CC BY
142УДК 616.992.282:582.282.123.4:616-006
ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГАЛАКТОМАННАНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И БРОНХОАЛЬВЕОЛЯРНОМ ЛАВАЖЕ ОНКОГЕМАТО-ЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ С ИНВАЗИВНЫМ АСПЕРГИЛЛЕЗОМ. СОБСТВЕННЫЕ ДАННЫЕ И ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1 Игнатьева С.М. (в.н.с.)*, 1 Спиридонова
B.А. (н.с.), 1 Богомолова Т.С. (зав. лаб.), 2Шадривова О.В. (аспирант), 1 Десятик Е.А. (аспирант), 1 Борзова Ю.В. (зав. микологической клиникой), 2 Хостелиди
C.Н. (ассистент кафедры), 3 Волкова А.Г. (пульмонолог),3 Попова М.О. (врач-гематолог), 4 Зюзгин И.С. (зав. отд.), 5Колбин А.С. (врач-гематолог), 4 Климович А.В. (зав. отд.), 3 Зубаровская Л.С. (зав. отд.), 3 Афанасьев Б.В. (директор), 1 Васильева Н.В. (директор), 2 Климко Н.Н. (зав. кафедрой)
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: 1 НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина и 2 Кафедра клинической микологии, аллергологии и иммунологии; 3 Институт детской гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова; 4Ленинградская областная клиническая больница; 5Детская городская больница №1, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2013
Комплексное определение галактоманнана (ГМ) в сыворотке крови и бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ-образцах) помогло увеличить чувствительность теста «Platelia Aspеrgillus EIA» с 65 до 89%. Положительные результаты данного теста коррелировали с позитивными результатами классических микологических исследований в 30% (культуральных) и в 60% (микроскопических) случаев. Показано, что чувствительность теста «Platelia AspеrgiUus EIA», определяющего галактоманнан, зависит от типа биологического образца и варьирует у разных групп онкоге-матологических больных.
Ключевые слова: бронхоальвеолярный лаваж, галактоманнан, инвазивный аспергиллез легких, онкогематологические заболевания
PECULIARITIES OF GALACTOMANNAN DEFINITION IN BLOOD SERUM AND BRONCHO-ALVEOLAR LAVAGE AT ONCOHEMATOLOGICAL PATIENTS WITH INVASIVE ASPERGILLOSIS. OWN DATA AND REVIEW OF LITERATURE
1 Ignatyeva S.M. (leading scientific collaborator), 1 Spiridonova V.A. (scientific collaborator), 1 Bogomolova T.S. (head of the laboratory), 2 Shadrivova O.V. (postgraduate student), 1 Desyatik EA (postgraduate student), 1 Borzova Ju.V. (head of the mycological clinic), 2 Khostelidi S.N. (assistant of the chair), 3 Volkova, A.G. (pulmonologist), 3 Popov M.O. (hematologist), 4 Zjuzgin I.S. (head of the department), 5 Kolbin A.S. (hematologist), 4 Klimovich A.V. (head of the department), 3 Zubarovskaya P.S. (head of the department), 3 Afanasyev B.V. (director), 1Vasilieva N.V. (director), 2 Klimko N.N. (head of the chair)
North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov: 1Kashkin Research Institute of Medical Mycology and 2Chair of Clinical Mycology, Allergology and Immunology; 3R.M. Gorbacheva Institute of Children's Hematology and Transplantology of I.P. Pavlov State Medical University; 4Leningrad regional Clinical Hospital; Children's City Hospital №1, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2013
A comprehensive definition of galactomannan in the blood serum and samples of bronchoalveolar lavage allowed to increase the sensitivity of the test from 65 to 89%.Positive test results of «Platelia Aspеrgillus EIA» correlated with positive results of classical mycological researches in 30% (culturul) and 60 % of cases (microscopic).The sensitivity of «Platelia Aspеrgillus EIA» test, which determines the galactomannan, depends from the type of biological sample and varies at different groups of oncohematological patients.
