Особенности становления иммунной системы у детей с врожденным пороком сердца Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.12-007.1-053.1-053.2]-07:612.017.1

В.А.Четвертных, Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Н.П. Логинова, Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Д.Ю. Шилов, Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера А.П. Годовалов, Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера О.В. Лебединская, Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Е.В. Сайдакова, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Проведен комплексный динамический анализ основных компонентов иммунной системы у детей с врожденными пороками сердца (ВПС) разной степени сложности с использованием современных иммунологических, иммунохи-мических, гистологических, гистохимических, цитохимических и электронно-микроскопических методов исследований. Установлено, что у детей с ВПС к моменту рождения имеется значительная функциональная незрелость первичного органа иммунитета - тимуса, особенно при сложных пороках сердца. Данный факт отражается на пролиферации и дифференцировке тимоцитов как in vivo, так и in vitro. Вследствие этого уже с рождения в крови больных детей снижен уровень наивных Т-лимфоцитов. После перенесенной тимэктомии в течение 3 лет растет апоптоз циркулирующих лимфоцитов (CD4+, CD8+), снижаются и фагоцитарные свойства клеток врожденного иммунитета. Полученные результаты отражают несостоятельность системы иммунитета у детей с врожденными пороками сердца.

Ключевые слова: врожденный порок сердца, дети, тимус, иммунитет.

Врожденные пороки сердца (ВПС) являются одной из самых распространенных аномалий у детей. Частота ВПС составляет до 30 % от всех пороков развития [1, 2, 6, 10]. По результатам официальных статистических данных, ежегодно в России регистрируется более 20 тыс. случаев врожденных пороков сердца разной степени сложности у детей, из них 75 % нуждаются в оперативной коррекции порока. Дети с ВПС подвержены раз-

личным заболеваниям вследствие имеющегося у них иммунного дисбаланса [3, 7, 11, 14]. Как правило, в послеоперационном периоде основная задача врача кардиолога и педиатра направлена на адаптацию сердечно-сосудистой системы ребенка. Оценка же иммунной системы этой категории больных в динамике не проводится.

Известно, что судьбу иммунной системы в детском возрасте определяет состоя-

* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 11-04-96023-p_урал_а).

ние первичного органа иммунитета - тимуса. Нарушение его структуры и функции при различных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы может являться причиной развития акциден-тальной инволюции органа, определяя дефектное состояние иммунной системы в целом [4, 5, 8]. Нами были изучены особенности раннего постнатального состояния тканей тимуса у детей с врожденными пороками сердца. В послеоперационном периоде в динамике 3 лет определен иммунный статус данной категории детей.

Цель работы - изучить особенности морфофункционального состояния иммунной системы у детей с врожденными пороками сердца в до- и послеоперационном периодах их жизни.

Материалы и методы. Для осуществления поставленной задачи впервые был проведен комплексный динамический анализ основных компонентов иммунной системы с использованием современных иммунологических, иммунохимических, гистологических, гистохимических, цитохимических и ультрамикроскопических методов исследований.

Исследовано 70 образцов тимуса от детей в возрасте до 1 года. Тимэктомия проводилась в соответствии с существующей хирургической практикой Федерального краевого центра сердечно-сосудистой хирургии г. Перми. В зависимости от степени тяжести сердечного порока дети поделены на 2 группы: с сильными (синими) пороками (п=33) - тетрада Фалло, транспозиция магистральных сосудов, аномалия Эбштейна, и слабыми (белыми) пороками (п=38) - дефектами межжелудочковой и межпредсердной перегородок.

На до- и послеоперационном этапе у детей (п=75) обследована кровь. Сформировано 5 групп по 15 человек в каждой:

1-я - группа сравнения (здоровые дети);

2-я - кровь у детей с ВПС до тимэктомии (перед операцией); 3-я - кровь у детей через 1 год после тимэктомии; 4-я - кровь у детей через 2 года после тимэктомии; 5-я - кровь у детей через 3 года после ти-мэктомии.

