CC BY
87
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2009 Биология Вып. 10 (36)
Физиология растений
УДК 581.1
ОСОБЕННОСТИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА У
ГОРОХА В УСЛОВИЯХ РАЗДЕЛЬНОГО И
КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ГИПЕРТЕРМИИ И
ЗАСОЛЕНИЯ
В.И. Суворов, Л.А. Чудинова, Е.В. Болгарова
Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Предварительная обработка закаливающей температурой (37°С) проростков гороха повышала активность антиоксидантных ферментов и нормализовала содержание АФК при последующем засолении, что, очевидно, способствовало развитию кросс-адаптации. Последовательное действие сильных стрессоров (повреждающей температуры - 42°С и монозасоления) приводило к снижению активности антиоксидантных ферментов и, как следствие этого, к значительному увеличению уровня АФК, что свидетельствует о нарастании в этих условиях окислительного стресса.
Введение
Окислительный стресс, который определяют как реакцию организма на присутствие в среде избытка оксидантов, в растениях возникает в результате действия практически всех неблагоприятных факторов внешней среды, включая засуху, почвенное засоление, низкие и высокие температуры, свет высокой интенсивности, ультрафиолетовое излучение, патогены различной природы и др. (Рогожин. 2002. Суворов, Чудинова. 2009). Можно предположить, что окислительный стресс входит как компонент в большинство других стрессов. Такая универсальность в индукции окислительного стресса при действии на растения самых разнообразных стрессоров указывает на принципиально важное значение антиоксидантных систем, снижающих внутриклеточные концентрации активных форм кислорода (АФК), а также систем, ликвидирующих токсические продукты взаимодействия АФК с биополимерами и повышающих устойчивость растений к неблагоприятным факторам среды вообще (Чевари, 1985, Рогожин, 2004). По этой причине представляется интересным изучение разных стресс-воздействий на генерацию АФК и активность антиоксидантных систем (АОС) для последующего выявления качественных связей между этими функциональными элементами.
Целью данной работы было исследование раздельного и комбинированного влияния гипертермии и хлоридного засоления на генерацию АФК в побегах гороха, а также на динамику активности ряда антиоксидантных ферментов (АОФ) - супер-оксиддисмутазы (СОД) и каталазы. Первый фермент катализирует реакцию дисмутации двух су-пероксиданионов, а второй участвует в разложении перекиси водорода.
Объекты и методы исследования
Исследования проводили на проростках гороха (Pisum sativum L) сорта Альфа. Для проращивания использовали семена, стерилизованные 4%-ным раствором перманганата калия в течение 30 мин. Трехдневные проростки неделю выращивали методом водной культуры на питательной смеси Прянишникова (0.5 нормы). Далее проростки подвергали тепловому воздействию и засолению по следующей схеме: 1) закаливающая температура (37°С) - Зч, 2) повреждающая температура (42оС) - Зч, 3) засоление 0,3% №С1 - 1ч, 4) закаливающая температура и последующее засоление в этот же день, 5) повреждающая температура и последующее засоление в этот же день. Контролем служили проростки, выращенные при комнатной температуре на питательной смеси без засоления. Окислительный стресс изучали через 1 ч и через неделю после воздействий. Определяли общее содержание перекиси водорода ферротиоционатным методом (Лукаткин, 2GG2, а). Генерацию суперок-сидного радикала (СОР) определяли методом, в основе которого лежит способность последнего окислять адреналин в адренохром (Лукаткин, 2GG2, б). Активность каталазы определяли по методу, основанному на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс (Королюк, 1981). Для определения активности супероксиддисмутазы использовали метод, основанный на способности этого фермента конкурировать с нитросиним тетрозоли-ем за супероксидные анионы, образующиеся в результате аэробного взаимодействия НАДН и фена-зинметасульфата (Полесская, 2GG7). Повторность эксперимента - трехкратная.
© В.И. Суворов, Л.А. Чудинова, Е.В. Болгарова, 2GG9
154
Особенности окислительного стресса.