Key words: bronchoalveolar lavage, galactomannan, invasive pulmonary aspergillosis, oncohematological diseases
* Контактное лицо: Игнатьева Светлана Михайловна, тел.: (812) 303-51-44
ВВЕДЕНИЕ
Инвазивный аспергиллез (ИА) - одна из причин летальных исходов у иммунокомпрометирован-ных больных. У онкогематологических пациентов в Санкт-Петербурге ИА составляет от 60 до 88% от всех инвазивных микозов [1, 2]. Прогноз заболевания зависит от ранней диагностики, а также своевременной и эффективной терапии. В настоящее время диагностика ИА основывается на оценке факторов риска и клинических признаков развития заболевания, а также результатов исследований: микологических (прямая микроскопия и посев биосубстратов больных на питательные среды), радиологических - в режиме высокого разрешения (компьютерная и магнитная резонансная томографии), цитологических и/или гистологических (биопсийного материала). Согласно рекомендациям EORTC/MSG 2008 [3] определение галактоманнанового (ГМ) антигена Aspergillus spp. включено в состав микробиологических критериев диагностики ИА.
Цель данного исследования - оценить диагностическую значимость теста «Platelia-Aspergillus EIA» для определения галактоманнана в биологическом материале у различных категорий онкогематологи-ческих больных в Санкт-Петербурге.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Изучали биологический материал, полученный в ходе первого в РФ крупного многоцентрового исследования пациентов из 19 многопрофильных стационаров Санкт-Петербурга (1998-2013 гг.). Для диагностики ИА использовали критерии EORTC/MSG 2008 [3]. Всем пациентам выполняли компьютерную томографию внутренних органов и магнитно-резонансную томографию головного мозга, а также фибробронхоскопию легких с взятием бронхоаль-веолярного лаважа (БАЛ). Осуществляли микроскопическое и культуральное исследования мокроты, БАЛ, спинномозговой жидкости (СМЖ), промывных вод придаточных пазух носа. Микроскопию образцов проводили в 10% КОН с глицерином с последующим окрашиванием флюоресцирующим реагентом - калькофлюором белым. Окрашенные препараты исследовали в люминесцентном микроскопе при увеличении х400 и х200 на наличие мицелия, ветвящегося под углом 45 Для посева биологического материала применяли Сабуро агар с 2% глюкозы.
Определение ГМ в биологическом материале онкогематологических больных с ИА выполняли c помощью коммерческой иммуноферментной тест-системы «Platelia-Aspergillus EIA» («Bio-Rad Laboratories», США), основанной на «сэндвич»-варианте ИФА с использованием крысиных моноклональных антител ЕВА-2 к ГМ Aspergillus spp., сорбированных на микропланшете, а также меченных пероксидазой и входящих в состав конъюгата. Предобработку исследуемых образцов и постановку ИФА проводили согласно инструкции к набору. Учет результатов те-
ста осуществляли спектрофотометрически при длине волны 450 нм и 620/630 нм, подсчитывая индекс оптической плотности (ИОП) образцов по отношению к контрольному образцу cut-off, содержащему 1 нг/мл ГМ. Результаты теста считали положительными при ИОП >0,5 для сыворотки крови и СМЖ, а также >1,0 - для БАЛ-образцов.
Изучено 356 образцов - 177 сывороток крови, 164 образца БАЛ и 15 образцов СМЖ, взятых от 152 онкогематологических больных c «доказанным» и «вероятным» ИА, подтвержденным гистологическими или микологическими исследованиями. Из них 94% составляли взрослые пациенты (мужчины - 55% и женщины - 45%) в возрасте от 19 до 71 года (медиана - 46 лет) и 6% - дети (мальчики - 54% и девочки - 46%) в возрасте от 7 до 15 лет (медиана - 14,5 лет). Основными заболеваниями у гематологических пациентов с ИА были: острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) - 28%, неходжинская лимфома (НХЛ) -19%, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) - 18%), лимфома Ходжкина (ЛХ) - 8%, множественная миелома (ММ) - 7%, хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) - 6%, миелодиспластический синдром (МДС) - 6%, другие гемобластозы выявляли в 8% случаев.
В качестве контрольных использовали 200 образцов от онкогематологических пациентов без ИА. В контрольной группе больных гематологическими заболеваниями были: НХЛ - 37%, ОМЛ - 28%, ОЛЛ - 10%, ЛХ - 9%, МДС - 6%, ХЛЛ - 5% и ММ - 5% . Пациенты данной группы не отличались от больных с ИА по демографическим характеристикам.
