CC BY
35
NK
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК: 616.12-022-053.3-092
ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СТРОЕНИЯ ТИМУСА У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ ПРИ ВРОЖДЕННЫХ ПОРОКАХ СЕРДЦА
Н.П. Логинова,
ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера»
Логинова Наталья Павловна - e-mail: [email protected]
Исследованы биоптаты тимусов от детей 1-го года жизни (n=77) при врожденных пороках сердца разной степени сложности. Иммуногистохимическим методом верифицировано накопление кератинов в эпителиоретикулоцитах (PanCK); тимопоэз оценен по экспрессии CD3+. В сыворотке крови исследован уровень тимулина. Установлено, что степень сложности порока сердца определяют морфологические изменения в органе, при которых формируется комплекс значительных тканевых реакций. В течение первого года жизни (1, 6, 11 мес.) в тимусе наблюдалось снижение экспрессии кератинов, сопровождающееся нарушением архитектоники эпителиальной стромы, что влияло на уровень тимопоэза, понижая его. Исследования показали, что иммуноморфологические особенности коррелировали со степенью сложности сердечного порока и уровнем гормонов в периферической крови, который был существенно ниже, чем у здоровых детей.
Ключевые слова: тимус, врожденные пороки сердца, тимопоэз, тимулин.
Thymuses investigated biopsies from children 1 year of age (n=77) in patients with congenital heart defects of varying difficulty. Immunohistochemistry verified the accumulation of keratin in epitelioretkulotsitah (PanCK), thymopoiesis assessed by expression of CD3+. Serum levels thymuline investigated. The degree of complexity of heart disease determines the morphological changes in the body, under which a large complex tissue reactions. During the first year of life (1, 6, 11 months.) In the thymus was observed decrease in the expression of keratins, accompanied by a breach of the architectonics of epithelial stroma, which affect the level of thymopoiesis, lowering it. Studies have shown that immunomorfologicheskie features correlated with the degree of complexity of a heart defect and the level of hormones in the peripheral blood, which was significantly lower than in healthy children.
Key words: thymus, congenital heart disease, thymopoiesis, thymuline.
Иммунная система - это отлаженный в процессе эволюции многофункциональный механизм, обеспечивающий невосприимчивость к факторам окружающей среды. Лимфоциты - основные клеточные элементы иммунной системы. Среди них большую часть составляют Т-лимфоциты, цикл дифференцировки, которые проходят в тимусе. Постоянно циркулируя между органами и тканями, они играют центральную роль во всех иммунологических реакциях.
Тимус, как первичный орган иммунной системы, играет жизненно важную роль в эмбриональном периоде и сразу после рождения. У людей он имеет максимальную массу в возрасте 1 года, после чего начинается возрастная инволюция и ежегодно происходит потеря около 3% активной ткани тимуса [1, 2].
Богатое микроокружение тимуса обеспечивает формирование клонального разнообразия Т-лимфоцитов через процессы положительной и отрицательной селекции клонов с формированием толерантности к «своему» и функциональной гетерогенности Т-клеток [3, 4, 5, 6]. На этапе своего развития Т-лимфоцит приобретает уникальный антигенраспоз-нающий рецептор (TCR - T-cell receptor), ассоциированный с CD3-комплексом, обеспечивающим после связывания с антигеном проведение сигнала внутрь клетки [7].
На иммунологическое становление Т-лимфоцитов в тимусе играют гуморальные факторы, синтезируемые в органе. Среди них ключевое значение имеют гормоны тимуса, один из которых - тимулин [8]. Количество тимулина в сыворотке является важным параметром для оценки гормональной функции тимуса [9, 10].
Возрастное снижение уровня тимических гормонов, удаление тимуса, а также действие неблагоприятных факторов окружающей среды и ряда врожденных и приобретенных заболеваний ведут к ослаблению функции Т-лимфоцитов. Это может служить основой для развития иммунодефицитных состояний.
Тимус чрезвычайно чувствителен к различным внешним и внутренним воздействиям. Нарушение его структуры и, как следствие, функции при действии многих стрессорных факторов (ишемия, гипоксия, облучение, вирусная и бактериальная инфекция и т. д.) может определить дефектное состояние иммунной системы в целом, что особенно проявляется в детском возрасте.
По данным литературы последних лет дети с врожденным пороком сердца часто подвержены различным заболеваниям в связи с имеющимся у них иммунным дисбалансом [11, 12, 13, 14].