Оценка морфофункционального состояния тимуса проводилась с помощью гистологических методов. Образцы материала фиксировали в 10 %-ном нейтральном формалине на фосфатном буфере (рН 7,2). Срезы окрашивали гематоксилином-эозином; на выявление соединительнотканных элементов - по ван Гизону; на тучные клетки - по Шубичу; ретикулярные волокна - по Футу.

Иммуногистохимическими методами состояние лимфоидных и нелимфоидных компонентов тимуса оценивали, используя моноклональные антитела: CD3, CD4, CD8, CD68, CD31-PECAM-1, CD34, Ki-67, Bcl-2, коллаген IV, виментин, PanCitokeratin (Pan-CK AbsAE1/AE3), ци-токератин 5/14, цитокератин 8/18 (производство «Daco», США). Визуализацию результатов проводили с использованием системы детекции «Ultra Vision ONE Detection System HRP Polymer». Инкубировали с хромогеном DAV Plus Substrate System. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в БиоМаунт-среду. Для оценки качества реакции использовали стекла с позитивным контролем для каждого из антигенов (фирма «Labvision», США).

Для получения полутонких срезов кусочки тимуса размером 1-2 мм3 фиксировали в 10 % растворе глютарового альдегида и 1 % растворе OsO4, дегидратировали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заключали в аралдитовые смолы. Готовили полутонкие срезы толщиной 1 мкм, окрашивали толуидиновым синим.

Съемку препаратов проводили на мор-фометрической установке «Olympus» с последующим анализом полученных изображений в программе IMAG PRO+ (free version).

Функциональные свойства тимоцитов изучали путем оценки пролиферативной активности клеток (in vitro). В качестве Т-клеточного митогена использовали конканавалин А (КонА) (Concanavalin A from Canavalin ensiformis, Sigma, США) в концентрациях 40, 20, 10, 5 и 2,5 мкг/мл.

Бластогенез Т-лимфоцитов оценивали по включению метки Н3-тимидин.

Для определения изменения пролифе-ративного ответа лимфоцитов в культуры вносили insulin-like growth factor-I (Sigma, США) в концентрациях 10-7, 10-8, 10-9 М, somatotropin (Sigma, США) в концентрациях 10-8, 10-9, 10-10 М. Все исследования сопровождались постановкой контролей: 1) пробы без гормональных препаратов и митогенов; 2) пробы только с внесением митогенов.

Для оценки поликлональной тимусза-висимой продукции цитокинов культивирование тимоцитов с КонА 5 мкг/мл осуществляли в аналогичных условиях в течение 72 ч. Исследование концентрации цитокинов в супернатантах культур проводили методом твердофазного иммуно-ферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем согласно инструкции производителя («Интерферон гамма», Вектор-Бест, Новосибирск; «Ин-терлейкин 4», Вектор-Бест, Новосибирск; «Интерлейкин 10», Вектор-Бест, Новосибирск; «Интерлейкин 17», Вектор-Бест, Новосибирск).

Исследование ДНК проводили в цельной крови в объеме 1 мл с использованием набора реагентов «KR-012» фирмы «OMNIX» (Россия) согласно инструкции производителя. Общую концентрацию ДНК и степень ее контаминации белком определяли спектрофотометрически на длинах волн 260 и 280 нм (UVmini 1240 «Shimadzu», Япония). Расчет осуществляли на основе соответствующих коэффициентов экстинкции общепринятым методом [13].

С целью стандартизации метода получен калибровочный образец ДНК (концентрация 275 мкг/мл, соотношение показателей светопоглощения на длинах волн 260 и 280 нм - 1,91). Калибратор являлся смесью ДНК, полученной от 7 добровольных доноров разного пола в возрасте от 2 до 4 лет.

Для расчета количества TREC применяли математический метод 2"AACt [12]. В качестве референса [9] использована ге-

номная последовательность ß-актина (набор 401846 - ß-actin control reagents, «Applied Biosystems», США). Амплификация целевого и референсного генов проводилась раздельно.