Оценку чувствительности, специфичности, прогностических значений положительного и отрицательного результатов проводили по формулам:
чувствительность (%) = ИПх100 ИП+ЛО
специфичность (%) = ИОх100 ИО+ЛП
прогностическая ценность положит. результата (%)= ИПх100
ИП+ЛП
прогностическая ценность отрицат. результата (%)=ИОх100
ИО+ЛО,
где ИП - количество положит. результатов у пациентов с ИА, подтвержденным гистологическими и/или микологическими исследованиями;
ИО - количество отриц. результатов у пациентов контрольных групп без ИА;
ЛП - количество ложноположительных результатов у пациентов контрольных групп больных без ИА;
ЛО - количество ложно отрицательных результатов у пациентов с подтвержденным ИА.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы STATISTICA 6,0; различия считали достоверными при уровне значимости p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Среди пациентов с ИА 94% составляли больные с аспергиллезом легких, 7% - аспергиллезным синуситом, 6% - аспергиллезом ЦНС; поражение более 2 органов зарегистрировали у 12%.
При исследовании сыворотки крови онкогема-тологических пациентов с «доказанным» и «вероятным» ИА чувствительность теста «РХаХеМа-Азрв^й-1ш Е1А» составляла 65,0%, а специфичность - 79,0% (табл.1).
Таблица 1.
Характеристики теста «Platelia-Aspergillus EIA» при исследовании сыворотки крови онкогематологических больных ИА (95% ДИ)
Критерии ИА Чувствительность Специфичность Прогностическое значение (+) результата Прогностическое значение (-) результата
Доказанный ИА* (n=9) 0,51 (0,49-0,58) 0,81 (0,72-0,87) 0,67 (0,62-0,77) 0,91 (0,83-0,98)
Вероятный ИА** (n=143) 0,70 (0,59-0,77) 0,78 (0,69-0,84) 0,85 (0,78-0,97) 0,83 (0,78-0,91)
Доказанный и вероятный ИА (n=152) 0,65 (0,53-0,71) 0,79 (0,70-0,85) 0,75 (0,71-0,87) 0,86 (0,83-0,88)
Локализация ИА Чувствительность теста, %
Легкие 62,8
ЦНС 73,0
Придаточные пазухи носа 57,7
Легкие + ЦНС 72,7
Легкие + Придаточные пазухи носа 70,0
> 2 органов 83,3
ИА легких
Аспергиллез. синусит
ИА ЦНС
О
20
40
60
100
Примечание: ДИ - доверительный интервал.
* - диагноз ИА подтвержден гистологическими исследованиями
** - диагноз ИА подтвержден классическими микологическими исследованиями.
Проведенными нами исследованиями показано, что чувствительность теста «Platelia Aspergillus EIA» в сыворотке крови онкогематологических больных зависела от клинических форм ИА, типа биологического материала, а также варьировала у групп пациентов с различными факторами риска развития ИА. При определении ГМ в сыворотке крови установили положительные результаты теста у 63% больных аспергиллезом легких, у 58% - аспергиллезным синуситом и у 73% - аспергиллезом ЦНС. Чувствительность ГМ-теста зависела от распространенности ИА, возрастая (р=0,032) при двух и более локализациях ИА до 83,3% (табл. 2).
Таблица 2
Влияние распространенности ИА на чувствительность ГМ-теста
■ Дети ■ Взрослые
Рис.1. Определение галактоманнана в сыворотке крови онкогематологических больных с различными локализациями ИА
При определении галактоманнана в различных биосубстратах больных ИА тест имел различную чувствительностью в зависимости от типа образца. Величина ГМ-индекса составляла: для сыворотки крови - 0,5-2,7, СМЖ - 0,5-2,0 и БАЛ-образцов - 1,0-7,5. При сопоставлении положительных результатов теста в сыворотке крови и БАЛ выявили увеличение его чувствительности при исследовании БАЛ-образцов на 12,0% (табл. 3), а при комплексном определении ГМ в сыворотке крови и БАЛ-образцах чувствительность теста возросла до 89% (р=0,014).
Таблица 3.
Характеристики теста «Platelia-Asperдillus EIA» в различных биосубстратах от больных (95% ДИ)
Образцы Чувствительность Специфичность Прогностиче-кое значение (+) результата Прогностическое значение (-) результата
Сыворотка крови (n=177) 0,65 (0,53-0,71) 0,79 (0,70-0,85) 0,77 (0,71-0,87) 0,86 (0,83-0,88)
БАЛ (n=164) 0,77 (0,69-0,89) 0,86 (0,74-0,88) 0,85 (0,79-0,94) 0,83 (0,79-0,96)
Сыворотка крови+БАЛ (n=341) 0,89 (0,82-0,93) 0,91 (0,88-0,95) 0,90 (0,86-0,96) 0,90 (0,87-0,94)
При сравнительном анализе определения ГМ в сыворотке крови детей и взрослых с ИА показано, что у детей с ИА легких ГМ выявляли достоверно чаще, чем у взрослых пациентов (78% У8. 67%) (р=0,024), в то время, как результаты теста при вне-легочной локализации ИА (синусит, ЦНС) были сопоставимыми (Рис. 1).
