CC BY
12
УДК 577.21: 597.553.2 DOI: 10.21323/2071-2499-2019-5-28-30 Табл. 5. Ил. 1. Библ. 10.
ОСОБЕННОСТИ ОТБОРА ПИШЕВОЙ ПРОДУКЦИИ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Минаев М.Ю., канд. техн. наук, Фомина Т.А., канд. техн. наук, Махова А.А. ФНЦ пищевых систем им В. М. Горбатова
Ключевые слова: ПЦР, секвенирование, отбор проб, идентификация видового состава, фальсификация
Реферат
Описаны общие требования к отбору проб для проведения молекулярно-диагностических исследований методами ПЦР и секвенирования. Рассмотрены особенности этой процедуры, обозначена взаимосвязь точности получаемых результатов с выбранным методом отбора проб. Предложена схема отбора пищевой продукции для молекулярно-диагностических исследований.
SAMPLING FEATURES OF FOOD PRODUCTS FOR MOLECULAR DIAGNOSTIC STUDIES
Minaev M.Yu., Phomina T.A., Makhova A.A.
Gorbatov Research Center for Food Systems
Key words: PCR, sequencing, sampling,identification of the species composition, falsification
Summary
The article describes the general requirements for sampling for molecular diagnostic studies by PCR and sequencing. The features of this procedure are considered, the relationship between the accuracy of the results obtained and the selected sampling method is indicated. A scheme for the selection of food products for molecular diagnostic studies is proposed.
Молекулярно-диагностические методы исследования являются высокоспецифичными и чувствительными, что определяет их использование в современной лабораторной практике [1, 2, 3]. При этом точность и воспроизводимость получаемых результатов в первую очередь зависит от выбранного алгоритма выборки образцов и метода отбора проб [4, 5]. При анализе видового (сырьевого) состава пищевого продукта или детекции в нём патогенов часто возникают проблемы неправильного отбора образцов [6, 7]. Например, в лабораторию может поступить образец в рамках производственного контроля с целью проведения определения видового состава сырья, который не является репрезентативным для исследуемой партии, что напрямую может привести к некорректным результатам. Такие результаты не могут быть распространены на всю партию, а также использованы для сравнения с ранее полученными результатами на эту же партию.
Как известно, для выбора метода отбора проб очень важно правильно идентифицировать объект и определить цель исследования. Всё многообразие продукции, выпускаемой мясоперерабатывающими предприятиями, и её классификация в зависимости от направления использования, назначения и технологии изготовления отражено в ГОСТ 33102-2014. Термины и определения понятий в области мясной промышленности, касающиеся пищевых продуктов убоя и продуктов их переработки, получаемые в промышленных условиях и представленные в ГОСТ Р 52427-2005,
позволяют идентифицировать объект исследования [8].
Однако специалисты, которые проводят отбор проб для молекулярно-биоло-гических исследований, сталкиваются с тем, что существующие методы отбора проб для конкретного вида продукции не всегда учитывают специфику проведения таких исследований. Поэтому при отборе проб пищевой продукции для исследования молекулярно-диагности-ческими методами необходимо руководствоваться следующими принципами.
Отбор образцов (проб) должен осуществляться в присутствии представителя хозяйствующего субъекта, имеющего отношение к отбираемой пищевой продукции, лицами, требования к квалификации которых установлены законодательством государств - членов Союза, в качестве которых могут выступать:
а) при проведении обязательной оценки соответствия пищевой продукции требованиям технических регламентов - заявитель либо уполномоченное заявителем лицо, в качестве которого могут выступать включённые в единый реестр органов по оценке соответствия Союза аккредитованный орган по сертификации, область аккредитации которого распространяется на пищевую продукцию, или аккредитованная испытательная лаборатория (центр), область аккредитации которой предусматривает отбор образцов (проб), либо иная испытательная лаборатория;
б) представители органов государств-членов, уполномоченных на осуществление государственного контроля (надзора). Привлечение аккредито-
ванной испытательной лаборатории (центра) осуществляется в случаях, предусмотренных законодательством государств-членов в сфере государственного контроля (надзора). Отбор образцов (проб) осуществляется в соответствии с программой исследований (испытаний) и измерений, разрабатываемой уполномоченным лицом.
При проведении исследований (испытаний) и измерений пищевой продукции с высокой долей вероятности её неоднородности и значительным варьированием значений определяемых показателей (например, партии субпродуктов) применяется эмпирический (точечный) отбор образцов (проб), позволяющий характеризовать качество и однородность отобранной пищевой продукции.
При проведении исследований (испытаний) и измерений партии пищевой продукции с высокой степенью однородности (например, партии мясного фарша) отбирается объединённая проба.
При формировании объединённой пробы и выделении из неё средней пробы количество и масса отбираемых образцов (проб) должны быть достаточными для создания контрольной и лабораторной проб [9].