Реакцию осуществляли на термоцик-лере CFX-96 (Bio-Rad, США) по программе: 95 °С - 180 с (1 цикл); 61 °С - 20 с, 70 °С - 10 с, 95 °С - 15 с (50 циклов). Уровнь флуоресценции измеряли при температуре 70 °С в каждом цикле амплификации.

Использовали прямой праймер TCR2: 5'-CACATCCCTTTCAACCATGCT; обратный праймер TCR2:

3'-GCCAGCTGCAGGGTTTAGG; флуоресцентный зонд TCR2: FAM-ACACCTCTGGTTTTTGTAAAGGT GCCCACT-BHQ1.

Выделение мононуклеаров из периферической крови производили путем центрифугирования в градиенте плотности диаколла («Диа-М»). Выделенные клетки собирали, дважды отмывали средой RPMI-1640, подсчитывали в камере Го-ряева.

Спонтанный апоптоз лимфоцитов исследовали, используя набор «Annexin V-FITC/7-AAD» (IM3614, «Beckman Coulter Company», США), согласно инструкции производителя. Субпопуляционное разделение апоптотических клеток выполняли с помощью коммерческих антител к поверхностным антигенам CD4+ и CD8+, конъюгированных с фикоэритрином («Beckman Coulter Company», США). Про-точно-цитофлюориметрический анализ проводили на приборе FACSCalibur («Bec-ton Dickinson», США) с использованием коммерческого пакета программ сбора и анализа данных CellQuestPro. Наличие спонтанного апоптоза лимфоцитов определяли путем вычитания из общего количества CD4+ (CD8+) клеток в гейте лимфоцитов числа 7-AAD+ CD4+ (CD8+) клеток и количества Annexin V- CD4+ (CD8+) клеток. Исследование фагоцитоза нейтрофи-лов и моноцитов проводили с использованием S. aureus штамма Cowan I. Обезвреженный формалином стафилококк

(«Пермское НПО «Биомед») трехкратно отмывали 0,15М NaCl, центрифугировали при 1500 g в течение 20 мин и окрашивали флюоресцеина изотиоцианатом (FITC; Sigma, США) по общепринятой методике. Концентрацию стафилококка определяли фотометрически при 600 нм относительно стандартов мутности. Поглотительную активность лейкоцитов изучали в цельной крови. Оценку поглощения FITC-меченого стафилококка проводили по общепринятой методике на проточном цитофлюори-метре BD FACSCalibur (Becton Dickinson, США). По полученным результатам рассчитывали следующие показатели: 1) фагоцитарный индекс (ФИ) - процент клеток, поглотивших стафилококки; 2) фагоцитарное число (ФЧ) - отношение средней интенсивности флюоресценции одного поглотившего стафилококки фагоцита к средней интенсивности флюоресценции FITC-меченой бактериальной клетки; 3) интегральный показатель поглощения (ИПП) - число бактерий, поглощенных 100 нейтрофилами (ИПП=ФЧФИ).

Полученные данные подвергали статистической обработке в программе Sta-tistica 7.0.

Результаты. В норме тимус, как первичный орган иммуногенеза, создает оп-

тимальные условия для качественного созревания Т-лимфоцитов. У детей с ВПС установлено, что морфологические изменения в органе зависели от степени тяжести сердечного порока. При сложных пороках в органе имелись значительные расстройства кровообращения, сопровождающиеся расширением и переполнением сосудов кровью, с мелкоочаговыми кровоизлияниями в ткани, а также одиночно или расположенные группами тучные клетки. В этих местах был резче выражен отек стромы и соединительнотканных структур. В междольковой соединительной ткани избыточно развивалась жировая ткань, представленная крупными и мелкими скоплениями vimentin-позитив-ных адипоцитов. На полутонких срезах имелись признаки дистрофических изменений клеток стромы с нарушением их связи с лимфоцитами («зоны отчуждения»), что приводит к гнездному опустошению коры долек (рис. 1).