При микологическом исследовании биологического материала онкогематологических пациентов с ИА этиологическими агентами ИА у детей были: A. fumigatus - 55%, A. niger - 30%, A. flavus - 15% и A. terreus - 15%; у взрослых: A. fumigatus - 45%, A. niger
- 35%, A. flavus - 17%, A. ochraceus - 2%, A. versicolor
- 1%.
При сравнительном анализе результатов микологических методов диагностики ИА и ГМ теста была выявлена корреляция положительного результата микроскопической и культуральной диагностики БАЛ-образцов с положительным результатом ГМ-теста в БАЛ и сыворотке крови в 60% и 30%, соответственно. При этом у гематологических пациентов с ИА высокие значения ГМ-индекса (>2,0) обнаруживали в БАЛ-образцах с положительным результатом микроскопического исследования чаще, чем в
образцах с положительным высевом культуры гриба (Рис.2).
I Отрицательная микроскопия или выделение культуры
I Положительная микроскопия или выделение культуры
Рис. 2. Микологическое исследование ГМ-позитивных БАЛ-образцов (n=164). 1 - результаты прямой микроскопии;
2 - результаты посева
При изучении чувствительности ГМ-теста у пациентов с ИА, получающих глюкокортикостероид-ную терапию (92,3% - взрослые и 7,7% - дети), обследовали 341 биосубстрат - 177 сывороток и 164 БАЛ-образца. В исследование были включены 175 образцов от больных ИА, получающих ГКС, и 166 образцов - от пациентов с ИА, не получающих гормоны. Установили, что галактоманнан в биосубстратах пациентов, получающих ГКС, регистрировали достоверно чаще, чем у лиц, не получающих гормоны (72% vs. 56%, P=0,025), особенно - у взрослых пациентов, по сравнению с детьми (82,4% vs. 64,2%, P=0,005). В то же время, высокие значения ГМ-индекса в БАЛ (>2,0) отмечали достоверно чаще у детей, чем у взрослых (55,3% vs. 24,6%, P=0,001). При микологическом исследовании мокроты или БАЛ-образцов пациентов с ИА, получающих и не получающих ГКС, количество положительных находок мицелия Aspergillus spp. при микроскопии не различалось, но, при этом, наблюдали достоверное возрастание числа положительных высевов грибов на питательных средах и у детей, и у взрослых (40,0% vs. 20,0% и 53,8% vs. 35,3%, соответственно). На фоне приема ГКС также значительно расширялся спектр возбудителей инвазивного аспергиллеза (Рис. 3, 4).
Ш Ajumigotijs О A,niger □ A,fbvus
D A. versicolor MA.ochraceus □ Л. usfus Рис. 3. Спектр возбудителей ИА у пациентов. получающих ГКС
Рис. 4. Спектр возбудителей ИА у больных, не получающих ГКС
Среди включенных в исследование онкогематологических больных с ИА 58,7% составляли пациенты, получающие цитостатическую полихимиотерапию (ПХТ) и 42,3% - реципиенты ТГСК. Среди возбудителей ИА в группе пациентов с ПХТ были: A. fumigatus - 45%, A. niger - 45% и A. flavus - 10%, а у реципиентов ТГСК из биосубстратов выделяли культуры A. fumigatus - 45%, A. flavus - 45%, A. niger - 5% и A. nidulans - 5%. При определении галактоманна-на в 187 образцах больных ИА, получающих ПХТ, и 154 образцах больных ИА после ТГСК не выявили в сыворотке крови и БАЛ-образцах взрослого контингента пациентов статистически значимых различий (58% vs. 60% и 72% vs. 73%,соответственно) в чувствительности теста (Рис. 5, 6).