Анализ соответствующих документов показывает, что отсутствует регламентирование очерёдности исследования контрольной и лабораторной проб, и, как правило, контрольную пробу исследуют, если возникает спорный случай. Однако это - неверный подход. Контрольная проба должна исследоваться параллельно с лабораторной в другой лаборатории. При таком подходе можно будет оценить точность,
ВСЁ О МЯСЕ № 5 | 2019
стандартное отклонение и другие важные метрологические характеристики проведённого исследования, что имеет важное значение при возникновении спорных случаев. Более того, отсутствует риск исследования пробы за пределами срока годности исследуемого продукта.
При отборе образцов (проб) необходимо проводить внешний осмотр, идентификацию пищевой продукции, оценку условий её хранения. При внешнем осмотре пищевой продукции оценивается внешний вид потребительской упаковки (тары) (далее - упаковка (тара)) единиц пищевой продукции, попадающих в выборку, и (или) пищевой продукции, содержащейся в выборочных единицах, которая условно подразделяется на:
а) нормальную (при осмотре не обнаружено отклонений, вызванных физическими, химическими факторами или развитием микроорганизмов);
б) подозрительную (при осмотре обнаружены одно или несколько отклонений, которые могли возникнуть как вследствие физического воздействия, микробной порчи, так и вследствие химических и биохимических реакций в пищевой продукции);
в) испорченную (при осмотре обнаружены явные дефекты упаковки (тары) и (или) пищевой продукции (бомбаж, хлопуши, брожение, плес-невение, гниение, ослизнение, прокисание)) [9].
Исследованию по изложенным правилам подлежит только продукция, относящаяся к категории а) нормальная. Тем не менее при установлении видовой идентификации можно исследовать и другие 2 группы продукции, т. к. ДНК устойчива к процессам биологической деградации.
При выборе метода отбора проб немаловажным является организация правильной выборки проб. Принципы выборки проб от партии наиболее полно описаны лишь для продукции из рыб, а именно в ГОСТ 31339-2006 «Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приёмки и методы отбора проб» [10]. В таблице 1 приведены объёмы выборки в зависимости от объёма партии.
На наш взгляд, такие объёмы партий более характерны для потребительской тары, а число выборки тары при этом занижено. Так, в Европейском Союзе
действуют следующие нормы выборки, изложенные в Commission Regulation (EC) № 1688/2005 (таблицы 2, 3, 4).
При этом в ГОСТ 31339-2006 описан объём отбираемых проб с одной упаковки в зависимости от массы рыбы в упаковке (таблица 5).
Компиляция этих нормативов, на наш взгляд, позволяет проводить более представительную выборку проб для широкого круга продукции как мясной, так и рыбной.
Здесь также стоит отметить, что состав мясной и рыбной продукции неодноро-
Объём выборки в зависимости от
ден, и по существующим рекомендациям отбирать и исследовать необходимо точечные пробы, так же как и в микробиологии. На сегодняшний день ПЦР анализ является дорогим видом исследований. Поэтому важно разработать такой алгоритм выбора исследуемых показателей, которые бы не только подтверждали наличие искомого вида, но и отсутствие незаявленных видов.
Исходя из этого, мы предлагаем следующую схему отбора пищевой продукции для молекулярно-диагностических исследований (рисунок 1).
Таблица 1
объёма партии по ГОСТ 31339-2006
Объём партии (число транспортной тары с продукцией) Объём выборки (число отбираемой транспортной тары с продукцией)
от 2 до 150 включ. 2
151-280 3
281-500 4
501-1200 5
1201-3200 7
3201-10000 10
10001-35000 15
Св. 35001 20
Таблица 2 Объём выборки в зависимости от объёма партии согласно директивам ЕС
Объём партии продукции, упакованной в транспортную/групповую упаковку в шт. Объём выборки в шт.
2-9 2
10-24 4
25-49 8
50-99 12
100-499 16
500 и более 20
Таблица 3
Объём выборки в зависимости от массы транспортной/групповой упаковки
Масса одной единицы транспортной тары
Поправочный коэффициент
> 20 кг *1,0
10-20 кг
*3/4
Количество точечных проб
Количество отбираемых точечных проб с одной упаковки
> 20 кг 10-20 кг
4 2
Масса одной единицы транспортной тары
Масса/объём отбираемых точечных проб с одной упаковки в зависимости от массы экземпляра рыбы в упаковке
< 10 кг
*1/2
Таблица 4
< 10 кг
1
Таблица 5
Масса экземпляра рыбы в упаковке
Масса/объём отбираемых точечных проб с одной упаковки
0,1 кг более 0,1 более 0,5
и менее до 0,5 кг до 1,0 кг
от 0,3 от 0,6 от 1,5
до 0,5 кг до 3,0 кг до 3,0 кг
более 1,0 кг
в виде поперечных кусков, вырезанных у приголов-ков (сама голова рыбы)
2019 | № 5 ВСЁ О МЯСЕ
При этом, исследуя объединённую пробу, как и в случае с ГМО, ключевым видом анализа является скрининговый. В отличие от мясной продукции рыбная может быть представлена более чем 100 видами рыб. Подтверждать наличие каждого из них нецелесообразно.