В патогенезе данного заболевания лежит механизм нарушения системной гемодинамики, ведущий к развитию тканевой гипоксии, что нарушает функцию многих органов и тканей, являясь одной из причин развития акци-дентальной инволюции тимуса.
Вопрос о морфофункциональном состоянии и иммуно-морфологическом статусе тимуса развивающегося организма в условиях циркуляторной гипоксии, обусловленной врожденными пороками сердца разной степени сложности, на сегодня остается нерешенным.
Таким образом, целью работы явилось изучение имму-номорфологического и гормонального состояния тимуса у новорожденных детей с врожденным пороком сердца разной степени сложности.
Материал и методы
Исследование проведено на биоптатах тимуса (n=77), полученных во время операций от детей в возрасте до 1 года, при коррекции врожденных пороков сердца. Тимэктомия проводилась в соответствии с существующей хирургической практикой Федерального краевого центра сердечно-сосудистой хирургии г. Перми. Исследования проводили согласно Хельсинской декларации ВМА 2000 г. и протоколу Конвенции Совета Европы по правам человека и биомедицине 1999 г. Критериями включения явилось наличие добровольного согласия на обследование со стороны законных представителей несовершеннолетних детей.
В патогенезе врожденных пороков сердца лежит механизм нарушения системной гемодинамики, зависящий от сложности сердечного порока и вызывающий цианоз слизистых и кожных покровов. По наличию цианоза было выделено две группы: 1-я - тимус (n=35) от детей с белыми пороками сердца, без цианоза слизистых и кожных покровов (дефект межжелудочковой перегородки; дефект межпредсердной перегородки); 2-я - тимусы (n=42) от детей с более выраженной патологией - синие пороки сердца, вызывающие цианоз (тетрада Фалло; аномалия Эпштейна; транспозиция магистральных сосудов). В качестве группы сравнения исследованы тимусы от случайно погибших детей (n=8).
Биоптаты тимуса фиксировали в 10%-м нейтральном формалине на фосфатном буфере (рН 7,2). Для исследования иммуногистохимического состояния клеток проводили окраску мечеными моноклональными антителами (Daco, США): 1) CD3 - для идентификации зрелых тимоци-тов; 2) панцитокератин AbsAE1/AE3 (PanCK) - для идентификации эпителиоретикулоцитов. Для визуализации результатов использовали системы детекции Ultra Vision ONE Detection System HRP Polymer. Препараты инкубировали с хромогеном (DAV Plus Substrate System) и докрашивали гематоксилином Майера с заключением в БиоМаунт-среду. Для оценки качества реакции использовали стекла с позитивным контролем для каждого из антигенов (фирма Labvision, США).
Положительным результатом иммуногистохимической реакции являлось специфическое окрашивание цитоплазмы клеток при выявлении антигена PanCK и CD3. Численную плотность позитивно окрашенных CD3 тимоцитов определяли с использованием квадратной тестовой системы (программа Image J). Полученные результаты рассчитыва-
ли по формуле: Ni=(P/Pt)*%, где P, - количество точек тестовой системы, попавших на позитивно окрашенные CD3 лимфоциты, Pt - общее число точек закрытой тестовой системы (81). Подсчеты проводили в 10 полях зрения каждого среза.
Морфометрическое исследование проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений на морфометрической установке «Olympus».
Содержание гормона тимулина в сыворотке периферической крови определяли у детей с ВПС до операции. Кровь забирали из локтевой вены в объеме 0,5 мл. Группу сравнения составили здоровые дети (n=12) в возрасте до 1,5 лет. Для оценки уровня гормона использовали метод твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем согласно инструкции производителя (тимулин, Immundiagnostik, Германия).
Полученные результаты обработаны с помощью пакетов MicrosoftExcel 2007 и Statistica 6,0. Для статистического анализа использовались непараметрические критерии. В результатах представлены средние значения со стандартными отклонениями, а также медиана, нижний квартиль и верхний квартиль. Различие оценивалось с помощью критерия Манна-Уитни. За статистически значимые результаты принималась величина ошибки р=0,05.
Результаты исследования
В пределах дольки тимуса положительная экспрессия PanCK в клетках стромы позволила идентифицировать весь эпителиальный компонент и оценить целостность стромы.