J?
f
£
J>
#
Взрослые
Дети
Рис.5. Определение галактоманнана у онкогематологических больных ИА после ПХТ
(N 60
20
Рис.6. Определение галактоманнана у онкогематологиче-ских больных после ТГСК
В то же время, позитивные результаты ГМ-теста в БАЛ-образцах детей с ИА после ПХТ обнаруживали чаще, чем в группе детей с ИА после ТГСК (91% vs. 63%, P=0,002). У больных с ПХТ высокий уровень ГМ индекса в БАЛ-образцах (2,0-7,5) регистрировали у детей достоверно чаще, чем у взрослых (60% vs. 23%, P=0,012), а у пациентов после ТГСК - с одинаковой частотой.
Специфичность теста составляла 81%. Прогностическое значение положительного и отрицательного результатов ГМ-теста у больных ИА после ПХТ и после ТГСК в сыворотке крови было 0,77 (95%ДИ 0,71-0,87) и 0,86 (95%ДИ 0,83-0,88), а для БАЛ-образцов - 0,85 (95%ДИ 0,79-0,94) и 0,84 (95%ДИ 0,78-0,96) соответственно.
ОБСУЖДЕНИЕ
ИА наиболее часто выявляют у пациентов с ней-тропенией или после приема иммунодепрессантов (трансплантация костного мозга), или кортикосте-роидов. Диагностика ИА, особенно на ранних стадиях заболевания, часто основана на неспецифических диагностических или рентгенологических признаках (клинические симптомы, данные КТ и МРТ и т.д.), посевы биоматериалов не всегда положительны, при этом тест на ГМ-антиген, представляющий собой иммунологический метод, может улучшить лабораторную диагностику ИА [4, 5]. В настоящее время определение ГМ Aspergillus spp. у онкогематологических больных включено в качестве микробиологического критерия в EORTC/MSG 2008 классификации ИА [3]. Совместно с другими диагностическими процедурами (компьютерная томография внутренних органов, классические микологические, цитологические и гистологические методы исследования биосубстратов и биоптатов больных), тест «Platelia Aspergillus EIA» широко используют в онкогематологических стационарах для диагностики ИА в сыворотке крови больных [4, 5].
Циркуляция ГМ в сыворотке крови является временной, поэтому тестирование образцов необходимо проводить не реже 2 раз в неделю для больных с высоким риском развития ИА. Индекс оптической плотности (ИОП) cut-off для положительных результатов в сыворотке крови составляет 0,5, и его измеряют в 2-х последовательных образцах [6]. При тестировании ГМ-антигена в сыворотке крови получили многообещающие результаты в нескольких клинических испытаниях [7, 8]. В них была получена 90-100% специфичность и 80-100% чувствительность теста у пациентов с гранулоцитопенией, при этом отрицательная прогностическая ценность теста для исключения ИА была очень высока (>90%). Анализ на наличие ГМ может быть полезен как при клиническом подозрении на грибковую инфекцию, так и для мониторинга терапевтического эффекта антимикотической терапии. Как было показано в ходе проспективных клинических испытаний [9, 10], рефрактерная антибактериальная лихорадка может быть признаком ИА, в этом случае регулярное назначение ГМ-теста в течение 3 дней, после 4 дней сохраняющейся лихорадки, вместе с клиническими и рентгенологическими обследованиями пациентов, признано эффективным [9, 11, 12].
ГМ Aspergillus spp. может быть обнаружен не только в сыворотке крови, но и в других биологических жидкостях, в том числе в БАЛ и в СМЖ, в которых определение антигена превосходит культу-ральную диагностику и некоторые ПЦР-тесты для выявления ИА [5]. В последние годы появились сообщения об эффективности выявления ГМ в брон-хоальвеолярном лаваже у больных с трансплантацией костного мозга [13, 14]. Однако вопросы оценки результатов исследования БАЛ-образцов с помощью теста «Platelia Aspergillus EIA» широко обсуждают в научной литературе. Одни авторы считают, что при И0П=0,5-1,0 тест имеет меньшую прогностическую ценность, чем при показателях, превышающих 1,0 [14, 15]. Другими исследователями в ходе мультицен-трового исследования показано, что уровень cut-off >0,5 для БАЛ является оптимальным у гематологических пациентов, при этом чувствительность и специфичность метода составляла 79,0 и 96%, соответственно [16]. Еще 2 мета-исследования [17, 18], включающих 13 и 30 клинических случаев, было проведено с целью оценки ГМ-теста для БАЛ-образцов в смешанной популяции пациентов (гематологические больные, пациенты с пересадкой органов, хронической обструктивной болезнью легких, опухолями солидных органов). В результате обоих исследований, ученые пришли к заключению о том, что определение ГМ в БАЛ имело большую чувствительность, чем в сыворотке крови, а с помощью бронхоскопии (полезной диагностической процедуры для оценки этиологии легочных инфильтратов) возможно тестирование ГМ в БАЛ у пациентов с высоким риском ИА. В 2013 г. была опубликована обзорная статья, посвященная мета-анализу 16 исследований, вклю-
