CC BY
63
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
УДК: 616.12-007.2-053.1-053.2-07:616.438-078.33
Логинова Н.П.1, Четвертных В.А.1, Семченко В.В.2, Сайдакова Е.В.3, Чемурзиева Н.В.1
ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ЦИТОКЕРАТИНОВ (СК) 5 И 8 В КЛЕТКАХ ЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ СТРОМЫ ТИМУСА И КОЛИЧЕСТВО TREC В ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ Т-ЛИМФОЦИТАХ У ДЕТЕЙ С ВРОЖДЕННЫМИ ПОРОКАМИ СЕРДЦА
1ГБОУ ВПО Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера Минздрава России, 614000, г Пермь; 2Институт ветеринарной медицины и биотехнологий ФГБОУ ВПО Омский государственный аграрный университет им. П.А. Столыпина, 644122, г. Омск; 3ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, 614081, г. Пермь
Изучали взаимосвязь состояния клеток эпителиальной стромы тимуса по экспрессии цитокератина (СК)- 5 и СК-8 и уровнем Т-рецепторных эксцизионных колец (TREC) в периферической крови у детей с врожденными пороками сердца (ВПС). В течение 1-го года жизни (1, 6, 11 мес) в тимусе наблюдали снижение экспрессии CK, сопровождающееся нарушением архитектоники эпителиальной стромы, что определяло качество развития лимфоцитов на этапе их антигеннезависимой дифференцировки. В периферической крови по количеству TREC выявили ослабление эмиграции Т-лимфоцитов из тимуса. Результаты исследования показали, что изменения в состоянии ретикулоэпи-телиальной стромы тимуса коррелировали со степенью сложности ВПС и уровнем TREC в периферической крови, который был существенно ниже, чем у здоровых детей.
Ключевые слова: тимус; цитокератины; ретикуэпителиальные клетки стромы; Т-рецепторные эксцизион-ные кольца; врожденные пороки сердца.
Для цитирования: Иммунология. 2014; 35 (6): 333-337. Loginova N.P.1, Chetvertnyh V.A.1, Semchenko V.V.2, Sajdakova E.V.3, Chemurzieva N.V.1
THE EXPRESSION PATTERN OF CYTOKERATIN 5 AND 8 CELLS OF EPITHELIAL THYMIC STROMA AND QUANTITY TREC IN PERIPHERAL T-LYMPHOCYTES IN CHILDREN WITH CONGENITAL HEART DISEASE
'Acad. E.A. Wagner Perm State Medical Academy, Ministry of Health, 614000, Perm; 2Agrarian University Omsk P. A. Stolypin, Institute of Veterinary Medicine and Biotechnology, 644122, Omsk; 3 Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Russian Academy of Science, 614081, Perm
Examined the relationship status of the epithelial cells of the stroma of the thymus by the expression of cytokeratin (CK) 5 and 8, and the level of T - receptor excision rings (TREC) in peripheral blood of children with congenital heart disease (CHD). During the first year of life (1, 6, 11 months.) Was observed in the thymus decreased expression of CK, accompanied by a breach of the architectonics of epithelial stroma that determines the quality of lymphocytes during their antigennezavisimoy differentiation. In peripheral blood, the number of TREC, observed attenuation emigration of T-lymphocytes from the thymus. Studies have shown that changes in the state retikuloepitelialnoy thymic stroma, were correlated with the degree of complexity of a heart defect and TREC levels in peripheral blood, which was significantly lower than in healthy children.
Keywords: thymus; cytokeratins; retikuepitelialnye stromal cells; T-receptor excision rings; congenital heart disease.
