнение было представлено в виде: sСD8= а+Ь*ОФВ1(в % от должных величин), где sСD8 - концентрация растворимой молекулы СD8 в сыворотке крови;
а - константа, отражающая степень отклонения линии регрессии от начала координат (стандартная ошибка = 39,18, р=0,00001);
Ь - нестандартизованный коэффицент Ь (стандартная ошибка = 0,54, р=0,001), являющийся мерой связи между анализируемыми признаками и показывающий степень варьирования между средними значениями зависимого признака (sCD8) с каждой единицей независимого признака (ОФВ1);
ОФВ1 - объем форсированного выдоха за 1 сек (% от должных величин) а=231,94, Ь=2,0012, sCD8=231,94+2,0012xОФВ1 (%).
Стандартная ошибка оценки модели была равна 64,49 при р=0,002, что свидетельствовало об адекватности данной аналитической модели.
Полученная нами аналитическая модель взаимосвязи двух признаков позволяет на практике с учетом значения ОФВ1 предполагать возможный уровень содержания молекул sCD8, сниженный уровень которых свидетельствует о нарастании тяжести и прогрессировании ХОБЛ. При этом во многих случаях отпадает необходимость исследования данного параметра, что затруднено у пациентов в широкой клинической практике. Однако данное уравнение не отражает все патогенетические компоненты, влияющие на уровень иммунных молекул, а позволяет лишь по одному независимому признаку (ОФВ1) ориентировочно оценить значение другого зависимого признака (sCD8). Применение данной формулы также облегчает проведение контрольного исследования значения sCD8 на фоне лечения, проведя только лишь повторное исследование ФВД, что позволяет также контролировать эффективность иммуномодулирую-щей терапии.
Показатели Доноры Больные ХОБЛ р GOLD II -GOLD III
GOLD II (n=22) GOLD III (n=28)
Показатели ФВД, % от должного
ОФВ1 - 66+13 41[37;48] 0,001
ФЖЕЛ - 79+25 62+16 0,01
МОС25 - 47+ 24 18[16;31] 0,001
М0С50 - 42+22 16[11;25] 0,003
МОС75 - 46±23 12±7 <0,001
Содержание растворимых молекул, U/ml
sCD8 376[351;386] 342[261;433] 326[314;394]* 0,56
а с а с I а а с с
Ä Ä >
Показатель ■Q EX 4
О н о к II = rn ES Ii EI EI Et Et
Д CJ *—■ CL rH
Клинические показатели
Одышка > 2 баллов (mMRC), % больных - 66 93 0,015
Число обострений в год, М±т - 1,3±0,5 2,3±0,7 <0,001
Содержание растворимых молекул
sCD8, U/ml, Me[25p;75p] 376 [351;386] 405 [383;452] 300 [257;327]* 0,01
Примечание: * р<0,05 в сравнении со здоровыми донорами.
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
SCD8=231,9498+2,0012*х
0ФВ1 , % от должной величины
РИС.
Регрессионная зависимость между ОФВ1 и сывороточным уровнем молекул sCD8 у больных ХОБЛ. Ось абсцисс: ОФВ1 - объем форсированного выдоха за 1 сек (% от должных величин), ось ординат: значение sCD8 (U/ml).
Клинический пример: в пульмонологическое отделение направлен больной Т., 68 лет. Диагноз при поступлении: Хроническая обструктивная болезнь легких III степени тяжести, смешанный фенотип, группа D, в фазе обострения, дыхательная недостаточность III ст. Ишемическая болезнь сердца:стабильная стенокардия НКФК, НК I. Гипертоническая болезнь III стадии, степень артериальной гипертензии 2, риск 4. При поступлении жалобы на одышку при незначительной нагрузке и в покое, кашель с трудно отделяемой мокротой желто-зеленого цвета, повышение температуры до 380С. Из анамнеза известно, что болеет хроническим бронхитом около 30 лет. Индекс курения 40 пачек/лет. Стационарное лечение по поводу обострений 2 раза в год.
Амбулаторно получает «Серетид» 250/25 мкг в 1 вдохе -2 инг. 2 раза в сутки, «Спирива» 18 мкг 1 инг. сутки, «Беродуал» - по потребности, теопек 300 мг 2 раза в сутки, верапамил в дозе 80 мг 3 раза в сутки. Ухудшение состояния около 10 дней, в связи с неэффективностью амбулаторного лечения направлен в стационар. Объективно: состояние больного средней степени тяжести, правильного телосложения, повышенного питания, цианоз губ, лица, бочкообразная грудная клетка, перкуторный звук коробочный, в легких по всем полям большое количество сухих хрипов, ЧД 25 в мин. Тоны сердца приглушенные, ритмичные ЧСС -98 уд. в мин, АД 150/90 мм рт. ст. Живот мягкий, безболезненный. Отеков нет.