На этом фоне активизировались клетки фибробластического дифферона с положительной экспрессией к CD34+ и виментину, характерных для прогениторных клеток мезенхимального происхождения и нередко сопровождающихся в таких участках активным неоваскулогенезом (рис. 2).

Рис. 1. Дистрофические изменения тимусных эпителиальных клеток в коре дольки. Полутонкий срез, окр. толуидиновым синим. *900

Рис. 2. Экспрессия CD34+ в клетках фибробластического дифферона. Неоваскулогенез. *600

У детей со слабыми пороками в тимусе наблюдали аналогичные морфологические изменения, но выраженные в меньшей степени.

Структурные изменения тимуса проходили при параллельной устойчивости лимфоцитов к апоптозу, что влияло на их пролиферативные свойства. Подтверждением этому служила активность генов Ьс1-2 в клетках коркового вещества долек тимуса. У детей с сильными ВПС экспрессия Ьс1-2 в цитоплазме клеток увеличивалась по направлению от субкапсу-лярной к кортикомедуллярной зоне. В субкапсулярной зоне у них доля Ьс1-2-по-зитивных лимфоцитов составляла 32,2±6,1 %, у детей со слабыми пороками - 41±3,8 %. В кортикальной части дольки в участках нахождения дубль-позитивных лимфоцитов (CD4+ CD8+) экспрессия Ьс1-2 определялась в диффузно расположенных лимфоцитах и у детей с сильными пороками она была в 2 раза была выше (18,6±2,9 %), чем у детей со слабыми пороками (9,8±3,0 %). От мозгового вещества в сторону коры (чего никогда не имеется в норме) формировались крупные скопления Ьс1-2 позитивных лимфоцитов. При окрашивании срезов по Футу в кортикомедуллярной зоне наблюдали

нарушение структуры гематотимического барьера (рис. 3), что и способствовало миграции лимфоцитов из мозговой части дольки в корковое вещество.

Для верификации в тимусе стромаль-ного компонента использовали РапСК, включающий в себя широкий спектр ци-токератинов, специфически реагирующих с нейтральными и кислыми кератинами эпителиальных клеток. В результате положительная экспрессия РапСК позволила идентифицировать весь эпителиальный компонент в тимусе. В корковом и мозговом веществе долек РапСК в эпителиальных клетках выявлялся с разной интенсивностью. Ярко накапливался в клетках, прилежащих к базальной мембране дольки тимуса. Клетки имели крупное светлое ядро, занимающее большую часть цитоплазмы. Отростки этих клеток формировали контакты друг с другом на всем протяжении базальной мембраны, формируя ровный непрерывный пласт, продолжающийся в междольковые прослойки. Экспрессия РапСК в субкапсу-лярной и в основной части коры дольки отличалась и зависела от степени выраженности сердечного порока. В субкапсу-лярной зоне при слабо выраженных сердечных пороках РапСК накапливался рав-

Рис. 3. Фрагменты сети ретикулярных волокон в кортикомедулярной зоне. Окр. по Футу. *400

номерно. В большинстве долек эпителиальные клетки, соединяясь отростками, формировали подобие сети (кластеры), контактируя с лимфоцитами на этапе их развития (рис. 4).

В пределах коркового вещества доля кластеров составила 44,66±2,29 %. Кластеры состояли из 325,34±35,39 объектов,

представленных тимусными эпителиальными клетками (ТЭК), экспрессирующи-ми PanCK. В кортикальной зоне ТЭК не везде формировали кластеры. В части долек сеть местами была нарушена, клетки теряли контакт друг с другом, что приводило к формированию изолированных скоплений ТЭК (52,33±4,08 %). В полу-

Рис. 4. Экспрессия РапСК в группе со слабыми пороками

тонких срезах эпителиальные клетки имели умеренные признаки дистрофических изменений, приводящие к потерям межклеточной связи и, как следствие, формированию зон клеточной дезорганизации. В глубокой коре, вблизи к кортикомеду-лярной границе, экспрессия РапСК вновь интенсивно регистрировалась в отростча-тых клетках, формирующих несколько слоев эпителиального ретикулума.