citation: Immunologya. 2014; 35 (6): 333-337. (in Russian)
В норме тимус как первичный орган иммунной системы создает оптимальные условия для антигеннезависимой дифференцировки Т-лимфоцитов. На этапе развития тимоциты проходят ряд последующих этапов: созревание (появление антигенраспознающих рецепторов); деление Т-клеток на субпопуляции и селекция их клонов, способных распознавать чужеродные пептиды. Качественная реализация этих этапов зависит от факторов микроокружения, основной клеточной популяцией которого являются тимусные рети-кулоэпителиальные клетки [1-3]. Многие из них выполняют функцию тканевого каркаса и являются источниками сигналов для развивающихся тимоцитов при прямых с ними контактах. Взаимоотношения тимоцитов и ретикулоэпители-альных клеток реципрокные. Обмениваясь сигналами, эти клетки обеспечивают поддержание своей жизнеспособности, активности и структурной организации [4-8]. Уникальной особенностью ретикулоэпителиоцитов является наличие в цитоплазме цитокератинпромежуточных филаментов, что
Для корреспонденции: Логинова наталия Павловна, natalitsa@yandex.ru
For correspondence: Loginova Nataliya Pavlovna, natalitsa@yandex.ru
появляется на этапе их дифференцировки. Качество сборки промежуточных филаментов влияет на механическую стабильность и целостность тимусного эпителия [9, 10]. Функционально зрелые ретикулоэпителиоциты регулируют процесс становления Т-лимфоцитов, в основе которого лежит кардинальная перестройка генов, кодирующих антигенра-спознающие рецепторы. На этапе развития из заложенного в зародышевом геноме набора вариабельных (V) и ряда дополнительных (J, D) сегментов выбирается по одному сегменту, которые сближаются и формируют зрелый ген V. Участок между избранными сегментами вырезается и замыкается в эписомные кольцевые структуры. Эти структуры получили название «Т-рецепторные эксцизионные кольца» (T-cell receptor excision circle - TREC) [6, 11, 12]. TREC содержатся в CD3+-тимоцитах и рассматриваются как маркеры Т-клеток, недавно мигрировавших из тимуса на периферию (недавние тимусные эмигранты). TREC-структуры стабильные, они не делятся и дочерним клеткам не передаются. В ходе пролиферации происходит постепенная элиминация их. В связи с этим уровень TREC рассматривают как показатель функциональной активности тимуса - его способности продуцировать Т-лимфоциты [6, 13].
Различные стрессорные факторы, такие как ишемия, гипоксия, вирусная инфекция, влияют на развитие лимфо-
цитов. Так, тканевая гипоксия, вызванная нарушением системной гемодинамики на фоне врожденных пороков сердца (ВПС), приводит к инволютивным изменениям в тимусе [14]. Таким образом, важным является вопрос о взаимосвязи ре-тикулоэпителиальной стромы тимуса (с учетом экспрессии в ней цитокератинов) и количества TREC в популяции периферических Т-лимфоцитов в условиях гипоксии, вызванной ВПС разной степени сложности, что и послужило целью исследования.
Материалы и методы. Исследование проводили на биоптатах тимуса (n = 47), полученных во время операций от детей в возрасте до 11 мес. жизни при коррекции ВПС. Тимэктомию производили в соответствии с существующей хирургической практикой Федерального краевого центра сердечно-сосудистой хирургии г. Перми. Исследования проводили согласно Хельсинкской декларации ВМА 2000 г. и протоколу Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г Критериями включения стало наличие добровольного согласия на обследование со стороны законных представителей несовершеннолетних. В патогенезе ВПС лежит механизм нарушения системной гемодинамики, зависящий от сложности сердечного порока и вызывающий цианоз слизистых и кожных покровов. В зависимости от наличия цианоза выделили 2 группы. В 1-ю группу включили тимус (n = 25) от детей с белыми ВПС, без цианоза слизистых и кожных покровов (дефект межжелудочковой перегородки; дефект межпредсердной перегородки), во 2-ю - тимусы (n = 22) от детей с синими ВПС, вызывающими цианоз (тетрада Фалло, аномалия Эбштейна, транспозиция магистральных сосудов). В качестве группы сравнения исследовали тимусы от случайно погибших детей (n = 4).
Биоптаты тимуса фиксировали в 10 % нейтральном формалине на фосфатном буфере (рН 7,2). Иммуногистохимиче-ское исследование проводили на серийных срезах с использованием моноклональных антител к эпителию: цитокератина (СК)-5+ и СК-8+ (Daco, США). При визуализации результатов использовали систему детекции Ultra Vision ONE Detection System HRP Polymer; инкубировали с хромогеном - DAV Plus Substrate System. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в БиоМаунт-среду. Для оценки качества реакции использовали стекла с позитивным контролем для каждого из антигенов (Labvision, США).
Для определения количества TREc у детей до операции забирали кровь в объеме 0,5 мл. Группу сравнения составили здоровые дети (n = 12) в возрасте до 1,5 лет. ДНК выделяли с использованием набора реагентов «KR-012» (OMNIX, Россия) согласно инструкции производителя. Концентрацию полученных нуклеиновых кислот и степень их контаминации белком определяли спектрофотометрически на длинах волн 260 и 280 нм (UVmini 1240, Shimadzu, Япония). Расчет осуществляли общепринятым методом на основе соответствующих коэффициентов экстинкции [15].