чающих 783 взрослых пациентов только с гематологическими заболеваниями, для оценки точности ГМ-теста в БАЛ-образцах при диагностике ИА. Показано, что при ИОП>1,5 для доказанного и вероятного ИА тест имеет превосходную чувствительность (92%) и специфичность (98%) для того, чтобы при интерпретации результатов вместе с клиническими данными помочь в принятии решения в пользу подтверждения или исключении диагноза ИА. Авторы указывают также, что при комплексном использовании ГМ-теста в БАЛ и сыворотке крови или ПЦР в БАЛ можно дополнительно увеличить чувствительность метода, что согласуется с полученными нами данными [19]. В последнее время появилась перспектива использования новых технологий на основе иммунохроматографического метода - Aspergillus LFD kit (Olmmedical, Великобритания) - для определения антигена Aspergillus в биологических образцах от больных с подозрением на ИА. Данный тест относят к разряду тест-систем «у постели больного» и выполняют в течение 30 минут. В исследовании на 22 сыворотках крови больных показана более высокая специфичность теста по сравнению с тестом «Platelia Aspergillus EIA» [20]. В настоящее время тест проходит стадию мультицентрового испытания.
Учитывая разноречивость результатов клинических исследований и вариабельность оценки теста «Platelia Aspergillus EIA» в различных лабораториях мира, связанную с разнородностью анализируемых групп больных, различиями в методологиях исследований, а также отсутствием систематического анализа его точности, трудно оценить истинную клиническую полезность ГМ-теста в БАЛ-образцах в популяции гематологических пациентов. В связи с этим, мы предприняли попытку выявить особенности при определении галактоманнана в разных биологических образцах различных групп гематологических
больных Санкт-Петербурга. В своем исследовании мы руководствовались рекомендациями рабочей группы 3rd European Conference on Infections in Leukemia (25-26 сентября 2009 г., Juan-les-Pins-France), в которых определены для сыворотки крови значения ИОП cut-off >0,5 (в 2-х последовательных образцах) и ИОП cut-off >0,7 (для единичных образцов), ИОП cut-off >0,5 для СМЖ, а также cut-off >1,0 для БАЛ-образцов. Полученными нами данными, которые согласуются с результатами других авторов [10, 11, 13, 19], показано, как в популяции онкогематологиче-ских больных выбор групп обследуемых пациентов и биологического материала влияет на характеристики ГМ-теста. Некоторые результаты выявлены нами впервые: установлены корреляционные зависимости чувствительности теста с микологическими методами диагностики ИА, а также с величиной ИОП га-лактоманнана у различных категорий больных.
ВЫВОДЫ
1. Диагностические характеристики теста «Platelia Aspergillus EIA» (чувствительность, специфичность и прогностическое значение положительного результата) при исследовании БАЛ были выше, чем при исследовании сыворотки крови больных с ИА.
2. В период высокого риска развития ИА рекомендован мониторинг галактоманнана в сыворотке крови больных, а для подтверждения диагноза -определение галактоманнана в БАЛ.
3. Положительные результаты теста «Platelia As-pergillus EIA» коррелировали с положительными результатами классических микологических исследований в 30% (высев культуры) - 60% (прямая микроскопия) случаев. При положительном микроскопическом результате отмечали более высокие показатели ИОП в БАЛ и сывороточных образцах, чем при выделении культуры.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
l.
ПоповаМ.О., ЗубаровскаяЛ.С., Климко Н.Н. и др. Инвазивные микозы при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток// Тер. архив. - 2012. - №7. - С. 50-57.
Васильева Н.В., Климко Н.Н., Цинзерлинг В.А. Диагностика и лечение инвазивных микозов: современные рекомендации// Вестник СПбМАПО. - 2010. - Т.2, №4. - C. 5-18.
De Pauw B., Walsh T.J., Donnelly J.P., et.al. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Groups and the National Institute of Allergy and Infection Diseases Mycoses Study Group (EORTC/MSG) Consensus Group// Clin. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 46, №12. - P. 1813-21.
Erjavec Z. and Verweij P.E. Recent progress in the diagnosis of fungal infections in the immunocompromised host // Drug Resist. Updat. - 2002. - Vol. 5. - P. 3-10.
