Изменение пероксидазного комплекса у проростков пшеницы при перекрестной адаптации Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2013 БИОЛОГИЯ Вып. 1

УДК 581.1: 632.122.1

ИЗМЕНЕНИЕ ПЕРОКСИДАЗНОГО КОМПЛЕКСА У ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ ПРИ ПЕРЕКРЕСТНОЙ АДАПТАЦИИ

Л. А. Чудинова, В. И. Суворов, С. С. Худеньких

Пермский государственный национальный исследовательский университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15;

[email protected]; (342)2396203

Предварительная обработка закаливающей температурой (37°С) проростков пшеницы повышала активность антиоксидантных ферментов и нормализовала содержание АФК при последующем засолении, что, очевидно, способствовало развитию кросс-адаптации. Последовательное действие сильных стрессоров (повреждающей температуры - 42°С и монозасоления) приводило к снижению активности антиоксидантных ферментов и, как следствие этого, к значительному увеличению уровня АФК, что свидетельствует о нарастании в этих условиях окислительного стресса.

Ключевые слова: перекись водорода; пероксидаза; гипертермия; засоление; перекрестная адаптация.

Введение

Убедительным доказательством функционирования общих механизмов устойчивости растений к действию различных стрессоров являются эксперименты по перекрестной адаптации, которые проводятся с 1970-х гг. [Hale, 1969]. Показано, что у многих растений тепловой шок оказывает протекторный эффект к последующему тепло-, холодо-, солевому воздействию и водному дефициту [Кузнецов и др., 1992; Таланова и др., 1993; Акимова, Балагурова, Титов, 1999; Чудинова, Суворов, Механошина, 2001].В настоящее время основное внимание уделяется изучению биохимических и молекулярно-генетических аспектов кросс-адаптации растений.

Пока не ясна природа рецептора, с помощью которого растительная клетка воспринимает температурный сигнал. Предполагают, что при изменении вязкости мембран может происходить открывание кальциевых сигналов и активация кальций-зависимых путей трансдукции сигнала в геном [Трунова, 2007]. Есть также предположение, что важными интермедиатами могут быть активные формы кислорода (АФК) и продукты пере-кисного окисления липидов [Курганова и др., 1999, Suzuki, Mittler, 2006]. На это указывает увеличение концентрации перекиси водорода уже через 3 мин. после нагрева [Larkindale, Huang, 2005], а также негативное влияние обработки антиоксидантами на развитие защитных реакций при кратковременном высокотемпературном воздействии на растения [Карпец, Колупаев, 2009]. Имеются данные о фаз-

ном характере изменения содержания пероксидов и теплоустойчивости после кратковременного высокотемпературного воздействия [Карпец, Колупаев, 2009]. В этом случае четко проявлялась фаза «тревоги» с увеличенным содержанием АФК и пониженной резистентностью и фаза регенерации -возврата устойчивости и показателей окислительного стресса к исходному уровню. По-видимому, для наиболее полного включения защитных механизмов необходимо нанесение повреждений растительным клеткам. При этом повышение концентрации АФК является сигналом, запускающим стресс-реакцию.

Объекты и методы исследования

Исследования проводили на проростках пшеницы (ТгШсит ае^'^ит L.) сорта Тюменская ранняя. Растения выращивались в водной культуре, при комнатной температуре в условиях естественного освещения. Семидневные проростки пересаживали на питательный раствор Кнопа. По достижении недельного возраста проростки пшеницы подвергались тепловому воздействию и засолению по следующей схеме:

Вариант 1 - контроль (питательная среда Кнопа)

Вариант 2 - закаливающая температура 37°С - 3 ч.

Вариант 3 - повреждающая температура 43°С - 3

ч.

Вариант 4 - засоление 0.3% №С! - 3 ч.

© Чудинова Л. А., Суворов В. И., Худеньких С. С., 201З

52

Комбинированное воздействие гипертермии и засоления

Вариант 5 - 37°С - 3 ч. + засоление 0.3% №С1 -3 ч. сразу после прогрева

Вариант 6 - 43°С - 3 ч. + засоление 0.3% №С1 -3 ч. сразу после прогрева

Вариант 7 - 37°С - 3 ч. + засоление 0.3% №С1 -3 ч. через сутки после прогрева

Вариант 8 - 43°С - 3 ч. + засоление 0.3% №С1 -3 ч. через сутки после прогрева

Для анализа активности пероксидазы и для определения количества перекиси брали листья пшеницы во всех вариантах непосредственно сразу после воздействия, через сутки и на 5-й день после воздействий. Кроме того, одновременно с измерением активности пероксидазы проводили мониторинг ростовых параметров проростков.