Для анализа количества TREc применяли математический метод 2-ÄÄCt [16]. В качестве референса [17] использовали геномную последовательность ß-актина (ß-actin control reagents; Applied Biosystems, США). В роли калибровочного образца выступала смесь ДНК, полученных от 12 доноров (концентрация 275 мкг/мл; соотношение показателей свето-поглощения на длинах волн 260 и 280 нм 1,91).
Реакцию осуществляли на термоциклере CFX-96 (BioRad, США) по программе: 95 оС - 180 с (1 цикл); 61оС -20 c, 70оС - 10 с, 95оС - 15 c (50 циклов). Уровень флюоресценции измеряли при температуре 70оС в каждом цикле амплификации. Использовали прямой праймер TCR2: 5'-CACATCCCTTTCAACCATGCT; обратный праймер TCR2: 3'-GCCAGCTGCAGGGTTTAGG; флюоресцентный зонд TCR2: FAM-ACACCTCTGGTTTTTGTAAAGGTGCCCACT-BHQ1. Амплификацию целевого и референсного генов проводили раздельно.
Съемку препаратов проводили на морфометрической установке «Olympus» с последующим анализом полученных изображений в программе Image PRO+ (free version).
Рис.1. Экспрессия СК-5 в клетках субкапсулярной зоны дольки тимуса при белых пороках сердца. Ув. 600.
Экспрессию СК-5 и СК-8 определяли измерением площади положительной реакции клеток в пикселях (pix) в каждом случае в 10 полях зрения. В качестве критерия оценки состояния стромы рассматривали ее целостность в виде сети. В автоматическом режиме выделяли кластеры (группы ре-тикулоэпителиальных клеток, соединенных отростками), количество объектов, входящих в состав кластера, и количество одиночных объектов, т. е. фрагментов сети лежащих вне ее.
Полученные результаты обрабатывали с помощью пакетов Microsoft Excel 2007 и Statistica 6,0. Для статистического анализа использовали непараметрические критерии. В результатах представлены средние значения со стандартными отклонениями, а также медиана, нижний и верхний квартили. Различие в зависимых группах оценивали, используя критерий Вилкоксона, в независимых - по критерию Манна-Уитни. Зависимость показателей определяли с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. За статистически значимые результаты принимали величину ошибки р = 0,05.
Результаты и обсуждение. По набору в цитоплазме ци-токератиновых полипептидов ретикулоэпителиоциты хорошо различимы, что важно для определения их локализации и выполняемой функции. Кроме того, положительная экспрессия СК-5 и СК-8 позволила дифференцировать ретикулоэпи-телиальные клетки стромы в пределах коркового вещества дольки.
На этапе постнатального онтогенеза у детей с ВПС в тимусе в течение изученного срока жизни независимо от сложности ВПС, положительную экспрессию СК-5 наблюдали в клетках, прилежащих к базальной мембране, и клетках субкапсулярной зоны. Клетки имели крупное светлое ядро, занимающее большую часть цитоплазмы. Отростки этих клеток формировали контакты друг с другом на всем протяжении базальной мембраны, образуя ровный непрерывный пласт, продолжающийся в междольковые прослойки. В суб-капсулярной зоне при белых сердечных пороках СК-5 накапливался равномерно (рис. 1), аналогично таковому у тимусам детей группы сравнения. При синих ВПС экспрессию СК-5 в основном выявляли на уровне базальной мембраны и в клетках, лежащих одиночно; в некоторых дольках наблюдали только позитивно окрашенные фрагменты ретикулоэ-пителиоцитов (рис. 2). Популяция клеток, экспрессирующих СК-5, относится к малодифференцированной. Являясь камбием, эти клетки имеют невысокий уровень экспрессии МНС II, что указывает на слабое вовлечение данной субпопуляции в процессы презентации антигенов [9].
Рис. 2. Экспрессия СК-5 в клетках субкапсулярной зоны дольки тимуса при синих пороках сердца. Ув.600.
Экспрессию СК-8 в ретикулоэпителиоцитах наблюдали только в пределах глубокой коры дольки тимуса. Клетки этой субпопуляции имеют высокий уровень экспрессии молекул МНС II [9, 10], что свидетельствует об их активном участии в селекции лимфоцитов на этапе их становления с участием прямого межклеточного контакта.