Yeo S.F. and Wong B. Current status of nonculture methods for diagnosis of invasive fungal infections // Clin. Microbiol. Rev. - 2002. - Vol. 15. - P. 465-484.
Marr K.A., Balajee S.A., McLaughlin L., et al. Detection of galactomannan antigenemia by enzyme immunoassay for the diagnosis of Invasive aspergillosis: variables that affect performance // J. Infect. Dis. - 2004. - Vol. 190, №3. - P. 641-649. Maertens J., Theunissen K.,Verbeken E., et al. Prospective clinical evaluation of lower cut-offs for galactomannan detection in adult neutropenic cancer patients and hematological stem cell transplant recipients //Br. J. Haematol. - 2004. - Vol. 126, №6. - P. 852-860.
Mennink-Kersten M.A., Donelly J.P., Verweij P.E. Detection of circulating galactomannan for the diagnosis and management of invasive aspergillosis // Lancet. Infect. Dis. - 2004. - Vol. 4, №6. - P. 349-357.
9. Maertens J., Theunissen K., Verhoef G., et.al. Galactomannan and computed tomography-based preemptive antifungal therapy in neutropenic patients at high risk for invasive fungal infection: a prospective feasibility study // Clin. Infect. Dis. - 2005. - Vol. 41, №9. - P. 1242-1250.
10. Maertens J., Buve K.,Theunissen K., et al. Galactomannan serves as a surrogate endpoint for outcome of pulmonary invasive
2.
S.
4.
5.
6..
7.
8.
sc
aspergillosis in neutropenic patients // Cancer. -2009. - Vol. 115, №2. - P. 355-362.
11. Pazos C., del PA. Early diagnosis of invasive aspergillosis in neutropenic patients with bi-weekly serial screening of circulating galactomannan by Platelia Aspergillus // Rev. Iberoam. Micol. - 2003. - Vol. 20, №3. - P. 99-102.
12. Girmenia C., Micozzi A., Gentile G., et al. Clinically driven diagnostic antifungal approach in neutropenic patients: a prospective feasibility study //J. Clin. Oncol. - 2010. - Vol. 28, №4. - P. 667-674.
13. Wheat L.J., Walsh T.J. Diagnosis of invasive aspergillosis by galactomannan antigenemia detection using an enzyme immunoassay // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 27, №4. - P. 245-251.
14. Hussain S., Paterson D.L., Studer S.M., et al. Aspergillus galactomannan antigen in the bronchoalveolar lavage fluid for the diagnosis of invasive aspergillosis in lung transplant recipients // Transplantation. - 2007. - Vol. 83, №10. - P. 1330-1336.
15. Gancy C., Jaber R.A., Leater H.L., et al. Bronchoalveolar lavage galactomannan in diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis among solid-organ transplant recipients // J. Clin. Microbiol. - 2007. - Vol. 45, №6. - P. 1759-1765.
16. Reinwald M., Spiess B., Heinz W.J., et al. Diagnosing pulmonary aspergillosis in patients with hematological malignancies: a multicenter prospective evaluation of an Aspergillus PCR assay and a galactomannan ELISA in bronchoalveolar lavage samples// Eur. J. Haematol. - 2012. - Vol. 89, №2. - P. 120-7.
17. Guo Y.L., Chen Y.Q., WangK., et al. Accuracy of BAL galactomannan in diagnosing invasive aspergillosis: a bivariate metaanalysis and systematic review// Chest. -2010. - Vol. 138. - P. 817-24.
18. Zou M., TangL., Zhao S., et al. Systematic review and metaanalysis of detecting galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid for diagnosing invasive aspergillosis// PLoS One. - 2012. - Vol. 7. - P. e43347.
19. Siow Chin Heg, Orla Morrissey, Sharon C-A Chen, et al. Utility of bronchoalveolar lavage fluid galactomannan alone or in combination with PCR for the diagnosis of invasive aspergillosis in adult hematology patients: A systematic review and meta-analysis// Crit. Rev. Microbiol. - 2013. - Early Online:1-11.
20. Persat F. New Aspergillus antigen detection LFD kit for the IPA diagnostic: What results with positive and negative galactomannan ELISA sera?// Mycoses. - 2013. - Vol. 56, Suppl. s4. - P. 85-86.