Определение общего содержания перекиси водорода велось по ферротиоционатному методу [Лу-каткин, 2002]. Пероксидазную активность определяли методом А.Н. Бояркина [1951].

Статистическая обработка осуществлялась общепринятыми методами с определением средней арифметической ошибки репрезентативности. Повторность определения трехкратная.

Результаты и их обсуждение

Полученные результаты (рис. 1) показали, что воздействие закаливающей температурой в некоторой степени стимулировало на 6 сут. прирост проростков пшеницы. Прогрев проростков повышенной температурой 43°С, и особенно засоление, заметно подавляли их рост. Предварительный прогрев как умеренной температурой (37°С), так и повышенной (43°С) частично снижал рост ингибирующего действия последующего засоления. При этом наибольший эффект давало комбинированное воздействие гипертермии и засоления, производимое в тот же день. Можно предположить, что в данном случае развивается перекрестная адаптация.

9 8 7 6

* 5

О

й 4

О

& 3

С 2 1 0

1 2 3 4 5 6 7 8

Варианты

1. Влияние стресс-факторов на прирост листьев пшеницы

В работе Т.В. Акимовой, Е.А. Мешковой, А.Ф. Титова [2002] указывается, что эффекты, вызываемые кратковременным нагревом растений, фиксировались уже через 1-3 ч. и сохранялись на протяжении длительного времени.

Перекись водорода - одна из наиболее устойчивых и легко определяемых АФК. Она может накапливаться в клетках растений в ходе развития стресса. Источниками перекиси водорода служат дублирующие пути окисления дыхательной цепи, псевдо-циклический путь переноса электронов в фотосинтезе и некоторые другие процессы.

Полученные результаты показали (рис. 2), что через сутки после воздействия закаливающей температуры происходит резкое накопление пероксида водорода, а затем его уровень восстанавливается, что, возможно, связано с эффектом мягкого разобщения дыхательной цепи [Skulachov, 1997]. Для ускорения окисления НАДН в дыхательной цепи митохондрий часть электронов в ней снимается на альтернативный путь переноса с образованием АФК и повышение уровня пероксида водорода можно связать с активной дисмутацией супероксидных анион-радикалов. Дополнительно возрастание уровня пероксида можно связать с увеличением роли дублирующего дыхания за счет терминальных оксидаз и усилением псевдоциклического транспорта электронов при фотосинтезе.

0,140

0,120

0,100

0,080

а

о" 0,060 0,040 0,020 0,000

□ сразу □ через сутки

□ на 6-й день

1

2 3

6 7

8

Рис.

4 5

Варианты

Рис. 2. Содержание перекиси водорода в листьях проростков пшеницы, мМ на 1 г сырой массы

При действии повреждающих температур нами не отмечено накопление перекиси водорода (рис. 2).

Возможно, это связано с высоким пулом перок-сидазы и низкомолекулярных антиоксидантов в условиях ускорения их экспрессии. При комбинированном воздействии гипертермии с непосредственным засолением отмечена наибольшая генерация перекиси в листьях. Накопление происходит постепенно к 6-м суткам. Это показывает реакцию растения на введение второго стрессора во время периода быстрой адаптации, когда организм находится в неустойчивом состоянии, в результате чего второй фактор усиливает стрессовое воздействие.

Предположительно это связано с сильным повреждающим действием стрессовых факторов и неспособностью растения обеспечить достаточный пул антиоксидантов.

Причинами увеличения содержания АФК в растительных клетках при гипертермии могут быть: повышение активности АФК-генерирующих ферментов (НАДФН-оксидазы, отдельных форм пероксидазы [Часов и др., 2002; Dat et al., 2000], снижение активности антиоксидантных ферментов [Lopez-Delgado et al., 1998], усиление образования АФК в хлоропластах и митохондриях вследствие перевосстановления их электрон-транспортных цепей. Последнее связано с угнетением фиксации углекислого газа и уменьшением энергозатрат в условиях стресса [Таран та ш., 2004; Pnueli et al., 2003]. Естественно, что АФК являются участниками передачи закаливающего температурного сигнала в геном. Передача сигнала в геном приводит к усилению экспрессии генов, контролирующих защитные реакции. Часть таких реакций может быть малоспецифической, например активация экспрессии генов антиоксидантных ферментов, которые обезвреживают избыток АФК, возникающий при действии стрессоров разной природы. Они принимают участие в активации процессов накопления низкомолекулярных протекторов. Усиление образования низкомолекулярных протекторов, вызываемое гипертермией, также может иметь признаки неспецифич-ности. Важно, что большинство этих соединений (пролин, полиамины, растворимые углеводы) могут оказывать полифункциональное защитное действие на растительные клетки, связанное с их мембранопротекторными, антиденатурационными, антиокси-дантными и другими свойствами.