В течение 1-го года жизни экспрессия СК-8 в клетках стро-мы различалась в зависимости от сложности ВПС. В пределах коры в норме эпителиальная строма формирует трехмерный каркас. В возрасте 1 мес при белых ВПС площадь экспрессии СК-8 составила 10 246,9 ± 3177,7 pix. В большинстве долек эпителиальные клетки, соединяясь отростками, формировали кластеры, создавая сеть, контактируя с лимфоцитами на этапе их развития. Количество кластеров в поле зрения составило 44,7 ± 8,9. Кластеры состояли из 325,3 ± 37,1 объекта (ретикулоэпителиальные клетки). Формирование кластеров в местах прохождения положительной селекции лимфоцитами было эпизодическим, неравномерным. В части долек сеть местами была нарушена, клетки между собой теряли контакт, что приводило к появлению их изолированных скоплений (52,3 ± 15,8). Через 6 мес жизни наблюдали снижение площади занимаемой ретикулоэпителиоцитами, которые положительно реагируют с СК-8+, до 5644,7 ± 1938,1 pix (р = 0,002). Количество кластеров снизилось на 30% (р = 0,002), их формировало меньшее количество объектов - 176,9 ± 57,6 (р = 0,003). Через 11 мес жизни площадь экспрессии СК-8 снизилась еще на 37% (р = 0,0007). Эпителиальные клетки стромы выявлялись лишь фрагментарно (рис. 3), количество кластеров снизилось еще, составив 19,8 ± 9,2 (р = 0,002) (рис. 4). В их формировании принимало участие меньшее количество объектов в сравнении с таковым в предыдущий срок (рис. 5).
В группе синих ВПС, экспрессия СК-8 во все сроки наблюдения была снижена. Через 1 мес жизни ретикулоэпи-телиальные клетки занимали 6282,5 ± 2427,2 pix площади. Через 6 мес отметили ее уменьшение на 34% (р = 0,04). В пределах глубокой коры долек клетки теряли связь между собой, отростки клеток выпрямлялись, сеть разрывалась. В результате к концу срока наблюдения кластеры выявляли в меньшем количестве (см. рис. 4). Количество ретикулоэпи-телиальных клеток, формирующих кластеры, также было сниженным (см. рис. 5). Все чаще в корковом веществе долек регистрировали одиночно лежащие эпителиальные клетки и их фрагменты.
Через 11 мес в части долек клетки слабо реагировали на окрашивание, экспрессия СК-8 в них проявлялась эпи-
Рис. 3. Экспрессия СК-8 в ретикулоэпителиоцитах глубокой коры дольки тимуса. Ув. 600. а - при белых пороках 11 мес. жизни; б - при синих пороках сердца 11 мес жизни; в - группа сравнения - 12 мес жизни.
Рис.4. Формирование кластеров в корковом веществе долек тимуса. *- достоверные различия с показателями 1 мес.; **- достоверные различия с группой сравнения. Ось х - возраст, ось у - количество кластеров.
Рис.5. Количество объектов (ретикулоэпителиоциты), входящих в состав кластеров в корковом веществе долек тимуса. *- достоверные различия с 1 мес; ** - достоверные различия с группой сравнения. Ось х - возраст, ось у - количество клеток в кластерах.
зодически, а занимаемая ими площадь составила всего 1480,3 ± 545,5 pix (р = 0,0007). Снижение экспрессии СК, на наш взгляд, связано с дистрофическими изменениями ТЭК и потерей ими межклеточных связей.
Результаты иммуноморфологической оценки состояния эпителиальной стромы тимуса коррелировали с количеством наивных лимфоцитов, содержащихся в периферической крови. При исследованиях установили, что количество TREC в крови здоровых детей составило 1,07038 (0,96680; 1,46902). В основной группе независимо от степени сложности ВПС в крови определяли достоверно низкое количество TREC, что отражало снижение тимической активности: 0,71097 (0,38524; 0,85681). При синих ВПС, где морфологические изменения в тимусе носили более сильный характер, уровень TREC был еще ниже: 0,57055 (0,32646; 0,88270) (р = 0,001). У детей с белыми ВПС, не вызывающими цианоза, их количество составило 0,69495 (0,58255; 0,77916) (р = 0,05) (рис. 6). При этом возрастная динамика данных показателей в обеих группах существенно не различалась.
Таким образом, у детей с ВПС в сравнении со здоровыми детьми в крови наблюдали снижение количества ти-мусных мигрантов. Прослежена взаимосвязь со степенью сложности ВПС, что коррелировало с результатами имму-ногистохимических исследований клеток эпителиальной стромы тимуса.