Основные события тимопоэза проходят в коре дольки тимуса. На уровне субкапсулярной зоны в эпителиальных клетках стромы верифицировалась экспрессия PanCK. В группе детей с белыми пороками распределение кератина было аналогично группе сравнения. Позитивно окрашенные клетки соединялись отростками и формировали ровный пласт, идущий вдоль базальной мембраны. Большая часть клеток имела крупное ядро, занимающее центральную часть цитоплазмы. В этой зоне дольки тимуса позитивно окрашенные клетки формировали от 2 до 3 слоев и имели контакт с тимоцитами. В группе детей с синими пороками (2-я группа) позитивное окрашивание нередко определялось в одиночно лежащих клетках. Целостность пласта часто была нарушена, в некоторых случаях наблюдали фрагменты окрашенных клеток. В этой группе детей определена динамика состояния эпителиоре-тикулоцитов, зависящая от возраста. Сравнивая тимусы детей 1 мес., 6 мес. и 11 мес. жизни установлено, что у детей к 11 мес. жизни в субкапсулярной зоне имелось снижение экспрессии PanCK.
ТАБЛИЦА.
Численная плотность CD3+ тимоцитов в коре дольки тимуса (%)
^^^^группы контроль 1 (белый порок) 2 (синий порок)
1 месяц 57,4±3,1* 48,6±3,71**
6 месяцев 49,6±5,7** 43,5±7,2**
11 месяцев 75,9±6,6 49,3±2,2** 44,4±4,1**
Примечание: * различия по сравнению с показателями группы контроля значимы при р=0,05 и ** при р=0,001.
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
В пределах глубокой коры экспрессия кератина в клетках стромы в течение первого года жизни отличалась и зависела от сложности сердечного порока. В норме эпителиальная строма формирует трехмерный каркас (рис. 1). Соединяясь отростками, клетки создают сеть, в ячейках которой на этапе своего развития располагаются Т-лимфоциты.
В группе со слабыми пороками позитивное окрашивание определялось в пределах основной части коры в клетках, лежащих как по одиночке, так и формирующих группы (кластеры). Часть клеток теряли связь между собой, сеть разрывалась, отростки клеток выпрямлялись (рис. 2). В группе синих пороков позитивно окрашенные клетки чаще выявлялись одиночно, кластеры наблюдались реже и состояли из меньшего количества клеток. В период наблюдения (от 1 до 11 мес.) экспрессия РапСК постепенно снижалась и к концу года выявлялась единично в виде фрагментов (рис. 3). В части долек эпителиальные клетки вообще не проявляли реакции на окрашивание.
В пределах коры на этапах антигеннезависимой диффе-ренцировки тимоциты последовательно перемещаются по зонам и, находясь в контакте с ретикулоэпителиоцитами, приобретают основные рецепторы (TCR-CD3+). В каждой зоне этому способствуют специфические стимулирующие факторы, выделяемые клетками микроокружения. Изменения в строении ретикулоэпителиальной сети отразились и на внутритимических процессах развития тимо-цитов.
Интенсивность тимопоэза оценивали по положительной экспрессии CD3. В группах сердечных пороков численная плотность зрелых лимфоцитов в коре зависела от типа ВПС и была ниже, чем в группе сравнения (75,9±6,6%): в 1-й группе (белый порок) - 64,2±5,7%, а во 2-й (синий порок) -53,7±7,2% (р=0,05). Независимо от сложности сердечного порока в течение года жизни (1 мес., 6 мес. и 11 мес.) в корковом веществе наблюдали тенденцию к снижению тимопоэза (таблица).
В тимусе 2-й группы наблюдали замедление выхода CD3+ тимоцитов в периферическую кровь и, как результат, их накопление в мозговом веществе. Число CD3+ Т-лимфоцитов в мозговом веществе этой группы было достоверно самое высокое и составило 55,5±3,9% (р=0,007); в группе сравнения - 40,7±2,8%.
Морфологические события в тимусе отразились на его гормональной функции. Содержание тимулина в сыворотке крови в группе детей с ВПС определялось на уровне 0,418 [0,346-0,502] пг/мл, у здоровых детей -0,446 [0,389-0,484] пг/мл. Внутри пороков наблюдали разницу. При синих врожденных пороках, где морфологические изменения в тимусе носили более выраженный характер, содержание гормона было 0,372 [0,295-0,546] пг/мл. В группе детей с белыми пороками, не вызывающими цианоза, уровень тимулина составил 0,428 [0,333-0,684] пг/мл.