При сложных сердечных пороках положительная экспрессия РапСК верифицировалась преимущественно на уровне базаль-ной мембраны и субкапсулярной части коры дольки тимуса. В основной части коры дольки экспрессия РапСК была резко снижена, выявлялась эпизодически, фрагментарно или вообще отсутствовала (рис. 5).

Количество кластеров достоверно снижалось по отношению к группе детей со слабыми пороками, составило 22,00±2,25 % (р=0,001). Кластеры были представлены меньшим количеством объектов -195,81±18,35 (р=0,005), но доля одиночно расположенных эпителиальных клеток была больше (64,33±3,79 %, р=0,02), чем в группе со слабым развитием пороков.

Состояние стромы влияло на процессы пролиферации и дифференцировки ти-моцитов. В связи с этим проведена оцен-

Рис. 5. Экспрессия PanCK в группе с сильными пороками

ка их пролиферативной активности in vivo и in vitro.

При изучении пролиферативной способности клеток in vivo положительная экспрессия Ki-67 в срезах выявлялась в диффузно расположенных лимфоцитах в пределах всей дольки тимуса.

При сравнении двух групп детей доля тимоцитов, экспрессирущих Ki-67, статистически в обеих группах не отличалась и была равна 51,0±2,2 % в 1-й группе и 52,2±3,1 % - во второй. Однако доля клеток находящихся на стадии S-периода, во 2-й группе была выше, чем в 1-й, на 63,3±5,8 %. На наш взгляд, это связано с задержкой этапов дифференцировки лимфоцитов из-за выраженного процесса деструкции эпителиальных клеток стромы. Действительно, на полутонких срезах выявлялись значительные признаки дистрофических изменений клеток стромы, что приводило к нарушениям их связи между собой и с лимфоцитами и гнездному опустошению коркового вещества долек. В этих участках накапливались активные макрофаги с многочисленными вакуолями светлого или пенистого характера и фагоцитированным материалом. На уровне субкапсулярной части тимоциты теряют контакты прежде всего с эпителиаль-

ными клетками, секретирующими IL-7.

Следовательно, деструкция и гибель ТЭК существенно влияют на пролиферацию лимфоцитов.

Влияние гормонов на пролиферацию тимоцитов in vitro выявило, что независимо от степени выраженности врожденного порока происходит снижение пролифератив-ных свойств тимоцитов (рис. 6, 7). Так, установлено, что под влиянием insulin-like growth factor-I (IGF) в концентрации 10-9 М в культурах с Кон А 40 и 20 мкг/мл пролиферация тимоцитов достоверно (р=0,05) снижалась по отношению к контрольной культуре. Действие somatotropine (STG) в

о

концентрации 10 М в культурах с Кон А 40 мкг/мл также вызывало снижение пролиферации тимоцитов в сравнении с контрольной культурой (р=0,05).

Оценка поликлональной тимусзависи-мой продукции цитокинов в супернатантах культур тимоцитов выявила, что в культурах с IGF-7, IGF-9, STG-8, STG-9, STG-10 М идет стимуляция продукции у-интерферона в группе белых пороков по парному t-кри-терию Стьюдента к контрольной культуре.

В группе синих пороков статистических изменений не выявлено.

В культурах с IGF-7, IGF-8, STG-8, STG-9, STG-10 М идет стимуляция продукции интерлейкина-4 в группе белых пороков. При синих пороках статистических изменений внутри группы не выявлено.

Установлено, что во всех группах концентрация интерлейкина-10 не изменяется.

В культурах с IGF-7, IGF-8, STG-8, STG-9, STG-10 М идет стимуляция продукции интерлейкина-17 в группе белых пороков по парному ¿-критерию Стьюдента к контрольной культуре. В группе синих пороков во всех концентрациях гормонов уровень продукции интерлей-кина-17 также растет по отношению к контрольной культуре.