Снижение тимической активности у детей с ВПС, на наш взгляд, связано с несостоятельностью клеток микроокружения, а именно ретикулярных эпителиоцитов глубокой коры дольки тимуса, участвующих в положительной селекции ти-моцитов на этапе их антигеннезависимой дифференцировки. Наблюдаемое в течение года исчезновение эпителиальных маркеров и как результат нарушение архитектоники эпителиальной сети, вероятно, объясняются особенностью становления эпителиальных клеток на этапе их эмбрионального развития, где они не завершили качественно свою дифферен-цировку.
Известно, что в закладке тимуса, а именно его эпителиальной стромы, принимают участие клетки краниального отдела нервного гребня, параллельно участвующие в развитии сердца, в частности в становлении его соединительно-тканных структур, перегородок и сосудов [18, 19]. Установленная нами взаимосвязь также является тому подтверждением. Показано, что степень сложности ВПС взаимосвязана с особенностью экспрессии СК и целостностью эпителиальной стромы тимуса.
Наблюдаемое нарушение архитектоники эпителиальной сети в течение года способствует потере контакта с тимоци-тами на этапе их кортикального развития, снижается реализация их дифференцировочного потенциала и как результат снижается эмиграция тимоцитов в кровь.
Таким образом, по экспрессии СК в эпителиальных клет-
1,6 и 1,4 -
1,2 "
12 3 4
Рис.6. Содержание ТИЕС в лимфоцитах периферической крови детей.
*- достоверные различия с группой здоровых детей. Ось х - группы детей, ось у - количество TREС (показатель 2"дда).
ках тимуса при ВПС прослежена взаимосвязь состояния ре-тикулоэпителиальной стромы тимуса и количества REC в популяции периферических Т-лимфоцитов.
В силу своей несостоятельности ретикулярные эпите-лиоциты в течение 1 года жизни, вероятно, изменяли свои функциональные свойства, что влияет на создание условий для качественного развития тимоцитов. В результате происходит снижение в организме Т-клеточного ресурса. Без сомнений, это может явиться причиной снижения формирования адаптивного иммунитета у детей с данной патологией.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 11-04-96023 р_урал_а).
литература
1. Пальцев М.А., Кветной И.М. Руководство по нейроиммуно-эндокринологии. 2-е изд. М.: ОАО «Издательство «Медицина»»; 2008.
2. Ярилин А.А. Иммунология. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2010.
3. De Monte L., Porcellini S., Tafi E., Sherkidan J. et al. EVA regulates thymus stromal organization and early thymocyte development. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007; 334-40.
4. Куклина Е.М. Молекулярные механизмы дифференцировки тимоцитов. Онтогенез. 2003; 34 (5): 342-57.
5. Литвина М.М., Шарова Н.И., Дзуцев А.Х., Ярилин А.А. Сочетание дифференцировки и апоптоза тимоцитов человека при их совместном культивировании с эпителиальными клетками тимуса. Иммунология. 2004; 1: 8-13.
6. Kong F.-K., Chen С. L., Cooper M. Thymic function can be accurately monitored by the level of recent T cell emigrants in the circulation. Immunity. 1998; 8: 97-104.
7. Hale L.P. Histologic and molecular assessment of human thymus. Ann. Diagn. Path. 2004; 8 (1): 50-60.
8. Utsumi K., Sawada M., Narumiya S., Nagamine J., Sakata T., Iwagami S. et al. Adhesion of immature tymocites of thymic stromal cells through fibronectin molecules and its significance for the induction of thymocyte differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991; 8: 5685-9.
9. Eun N.L., Kyeong P. J., Lee J. Characterization of the expression of citokeratins 5, 8 and 14 in mouse thymic epithelial cells during thymus regeneration following acute thymic involution. Anat. Cell Biol. 2011; 44(1): 14-24.
10. Popa I., Zubkova I., Medvedovic M., Romantseva T., Mostowski H. et al. Regeneration of the adult thymus is preceded by the expansion of K5+K8+ epithelial cell progenitors and by increased expression of Trp63, cMyc and Tcf3 transcription factors in the thymic stroma. Int. Immunol. 2007; 19 (11): 1249-60.
иммунология № 6, 2014
11. Ярилин А.А., Донецкова А.Д. Т-клетки - недавние эмигранты из тимуса. Иммунология. 2012; 6: 326-34.
12. Bogue M., Roth D.B. Mechanism of V(D)J recombination. Curr. Opin. Immunol. 1996; 8(2): 175-80.
13. Lorenzi A. R., Pattrson A. M., Pratt A. et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established metod. J. Immunol. Meth. 2008; 339: 185-94.