Общеклинические анализы крови и мочи, биохимический анализ крови - без особенностей.
Микроскопический анализ мокроты - лейкоциты 25-60 в поле зрения. При микробиологическом анализе мокроты выделены 2 культуры микроорганизмов: М. catharralis 3х102 КОЕ/мл, Н. influenzae 2х106 КОЕ/мл.
На рентгенограмме органов грудной клетки без очаговых и инфильтративных изменений.
ЭКГ: отклонение ЭОС влево, синусовая тахикардия 96 уд. в мин, очаговая блокада ПНПГ, нарушение процессов репо-ляризации миокарда. При исследовании ФВД: ЖЕЛ - 55,2%
от должного, ФЖЕЛ - 77,3% от должного, ОФВ1 - 37,6% от должного.
С учетом данных ФВД с целью оценки иммунного статуса по предложенной формуле проведен расчет показателя sCD8=231,94+2,0012x37,6. Расчетное значение sCD8=307,19 (U/ml) (существенно ниже, чем в донорской группе), при лабораторном исследовании значение составило 310,5, что свидетельствовало об истощении пула цитотоксических клеток, прогрессирующем неблагоприятном течении ХОБЛ, необходимости включения иммуномо-дулирующей терапии.
На фоне проведенного комплексного лечения отмечалась положительная динамика, уменьшилась одышка, кашель, количество отделяемой мокроты, нормализовалась температура. Объективно: в легких сухие рассеянные хрипы по всем легочным полям ЧД 20 в мин. ЧСС - 90 уд. в мин, АД - 140/90 мм рт. ст. При контрольном исследовании ОФВ1 увеличился до 48% от должного, также наблюдалось увеличение sCD8=327 U/ml.
Выводы
1. У пациентов с тяжелым течением ХОБЛ выявлено снижение содержания sCD8, что свидетельствовало об истощении цитотоксического звена иммунитета. Обнаружены тесные корреляционные связи между содержанием sCD8 и показателями бронхиальной обструкции. Снижение содержания sCD8 является фактором риска тяжелого течения ХОБЛ.
2. Возможно использование аналитической модели взаимосвязи sCD8 и ОФВ1 в широкой клинической практике с целью скрининговой оценки иммунного статуса пациента для последующей коррекции терапии. jp
ЛИТЕРАТУРА
1. Global Strategy for Diagnosis, Management, and Prevention of COPD (Updated 2015). http://www.goldcopd.com (10 Oct 2015).
2. Чучалин А.Г., Авдеев С.Н., Айсанов З.Р. и др. Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению хронической обструктивной болезни легких. Пульмонология. 2014. № 3. С. 15-54.
Chuchalin A.G., Avdeev S.N., Aysanov Z.R. i dr. Federal'nye klinicheskie rekomendacii po diagnostike i lecheniyu khronicheskoy obstruktivnoy bolezni legkikh. Pul'monologiya. 2014. № 3. S. 15-54.
3. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. МедиаСфера. 2006. 312 с.
Rebrova O.Yu. Statisticheskiy analiz medicinskikh dannykh. Primenenie paketa prikladnykh programm STATISTICA. MediaSfera. 2006.312 s.
4. Пазыч С.А. Маркеры активации и гибель клеток индуцированной мокроты при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Владивосток, 2005.
Pazych S.A. Markery aktivacii i gibel' kletok inducirovannoy mokroty pri bronkhial'noy astme i khronicheskoy obstruktivnoy bolezni legkikh: Avtoref. dis.... kand. med. nauk. Vladivostok, 2005.
5. Ghio M., Contini P., Ubezio G., et al. Blood transfusions with high levels of contaminating soluble HLA-I correlate with levels of soluble CD8 in recipients' plasma; a new control factor in soluble HLA-I-mediated transfusion-modulated immunomodulation? Blood Transfus. 2014. Jan. 12. Suppl 1. Р. 105-108.
6. Бойчук С.В. Механизмы дексаметазон-индуцированного апоптоза лимфоцитов при атопической бронхиальной астме. Пульмонология. 2003. № 2. С. 10-16.
Boychuk S.V. Mekhanizmy deksametazon-inducirovannogo apoptoza limfocitov pri atopicheskoy bronkhial'noy astme. Pul'monologiya. 2003. № 2. S.10-16.
7. Maestrelli P., Saetta M., Mapp C.E. et al. Remodeling in response to infection and injury. Airway inflammation and hypersecretion of mucus in smoking subjects with chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 2001. Nov. 15. № 64 (10 Pt 2). Р. 76-80.
8. Zhu X., Gadgil A.S., Givelber R. Peripheral et al. T- cell functions correlate with the severity of chronic obstructive pulmonary disease. J Immunol. 2009. № 182 (5). Р. 3270-3277.