155
Результаты и их обсуждение
Полученные результаты (табл. 1) показали угнетающее действие стрессоров на проростки гороха на 6-е сутки эксперимента. Наиболее сильно рост проростков подавлялся при температуре 42°С и при засолении. Предварительная обработка умеренной температурой (37°С) снижала ростингиби-рующий эффект последующего засоления. Это наводит на мысль о закаливающей роли умеренного термического воздействия и формировании кроссадаптации. Предварительная обработка повреждающей температурой (42оС), наоборот, усугубляла негативное влияние засоления.
Таблица 1
Ростовые параметры проростков гороха, см
Варианты Время отбора проб
воздействия 1 час 6 суток
Контроль 14.9+0.9 15.0+1.3
37оС 14.9+0.5 14.4+0.8
42оС 15.1+0.9 10.4+1.1
№С1 13.3+0.6 11.9+0.6
37оС+№С1 12.8+0.7 13.7+1.0
42оС+№С1 14.5+0.8 9.2+0.8
Содержание СОР через 1 ч после воздействия повышенных температур увеличивалось (табл. 2). Засоление без температурной обработки и при предварительном прогреве до 37оС не вызывало заметного изменения СОР. При действии сильных стрессоров (гипертермии 42оС и последующего засоления), приводящих к серьезным нарушениям метаболизма, интенсивность генерации СОР увеличивалась.
Результаты, представленные в таблице 3, показывают заметный рост количества перекиси водорода в вариантах с сильным воздействием стрессоров (42оС и 42оС +№С1). В остальных случаях ее содержание было относительно стабильным.
Таблица 2
Содержание супероксидного анион радикала в __________проростках гороха, усл. ед._______
Варианты воздействия Время отбора проб
1 час 6 суток
Контроль 0.26+0.04 0.23+0.04
37оС 0.40+0.06 0.17+0.02
42оС 0.36+0.06 0.48+0.08
NaCl 0.27+0.02 0.18+0.05
37оС+NaQ 0.26+0.05 0.17+0.02
42оС+NaQ 0.52+0.08 0.44+0.07
В целом показатели исследуемых АФК находились в обратном соотношении с интенсивностью роста проростков. В связи с этим можно предположить, что уровень СОР и перекиси водорода может служить индикатором стресса у растений.
Таблица 3
Содержание перекиси водорода в проростках _______________гороха, мМоль________________
Варианты Время отбора проб
1 час 6 суток
Контроль 0.007+0.0004 0.008+0.0009
37оС 0.010+0.0012 0.009+0.0014
42оС 0.006+0.0090 0.015+0.0025
NaCl 0.006+0.0006 0.009+0.0013
37оС+NaQ 0.006+0.0005 0.006+0.0009
42°С+№С! 0.006+0.0007 0.017+0.0025
Через 1 ч после температурного воздействия наблюдалось заметное снижение активности СОД, тогда как через неделю активность этого фермента была существенно выше, чем в контрольном варианте (табл. 4). Засоление вызывало рост активности СОД, особенно через 6 суток. Часовое воздействие высоких температур и последующее засоления приводило к подавлению СОД, однако через неделю активность этого фермента заметно возрастала. Возможно, эти изменения активности СОД связаны с действием неспецифических факторов защиты - белков теплового шока (БТШ), синтез которых носит транзитный характер. При синтезе БТШ происходит изменение синтеза других белков, которые образуются в норме. Обращает на себя внимание резкий рост активности СОД при засолении, а также при комплексном воздействии повреждающих температур и засоления. Возможно, в этом случае действие неспецифических защитных систем заканчивается. Дальнейший процесс адаптации связан уже с работой специализированной системы защиты, к которую входят и ферменты окислительного стресса. СОД - единственный фермент, участвующий в ликвидации токсического действия супероксидного радикала.
Таблица 4
Активность супероксиддисмутазы в пророст_____________ках гороха, усл. ед._________
Варианты воздействия Время отбора пробыта
1 час 6 суток
Контроль 8.6+0.3 7.60+0.8
37оС 7.8+0.4 13.9+2.1
42оС 3.0+0.2 12.9+1.5
NaCl 12.7+0.9 22.6+1.8
37оС+NaQ 5.7+1.1 17.3+2.6
42оС+NaQ 4.2+0.9 8.9+1.1
Активность каталазы сохранялась повышенной во всех опытных вариантах, особенно при засолении в сочетании с предварительным прогревом закаливающей температурой (табл. 5). Возможно,
156
В.И. Суворов, Л.А. Чудинова, Е.В. Болгарова
такая динамика нарастания активности каталазы связана с постепенным увеличением концентрации перекиси водорода вследствие реакции дисмута-ции, направленной на ликвидацию супероксидного аниона. Кроме того, каталаза имеет низкое сродство к субстрату и начинает «работать» только при достаточно высоком содержании перекиси.