Поступила в редакцию журнала 18.12.2013
Рецензент: В.С. Митрофанов
УДК 577.2:615.076:616-002.828:611.24
МОЛЕКУЛЯРНОЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ
ВЫЯВЛЕНИЕ И
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
ПАТОГЕННЫХ
МИКРОМИЦЕТОВ
В МОКРОТЕ,
БРОНХОАЛЬВЕОЛЯРНОМ ЛАВАЖЕ И АУТОПСИЙНОМ МАТЕРИАЛЕ
1Михайлова Ю.В. (н.с.), 1Белоцерковская Е.В. (н.с.), 1Богомолова Т.С. (зав. лаб.), 1Борзова Ю.В. (зав. клиникой), 2Волкова А.Г. (врач-эндоскопист), 3,4Михайлов В.И. (врач-патологоанатом), 1Полищук А.Г. (зав. лаб.)*
1 НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СЗГМУ им. И.И. Мечникова; 2 Институт детской гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой СПб ГМУ им. И.П. Павлова; 3 Александровская больница; 4 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2013
Успех лечения больных микозами лёгких во многом зависит от ранней этиологической диагностики, которая часто проблематична при использовании традиционных методов анализа. Цель работы заключалась в разработке/модификации и апробации молекулярно-генетических методов для выявления и идентификации Aspergillus spp. и Zygomycetes у пациентов с мико-тической инфекцией легких. В работе представлена новая мультиплексная ПЦР в режиме реального времени (РВ) с анализом кривых плавления ПЦР продуктов высокого разрешения (HRM) для выявления и идентификации аспергиллов и зигомицетов. Представлены результаты применения молекулярных (два типа ПЦР-РВ, включая указанный выше, и ДНК-сиквенирование, в том числе - на прямую из клинического материала), микробиологических (микроскопия и посев) и серологического методов для анализа клинических образцов. Из результатов работы следует, что молекулярно-генетический анализ может предоставить важную информацию о видовой принадлежности возбудителя микотиче-ской инфекции легких.
Ключевые слова: аспергиллы, зигомицеты, идентификация, микоз легких, молекулярное выявление, HRM
Контактное лицо: Полищук Анна Генриховна, Тел.: (812) 303-51-40
MOLECULAR AND MICROBIOLOGICAL DETECTION AND IDENTIFICATION OF PATHOGENIC MICROMYCETES IN SPUTUM, BRONCHOALVEOLAR LAVAGE AND AUTOPSY MATERIAL
1 Mikhaylova Y.V. (scientific collaborator), 1 Belotcerkovskaya E.V. (scientific collaborator), 1 Bogomolova T.S. (head of the laboratory), 1 Borzova Y.V. (head of the clinic), 2 Volkova A.G. (physician-endoscopist), 3,4Mikhaylov V.I. (physician -pathologoanatomist), 1 Polischouk A.G. (head of the laboratory)
1 Kashkin Research Institute of Medical Mycology of North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov; 2 R.M. Gorbacheva Institute of Children's Hematology and Transplantology of St. Petersburg State Medical University named after I.P. Pavlov; 3 Alexandrov's Hospital; 4 St. Petersburg State University, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2013
The success of treatment of fungal infection of the lungs depends to a large extent on early etiological diagnostics, which is often problematic when conventional methods of analysis are used. The aim of the study was to establish/modify and test the molecular genetic methods for detection and identification of Zygomycetes and Aspergillus spp. In this paper we present a new multiplex PCR with High Resolution Melt (HRM) analysis for the detection and identification of Zygomycetes and Aspergillus spp. and the results of the analysis of clinical samples obtainedfrom patients with mycotic infection of the lungs. Samples from the patients were analyzed using molecular (two kinds of real-time PCR, including one indicated above and DNA sequencing), microbiological (microscopy and culture), and serological methods. The results of the work indicate that the molecular genetic analysis can provide important information about species affiliation of the etiologic agent of mycotic infection of the lungs.
Key words: Aspergillus spp., HRM, identification, molecular detection, mycosis of lungs, Zygomycetes
ВВЕДЕНИЕ
Микозы легких (МЛ) - тяжелые заболевания, развивающиеся преимущественно у иммунокомпро-метированных больных [1]. Основными этиологическими агентами МЛ являются грибы рода Aspergillus и порядка Mucorales (Rhizopus, Mucor, Rhizomucor, Lichtheimia, Cunninghamella), значительно реже - из родов Fusarium, Scedosporium, Cryptococcus и др. Известны также легочные формы эндемичных мико-