При выявлении ГМО в растительной продукции в первую очередь выявляют наличие репортёрных генов, как правило, являющихся промотерами или терминаторами генов-вставок. При исследовании рыбной продукции можно делать скри-нинговый анализ по родам и генетиче-
ским группам.Так, при исследовании продукции, произведённой из тресковых рыб, необходимо подтвердить наличие следующих родов: Gadus, Theragra, Melanogrammus, Pollachius и Merlangius. И только после установления родового состава можно приступать к выявлению видового.
Таким образом, в отсутствие методических документов для проведения молекулярно-диагностических исследований грамотное составление плана выборки проб из партии и алгоритма выбора исследуемых показателей позволит отобрать представительную часть исследуемой партии и получить точный и воспроизводимый результат.
© КОНТАКТЫ:
Минаев Михаил Юрьевич а mminaev@inbox.ru Фомина Татьяна Алексеевна а fomina1032@yandex.ru Махова Анжелика Александровна а a.mahova@fncps.ru
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
REFERENCES:
1. Medlin, L. K. Molecular Techniques for the Detection of Organisms in Aquatic Environments, with Emphasis on Harmful Algal Bloom Species / L. K. Medlin, J. Orozco // Sensors (Basel). — 2017. — V. 17 (5). — P. 1184-1205. D0I:10.3390/s17051184.
2. Kumar, A. Identification of species origin of meat and meat products on the DNA basis: a review / A. Kumar, R. R. Kumar, B. D. Sharma, P. Gokulakrishnan, S. K. Mendiratta, D. Sharma // Critical reviews in food science and nutrition. — 2015. — V. 55 (10). — P. 1340-1351. DOI: 10.1080/10408398.2012.693978.
3. Abrishami, M. PCR detection and identification of bacterial contaminants in ocular samples from post-operative endophthalmitis / M. Abrishami, B. Hashemi, M. Abrishami, K. Abnous, K. Razavi-Azarkhiavi, J. Behravan // Clin Diagn Res. — 2015. — V. 9 (4). — NC01-NC3. D0l:10.7860/JCDR/2015/I0291.5733.
4. Aprodu, I. Advanced sample preparation for the molecular quantification of Staphylococcus aureus in artificially and naturally contaminated milk / I. Aprodu, G. Walcher, J. Schelin, I. Hein, B. Norling, P. Rädström, A. Nicolau, M. Wagner // International Journal of Food Microbiology. — 2011. — V. 145. — № 1. — P. 61-65.
5. Klancnik, A. PCR in food analysis / A. Klancnik, M. Kovac, N. Toplak, S. Piskernik, B. Jersek // In book: Polymerase chain reaction, Edition: First, Chapter: PCR in food analysis, Publisher: InTech, Editors: Patricia Hernández-Rodríguez, Arlen Patricia Ramirez Gomez, 2012. — P. 195-220. DOI: 10.5772/38551.
6. Lantz, P. G. Sample preparation methods in PCR-based detection of food pathogens / P. G. Lantz, B. Hahn-Hagerdal, P. Radstrom // Trends in Food Science and Technology. — 1994. — V. 5. — № 12. — P. 384-389.
7. Hill, W. E. The polymerase chain reaction: applications for the detection of foodborne pathogens / W. E. Hill // Critical Reviews in Food Science and Nutrition. — 1996. — V. 36. — № 1-2. — P. 123-173.
8. Батаева, Д. С. Анализ зависимости результатов микробиологических иссле- Batayeva, D.S. Analiz zavisimosti rezul'tatov mikrobiologicheskikh issledovaniy ot дований от методов отбора проб мяса и мясных продуктов / Д. С. Батаева, metodov otbora prob myasa i myasnykh produktov [Analysis of the dependence of А. А. Махова // Все о мясе. — 2017. — № 2. — С. 43-45. the results of microbiological studies on methods of sampling meat and meat prod-
ucts] / D. S. Batayeva, A. A. Makhova // Vsyo o myase. — 2017. — № 2. — P. 43-45.
9. Об отборе образцов (проб) для проведения исследований (испытаний) и измерений пищевой продукции при применении и исполнении требований технических регламентов Евразийского экономического союза. Коллегия ЕЭК. Рекомендация от 31.07.2018 № 13.
Ob otbore obraztsov (prob) dlya provedeniya issledovaniy (ispytaniy) i izmereniy pishchevoy produktsii pri primenenii i ispolnenii trebovaniy tekhnicheskikh reglamen-tov Yevraziyskogo ekonomicheskogo soyuza. Kollegiya Yevraziyskoy ekonomicheskoy komissii. Rekomendatsiya ot 31.07.2018 № 13. [Testing and testing of food products in the application and compliance with the requirements of the rules of the Eurasian Economic Union. Collegion of the Eurasian Economic Commission. Recommendation dated 07.31.2018 № 13].
10. ГОСТ 31339-2006 «Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила при- GOST 31339-2006 «Ryba, nerybnyye ob"yekty i produktsiya iz nikh. Pravila priyemki ёмки и методы отбора проб». i metody otbora prob» [GOST 31339-2006 «Fish, non-fish objects and products from
them. Acceptance rules and sampling methods»].
ВСЁ О МЯСЕ № 5 I 2019