Таблица 5
Активность каталазы в проростках гороха, ___________________усл. ед.________________
Варианты воздействия Время отбора проб
1 час 6 суток
Контроль 62.G+93 67.1+7.2
З7оС 6З.З+Ю.9 66.1+6.5
42оС 66.5+17.5 74.8+1G.6
NaCl 62.2+11.7 8G.4+4.9
З7оС+№С1 67.4+4.З 97.6+1З.8
42оС+№С1 79.З+8.6 6G.G+6.7
В целом характер изменения активности ката-лазы в эксперименте в значительной степени совпадал с характером изменения активности СОД, что позволяет выдвинуть предположение о принадлежности этих ферментов к одному магистральному пути утилизации АФК.
Полученные результаты показали, что гипертермия и засоление как раздельно, так и в комплексе индуцируют окислительный стресс разной силы, который выражается в генерации АФК и в активации АОС. Последовательное действие сильных стрессоров (повреждающей температуры 42оС и монозасоления) приводило к снижению активности антиоксидантных ферментов и, как следствие этого, к значительному увеличению уровня АФК, что свидетельствует о нарастании окислительного стресса в этих условиях. Последнее может привести к необратимым повреждениям и даже гибели растений.
Предварительная обработка закаливающей температурой (37оС) повышала активность анти-оксидантных ферментов и нормализовала содержание АФК при засолении, что, очевидно, способствовало развитию кросс-адаптации, которая обеспечивается функционированием неспецифи-
ческих механизмов устойчивости. В целом полученные результаты указывают на существование хорошо скоординированной системы защиты от окислительного стресса в условиях действия умеренных стрессовых факторов.
Библиографический список
Королюк М.А. Метод определения активности каталазы / М.А.Королюк, Л.И.Иванова, И.Г.Майорова, В.Е.Токарев // Лабораторное дело. 1981. № 1. С. 16-19.
Лукаткин А. С. Вклад окислительного стресса в развитие холодового повреждения в листьях теплолюбивых растений. 1. Образование активированных форм кислорода при охлаждении растений // Физиология растений. 2002, а. Т. 49, № 5. С. 697702
Лукаткин А. С. Вклад окислительного стресса в развитие холодового повреждения в листьях теплолюбивых растений. 2. Активность антиокси-дантных ферментов в динамике охлаждения // Физиология растений. 2002, б. Т. 49, № 6. С. 878-885.
Полесская, О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода: учебное пособие /
О.Г.Полесская; под ред. И.П.Ермакова; КДУ. М. 2007. 140 с.
Рогожин В.В. Пероксидаза как компонент ан-тиоксидантной системы / В.В.Рогожин. СПб.: ГИОРД. 2004. 240 с.
Суворов В.И. Влияние раздельного и комбинированного действия гипертермии и засоления на активность некоторых антиоксидантных ферментов в проростках гороха /Суворов В.И., Чудинова Л.А. // Экология в высшей школе: синтез науки и образования: материалы Всерос.науч.-практ. конф. Челяб. гос. пед. ун-т. Челябинск, 2009. Ч.1. С. 115118.
Чевари С. Роль супероксиддисмутазы в окислительных процессах клетки и метод определения ее в биологических материалах / С.Чевари, И.Чаба, Й.Секей // Лабораторное дело. 1985. № 11. С.678-681.
Поступила в редакцию 16.05.2009
Some features in preserving actinobacteria of the genus Rhodococcus
VI. Suvorov, L.A. Chudinova, E.V. Bolgarova
Viability level necessary to recover cell populations upon long-term storage was measured. It is recommended to preserve alkanotrophic rhodococci pre-cultivated on nutrient hydrocarbon-containing media. The duration of rhodococci storage could be increased using protectants. The most effective lyoprotectants are shown to be a sucrose-gelatine agar or gelatine agar supplemented with Rhodococcus-biosurfactants.