В результате наблюдается конкуренция между процессами пролиферации и дифференцировки, т.е. при снижении пролиферации тимоцитов следует процесс дифференцировки в эффекторные тимоци-ты. Как видно из данных, наблюдается процесс стимуляции дифференцировки в сторону Th2- и ТЫ7-клеток, не опосредо-

3,3 3,2 3,1 3 2,9 2,8

ConA 40 ConA 20 ConA 10 ConA 5 ConA ConA 0

2,5

-Контроль (ППС)

3,3 3,2 3,1 3 2,9 2,8

/У

^^ ^ +

*

ConA 40 ConA 20 ConA 10 ConA 5 ConA ConA 0 2,5

Рис. 6. Влияние инсулиноподобного фактора роста I (IGF) и соматотропного гормона (STG) на пролиферативный ответ тимоцитов в культурах с Кон А в группе синих пороков

3,4 3,3 3,2 3,1 3 2,9 2,8

ConA 40 ConA 20 ConA 10 ConA 5 ConA ConA 0

2,5

-Контроль (ППС)

3,4 3,3 3,2 3,1 3 2,9 2,8

ConA 40 ConA 20 ConA 10 ConA 5 ConA ConA 0

2,5

Рис. 7. Влияние инсулиноподобного фактора роста I (IGF) и соматотропного гормона (STG) на пролиферативный ответ тимоцитов в культурах с Кон А в группе белых пороков

ванную через продукцию ГЬ-10. Диффе-ренцировка в ТЫ и ^2 звено наблюдается только в группе белых пороков. Очевидно, что снижение пролиферации и дифференцировки в группе синих пороков в значительной степени связано с гипоксией митохондриального происхождения.

Морфологические изменения в тимусе отразились и на функциональном состоянии лимфоцитов периферической крови. С помощью метода количественной полиме-разной цепной реакции изучили содержание Т-рецепторных эксцизионных колец (ТЯЕС), являющихся маркерами Т-клеток, эмигрировавших из тимуса в кровь. Уровень ТЯЕС в крови подтверждал низкую тимическую активность у детей с ВПС. С момента рождения доля первичных тимус-ных мигрантов определялась у них на 42 % ниже, чем у здоровых. После операции у детей в течение последующих 3 лет наблюдали дальнейшее снижение содержания ТЯЕС (на 16 %). В результате к 3-му году у детей после тимэктомиии уровень тимус-ных мигрантов был ниже на 58 %, чем у здоровых. Степень сложности сердечного порока как до, так и после тимэктомии определяла содержание ТЯЕС в крови. При сложных сердечных пороках уровень ТЯЕС до операции был на 34 % ниже, чем при неосложненных пороках сердца. Через 3 года после операции эта разница увели-

чилась до 60 % (рис. 8).

При оценке функционального состояния CD4+ и CD8+ лимфоцитов установлено, что после операции в динамике 3 лет наблюдали тенденцию к росту апоптоза этих клеток (рис. 9). Уже через год, по сравнению с группой здоровых детей, уровень апоптоза CD4 вырос на 30 %, а CD8 на 60 %; к 3-му году после операции показатель продолжал увеличиваться, оставаясь на том же высоком уровне: 12,6±1,8 % -для CD8+ и 6,4±0,7 % - для CD4+-лимфоци-тов (у здоровых детей CD8+-лимфоцитов -3,9±1,1 %; CD4+-лимфоцитов - 3,1±0,7 %).

При сравнении характера апоптоза у детей с различными пороками сердца установлено, что независимо от сложности развития порока сердца в период от 1 до 3 лет после удаления тимуса уровень апоп-тоза лимфоцитов всегда оставался высоким, нарастая с каждым годом. При этом он был в 1,5 раза выше у детей со сложным пороком сердца.

Параллельно в крови исследовали функциональные свойства клеток врожденного иммунитета. Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов показала, что на протяжении 3 лет происходило снижение интегрального показателя фагоцитоза на 25 % (137,0±12,8) по сравнению с показателями здоровых детей (186,01±13,30).