Обсуждение
Результаты исследования показали, что у детей с ВПС имеются изменения в структуре эпителиальной стромы тимуса. Накопление в клетках кератина и целостность эпителиальной стромы зависят от сложности сердечного порока. Исчезновение в течение года эпителиальных
РИС. 3.
Экспрессия PanCK в эпителиоретикулоцитах дольки тимуса. 2-я группа (синие пороки). 11 мес. Ув. х400.
маркеров PanCK и, как результат, нарушение архитектоники эпителиальной сети, вероятно, связано с особенностью становления эпителиоретикулоцитов на этапе их эмбрионального развития. Известно, что эмбриогенез эпителиальной стромы тимуса контролируют клетки краниального отдела нервного гребня, параллельно участвующие в развитии и становлении соединительнотканных перегородок сердца и крупных сосудов [15, 16]. Установленная нами взаимосвязь является тому подтверждением.
Нарушение целостности эпителиальной сети способствует потере контакта с тимоцитами на этапе их кортикального развития, снижается реализация их дифферен-цировочного потенциала, что проявляется изменением численной плотности CD3+ тимоцитов с накоплением их в мозговом веществе. Замедление эмиграции тимоцитов в кровь вероятно связано с низкой силой хемотаксического сигнала, исходящего от эпителиальных клеток стромы и клеток сосудистой стенки. Ранее нами сообщалось, что у детей с ВПС в периферической крови установлен низкий уровень недавних тимусных мигрантов [17].
Уровень тимулина в крови коррелировал со степенью сложности ВПС. Известно, что в тимусе клетками-продуцентами гормона являются субкапсулярные и медуллярные эпителиоретикулоциты [18, 19, 20, 21]. По результатам иммуногистохимических исследований структура эпителиального ретикулума этих зон у детей с ВПС не носила серьезный характер, что обеспечивало поддержание тимоцитов на начальных этапах их развития. Но несмотря на это, у детей с синим пороком сердца явления тимопоэза протекали слабее, чем у детей с белыми пороками, и значительно отличались от группы здоровых детей.
Таким образом, полученные результаты расширяют представление о морфологическом статусе первичного органа иммунитета - тимуса, в условиях циркуляторной гипоксии, обусловленной врожденными пороками сердца разной степени сложности. Замедление тимопоэза влечет за собой уменьшение в организме Т-клеточного ресурса. Без сомнений, это может явиться причиной нарушения формирования адаптивного иммунитета у данной категории больных детей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Харченко В.П., Саркисов Д.С., Ветшев П.С., Галил-Оглы Г.А., Зайратьянц О.В. Болезни вилочковой железы. М.: Триада-Х, 1998. C. 232.
Kharchenko V.P., Sarkisov D.S., Vetshev P.S., Galil-Ogly G.A., Zayrat'yanc O.V. Bolezni vilochkovoy zhelezy. M.: Triada-X, 1998. S. 232.
2. Киселева Е.М. Механизмы инволюции тимуса при опухолевом росте. Успехи современной биологии. 2004. Т. 124. № 6. C. 589-601.
Kiseleva E.M. Mekhanizmy involyuciitimusa pri opukholevom roste. Uspekhi sovremennoy biologii. 2004. Т. 124. № 6. S. 589-601.
3. Пальцев М.А., Кветной И.М. Руководство по нейроиммуноэндокриноло-гии 2-е изд. М.: ОАО «Медицина», 2008. C. 512.
Pal'cev M.A., Kvetnoy I.M. Rukovodstvo po neyroimmunoendokrinologii 2-e izd. M.: OAO «Medicina», 2008. S. 512.
4. Куклина Е.М. Молекулярные механизмы дифференцировки тимоцитов. Онтогенез. 2003. Т. 34. № 5. С. 342-357.
Kuklina E.M. Molekulyarnye mekhanizmy differencirovki timocitov. Ontogenez. 2003. Т 34. № 5. S. 342-357.
5. Hale L.P. Histologic and molecular assessment of human thymus. Annals of Diagnostic Pathology. 2004. № 8 (1). P. 50-60.
6. Shah D.K., Zuniga-Pflucker J.C. An overview of the intrathymic intricacies of T cell development. J.Immunology. 2014. № 192. P. 4017-4023.