14. Логинова Н.П., Четвертных В.А., Хромцова Г.А. Морфологические и иммуногистохимические особенности строения тимуса у новорожденных детей с врожденными пороками сердца. Архив патологии. 2013; 4: 9-14.
15. Manchester K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Biotechniques. 1996; 20 (6): 968-70.
16. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-AACt method. Methods. 2001; 25: 402-8.
17. Vandesompele J., De Peter K., Pattyn F. et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control gene. Genome Biol. 2002; 3(7): Research 0034.
18. Erickson C.A. Neural crest: Origin, migration and differentiation. In: Encyclopedia of Life Science. London: Nature Publishing Group. 2011: 2084-100.
19. Kirby M.L., Waldo K.L. Role of neural crest in congenital heart disease. Circulation. 1990; 82 (2): 332-40.
Поступила 21.08.14
references
1. Pal'tsev M.A., Kvetnoy I.M. Manual neuroimmunoendocrinol-ogy. [Rukovodstvo po neyroimmunoyendokrinologii]. 2-nd ed. Moscow: OAO «Izdatel'stvo «Meditsina»; 2008. (in Russian)
2. Yarilin A.A. Immunology [Immunologiya]. Moscow: GEOTAR-Media; 2010. (in Russian)
3. De Monte L., Porcellini S., Tafi E., Sherkidan J. et al. EVA regulates thymus stromal organization and early thymocyte development. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007; 334-40.
4. Kuklina E.M. Molekuljarnye mehanizmy differencirovki timoci-tov. Ontogenez. 2003; 34 (5): 342-57. (in Russian)
5. Litvina M.M., Sharova N.I., Dzutsev A.Kh., Yarilin A.A. The combination of differentiation and apoptosis of human thymocytes with their co-cultivation with the epithelial cells of the thymus. Immunologiya. 2004; 1: 8-13. (in Russian)
6. Kong F.-K., Chen C. L., Cooper M. Thymic function can be accurately monitored by the level of recent T cell emigrants in the circulation. Immunity. 1998; 8: 97-104.
7. Hale L.P. Histologic and molecular assessment of human thymus. Ann. Diagn. Path. 2004; 8 (1): 50-60
8. Utsumi K., Sawada M., Narumiya S., Nagamine J., Sakata T., Iwagami S. et al. Adhesion of immature tymocites of thymic stromal cells through fibronectin molecules and its significance for the induction of thymocyte differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991; 8: 5685-9.
9. Eun N.L., Kyeong P.J., Lee J. Characterization of the expression of citokeratins 5, 8 and 14 in mouse thymic epithelial cells during thymus regeneration following acute thymic involution. Anat. Cell Biol. 2011; 44(1): 14-24.
10. Popa I., Zubkova I., Medvedovic M., Romantseva T., Mostowski H. et al. Regeneration of the adult thymus is preceded by the expansion of K5+K8+ epithelial cell progenitors and by increased expression of Trp63, cMyc and Tcf3 transcription factors in the thymic stroma. Int. Immunol. 2007; 19 (11): 1249-60.
11. Yarilin A.A., Donetsckova A.D. T-cells - recent emigrants from the thymus. Immunologiya. 2012; 6: 326-34. (in Russian)
12. Bogue M., Roth D.B. Mechanism of V(D)J recombination. Curr. Opin. Immunol. 1996; 8(2): 175-80.
13. Lorenzi A. R., Pattrson A. M., Pratt A. et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established metod. J. Immunol. Meth. 2008; 339: 185-94.
14. Loginova N.P., Chetvertnykh V.A., Khromtsova G.A. Morphological and immunohistochemical features of the structure of the thymus in newborn infants with congenital heart defects. Arkhiv patologii. 2013; 4: 9-14. (In Russian)
15. Manchester K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Biotechniques. 1996; 20 (6): 968-70.
16. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-AACt method. Methods. 2001; 25: 402-8.
17. Vandesompele J., De Peter K., Pattyn F. et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control gene. Genome Biol. 2002; 3 (7). Research 0034.
18. Erickson C.A. Neural crest: Origin, migration and differentiation. In: Encyclopedia of Life Science. London: Nature Publishing Group. 2011: 2084-100.
19. Kirby M.L., Waldo K.L. Role of neural crest in congenital heart disease. Circulation. 1990; 82 (2): 332-40.
Received 21.08.14