1,2

1,13672

0,8

0,6

0,4

0,2

0,72698

0,69973

0,64842

0,58845

1 - здоровые дети

2 - до операции

3 - через 1 год после

операции

4 - через 2 года

после операции

5 - через 3 года

после операции

1

1

2

3

4

5

Рис. 8. Уровень TREC в лимфоцитах периферической крови

CD8+

CD4+

«

к к

<и X ю Й

Л

^

ей С

С

^

л

и «

«

0 и

1—1 к

со к

щ Д

Л Й

<и ^

р ш

^ С

Й О

1 °

^ о

л о

^ с

СП

О ■

Гь

О

■ ■ ■-■ ■ 2 "5-

1ЧР

1Р1

к)2 I«3

.о4

п

а

Л1 С» '

О

" ^ ■ ■ ■ ■

иЗС

1 й

1<?

гСг3

Й

о и

со И-

£ I

й &

О С

ей О

и с

174 О '

1М

в" О I

■ ж -- ■Л . - ■ ■" V ■ .

10

II?

та с

в 1

\0С

1(Г

* - ^ 1

1—1—■ ■ ■ ■■ ■ ■ |— —1—......1-1 ■ 1—11 ^-1—......1

й «

О и

К

со И-

£ I

й &

о с

ей О

и С

С?'

о

(5

IV* ■ г, Дг ■ ■ ^ 11 ■ ■

10"

10

103 КГ

ч"Ч

О

О О1

л ■ „ .. . ,. -: ■ . ■ . " - г * 1

Рис. 9. Апоптоз лимфоцитов в крови (на каждой гистограмме верхний правый квадрат)

Степень сложности порока сердца также коррелировала с фагоцитарными свойствами нейтрофилов. При сложных врожденных пороках фагоцитарная активность нейтрофилов на протяжении 3 лет неуклонно снижалась и была достоверно меньше, чем у детей с неосложненным пороком, и значительно ниже, чем у здоровых детей. У детей с менее выраженным сердечным пороком интегральный показатель фагоцитоза к 3-му году после операции медленно приближался к показателям группы сравнения.

Фагоцитарная активность моноцитов крови, наоборот, к 2 годам вырастала в 1,5 раза, а к 3-му году выравнивалась с показателями здоровой крови, но с небольшим угнетением фагоцитоза в группе со сложными пороками.

Таким образом, результаты наших исследований показали, что у детей с ВПС к моменту рождения имеется значительная функциональная незрелость первичного органа иммунитета - тимуса. На наш взгляд, ключевым моментом служит нарушение структуры и функции стромы

органа, т.е. тимусного эпителия на этапе развития плода. Развивается инволюция, которая носит необратимый характер, сопровождается замещением стромы тимуса клетками фибробластического диффе-рона, не способными, в силу своих гисто-генетических свойств, создавать условия для развития Т-лимфоцитов, что обусловливает склеротические изменения органа. В крови больных детей уже с рождения снижен уровень наивных Т-лимфоцитов.

После перенесенной тимэктомии в течение 3 лет растет апоптоз циркулирующих лимфоцитов, снижаются и фагоцитарные свойства клеток врожденного иммунитета. В послеоперационном периоде врачам педиатрической службы с целью предупреждения частого развития острых, рецидивирующих и осложненных форм инфекции необходимо учитывать иммунный статус детей с ВПС, особенно со сложными формами пороков, так как функциональное состояние клеток крови таких детей отражает несостоятельность системы иммунитета.

Библиографический список

1. Белозеров Ю.М. Детская кардиология. - М.: МЕДпресс-информ, 2004. - С. 9-221.

2. Бокерия Л.А., Гудкова Р.Г. Сердечно-сосудистая хирургия - 2001. Болезни и врожденные аномалии системы кровообращения. - М.: НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, 2002. - С. 34.

3. Виноградов К.В. Врожденные пороки сердца у детей: распространенность и современное состояние проблемы. http://pediatric.mif-ua.com. Здоровье ребенка. 2007; 6 (9).