7. Черешнев В.А., Шмагель К.В. Иммунология. М.: НП «Центр стратегического партнерства», 2014. C. 520.
Chereshnev V.A., Shmagel' K.V. Immunologiya. M.: NP «Centr strategicheskogo partnerstva», 2014. S. 520.
8. Ярилин А.А. Тимус как орган эндокринной системы. Иммунология. 1996. № 1. C. 4-10.
Yarilin A.A. Timus kak organ endokrinnoy sistemy. Immunologiya. 1996. №1. S. 4-10.
9. Consolini R., Legitimo A., Calleri A., Milani M.. Distribution of age-related thymulin titres in normal subjects through the course of life. Clinical & Experimental Immunology. 2001. V. 121 (3). Р. 444-447.
10. Reqqiani P.C., Schwerdt J.I., Console G.M., Roqqero E.A., Dardenne M., Goya R.G. Physiology and therapeutic potential of thymic peptide thymulin. Curr. Pharm.Des. 2014. № 20 (29). P. 4690-4696.
11. Виноградов К.В. Врожденные пороки сердца у детей: распространенность и современное состояние проблемы. Здоровье ребенка. 2007. Т. 6. № 9. -http://pediatric.mif-ua.com.
Vinogradov K.V. Vrozhdennye poroki serdca u detey: rasprostranennost' i sovremennoe sostoyanie problemy. Zdorov'e rebenka. 2007. Т. 6. № 9. - http:// pediatric.mif-ua.com.
12. Фроленко А.Л. Клинико-иммунологическая характеристика детей после тимэктомии: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. 2011. 24 с.
Frolenko A.L. Kliniko-immunologicheskaya kharakteristika detey posle timektomii: Avtoref. dis. kand. med. nauk. 2011. 24 s.
13. Haynes B.F., Markert M.L., Sempowski G.D. et al. The role of the thymus in immune reconstitution in aging, bone morrow transplantation, and HIV-1 infection. Annu.Rev.Immunol. 2000. № 18. Р. 529-560.
14. Turan T., Turan A., Arslan C. et al. How does neonatal thymectomy effect on the immune system. Acta cardiol. 2004. № 5. Р. 511-513.
15. Kirby M.L., Waldo K.L. Role of neural crest in congenital heart disease. Circulation. 1990. № 82 (2). Р. 332-340.
16. Erickson C.A. Neural Crest: Origin, Migration and Differentiation. Encyclopedia of life science, London: nature publishing group. 2011. Р. 2084-2100.
17. Логинова Н.П., Четвертных В.А., Семченко В.В., Сайдакова Е.В., Чемурзиева Н.В. Особенности экспрессии цитокератинов 5 и 8 в клетках эпителиальной стромы тимуса и количество TREC в периферических Т-лимфоцитах у детей с врожденными пороками сердца. Иммунология. 2014. Т. 35. № 6. С. 333-337.
Loginova N.P., Chetvertnykh V.A., Semchenko V.V., Saydakova E.V., Chemurzieva N.V. Osobennosti ekspressii citokeratinov 5 i 8 v kletkakh epitelial'noy stromy timusa i kolichestvo TREC v perifericheskikh T-limfocitakh u detey s vrozhdennymi porokami serdca. Immunologiya. 2014. Т. 35. № 6. S. 333-337.
18. Поверенный А.М., Виноградова Ю.Э., Дейгин В.И. Геморегуляторные синтетические пептиды. Тер. архив. 2000. Т. 72. № 7. С. 74-76.
Poverenniy A.M., Vinogradova Yu.E., Deygin V.I. Gemoregulyatornye sinteticheskie peptidy. Ter. arkhiv. 2000. Т. 72. № 7. S. 74-76.
19. Kendall M. D. Functional anatomy of the thymic microenvironment. J. Anat. (Lond.). 1991. Vol. 177. Р. 1-29.
20. Ярилин А.А. Цитокины в тимусе. Выработка и рецепция цитокинов. Цитокины и воспаление. 2003. № 1. С. 1-13.
Yarilin A.A. Citokiny v timuse. Vyrabotka i recepciya citokinov. Citokiny i vospalenie. 2003. № 1. S. 1-13.
21. Abilko T., Sekino H. Synthesis of an immunologically active analog of thymic humoral factor-gamma 2 with enhanced enzymatic stability. Bioorg. Med. Chem. 1994. Vol. 2. Р. 787-792. ГГЧ