4. Дударев И.В. Иммунологическая и гемодинамическая характеристика детей с врожденными пороками сердца синего и бледного типа // Иммунология. - 2002. - Т. 23. - № 3. - С. 167-170.

5. Ивановская Т.Е., Зайратьянц О.В., Леонова Л.В., Волощук И.Н. Патология тимуса у детей. - М.: СОТИС, 1996. - 270 с.

6. Мутафьян О.А. Врожденные пороки сердца у детей. - М.: BINON publishers, 2002. - С. 11-21.

7. Охотникова И.М., Агейкин В.А., Лозовская Л.С. Значение внутрибольничной вирусной инфекции в органной патологии детей грудного возраста // Медицинский научный и учебно-методический журнал. - 2001. - № 5. - С. 81-87.

8. Ярилин А.А. Иммунология. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 752 с.

9. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control gene / J. Vandesompele, K. De Peter, F. Pattyn [et al.] // Genome Biology. - 2002. - Vol. 3. -№ 7. - Research 0034.

10. Boughman J.A., Berg K.A., Asternborski J.A. Familial risk of congenital heart disease assessed in a population based epidemiology study. // Am. J. Med. Genet. - 1987. - № 26. - P. 839-849.

11. How does neonatal thymectomy effect on the immune system / T. Turan, A. Turan, C. Arslan [et al.] // Acta cardiol. - 2004. - № 5. - Р. 511-513.

12. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-MCt method // Methods. - 2001. - Vol. 25. - P. 402-408.

13. Manchester K.L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations // Biotechniques. - 1996. - Vol. 20. - № 6. - P. 968-970.

14. The role of the thymus in immune reconstitution in aging, bone morrow transplantation, and HIV-1 infection / B.F. Haynes, M.L. Markert, G.D. Sempowski [et al.] // Annu. Rev. Immunol. - 2000. - № 18. -Р. 529-560.

FEATURES OF THE FORMATION OF THE IMMUNE SYSTEM AMONG CHILDREN

WITH CONGENITAL HEART DISEASE

V.A. Chetvertnykh, N.P. Loginova, D.Y. Shilov, A.P. Godovalov, O.V. Lebedinskaya, E.V. Saydakova

The paper presents a comprehensive dynamic analysis of major components of the immune system among children with congenital heart disease (CHD) of varying degrees of difficulty with the use of modern immunological, immunochemical, histological, histochemical, cytochemical and electron microscopic research methods. It was found that children with CHD at birth have a significant functional immaturity of the primary organ of immunity - the thymus, especially the ones with complex heart defects. This fact is reflected on thymocyte proliferation and differentiation both in vivo and in vitro. In this regard, since birth blood of sick children contains a reduced level of naive T lymphocytes. After undergoing thymectomy for 3 years apoptosis of circulating lymphocytes (CD4+, CD8) is growing, and the phagocytic properties of the innate immune cells are decreasing. The obtained results reflect the failure of the immune system among children with congenital heart defects.

Keywords: congenital heart disease, children, thymus, immune system. Сведения об авторах

Четвертных Виктор Алексеевич, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой гистологии, эмбриологии, цитологии, Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера (ПГМА), 614000, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26; e-mail: rector@psma.ru

Логинова Наталья Павловна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии, ПГМА; e-mail: natalitsa@yandex.ru

Шилов Дмитрий Юрьевич, кандидат медицинских наук, старший преподаватель кафедры иммунологии, ПГМА; e-mail: shilov-dj@mail.ru

Годовалов Анатолий Петрович, кандидат медицинских наук, старший преподаватель кафедры иммунологии, ПГМА; e-mail: agodovalov@gmail.com

Лебединская Ольга Витальевна, доктор медицинских наук, доцент кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии, ПГМА; e-mail: lebedinska@mail.ru

Сайдакова Евгения Владимировна, аспирант, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (ИЭГМ УрО РАН), 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13; e-mail: radimira@list.ru

Материал поступил в редакцию 04.07.2013 г.