Синтез стрессовых белков (например, шаперо-нов) также может относиться к малоспецифическим реакциям, поскольку увеличение количества белков, защищающих от денатурации другие протеины либо восстанавливающих частично денатурированные белки, необходимо не только при адаптации к высоким температурам, но и к другим стрессорам, которые могут нарушить структуру белков [Колу-паев, Косаювська, 2008].

В варианте, когда засоление вводилось через сутки после нагрева, накопление пероксида в листьях происходит лишь в первые сутки, а затем к 6му дню его количество уменьшается. Возможно, это связано с закаливающим действием температуры в ходе кросс-адаптации и вовлеченем в этот процесс системы антиоксидантной защиты, включающей низкомолекулярные компоненты (аскорбат, глута-тион, каротиноиды, фенолы и др.), а также антиок-сидантные ферменты.

Пероксидазная система растений имеет сильно выраженную полифункциональность и гетерогенность, связанную с наличием сложного набора молекулярных форм фермента. Адаптационные пере-

стройки, характерные для пероксидазного комплекса растений, затрагивают не только новообразования изоформ фермента, но и усиление активности уже существующих изопероксидаз. Поэтому перок-сидазный комплекс растений служит универсальным индикатором стрессового состояния растений [Андреева, 1988; Савич, 1989; Рогожин, 2004].

Нами показано, что рост активности пероксидазы в большинстве случаев происходит синхронно с накоплением перекиси. При повреждающей температуре в листьях наблюдалась исходно повышенная активность пероксидазы, что можно связать с работой элек-трон-транспортной цепи фотосинтеза (рис. 3).

80,0

70.0

60.0 “ 50,0

Я

° 40,0 ^ 5 | 30,0

I 20,0 10,0 0,0

Рис. 3. Изменение активности пероксидазы в листьях проростков пшеницы

Особенно высокая активность пероксидазы была отмечена при комбинированном действии повреждающей температуры и засоления, что может объясняться усилением дублирующего дыхания с помощью терминальных оксидаз в ходе кросс-адаптации. При воздействии засоления через сутки после прогрева вначале наблюдается рост активности этого фермента, а затем к 6-му дню - заметное падение активности. При этом повторяется установленная динамика генерации пероксида.

Таким образом, полученные результаты показали, что гипертермия и засоление как раздельно, так и в комплексе индуцируют окислительный стресс разной силы, который выражается в генерации перекиси водорода и в активации пероксидазы.

Имеется основание считать, что пероксидазный комплекс, выполняя сигнальную функцию, участвует в формировании перекрестной адаптации растений к засолению после предварительного прогрева как закаливающей, так и повреждающей температурой.

Библиографический список

Акимова Т.В., Балагурова Н.И., Титов А.Ф. Влияние локального прогрева на тепло-, холодо- и солеустойчивость клеток листа и корня растений // Физиол. раст. 1999. Т. 46, № 1. С. 119-123. Акимова Т.В., Мешкова Е.А., Титов А.Ф. Динамика теплоустойчивости клеток листа при локальном и общем прогреве проростков пшеницы в присутствии 6-бензиламинопурина // Вюн. Харюв. нащон. аграрн. ун-ту. Сер. Бюлопя. 2002. № 9(1). С. 31-36.

□ сразу □ Через сутки. П На 6 день

1 2 3 4 5 6 7 8

Варианты

Андреева В.А. Фермент пероксидаза: участие в защитном механизме растений. М.: Наука, 1988. 128 с.

Бояркин А.Н. Быстрый метод определения активности пероксидазы // Биохимия. 1951. Т. 16, вып. 4. С. 352-355.

Карпец Ю.В., Колупаев Ю.Е. Ответ растений на гипертермию: молекулярно-клеточные

аспекты // Вестник Харьков. нац. аграр. ун-та. Сер. Биология. 2009. Вып. 1 (16). С. 19-38.

Колупаєв Ю.Є., Косаківська І.В. Роль сигнальних систем і фітогормонів в реалізації стресових реакцій рослин // Укр. ботан. журн. 2008. Т. 65, № 3. С. 418-430.

Кузнецов Вл.В. и др. Стрессовые белки и фитогормоны при адаптации растений Cucumis sativus Ь. к почвенной засухе // Докл. АН СССР. 1992. Т. 322. С. 204-207.

Курганова Л.Н. и др. Продукты перекисного окисления липидов как возможные посредники между воздействием повышенной температуры и развитием стресс-реакции у растений // Физиол. раст. 1999. Т. 46, № 2. С. 218-222.

Лукаткин А.С. Вклад окислительного стресса в развитие холодового повреждения в листьях теплолюбивых растений. 1. Образование активированных форм кислорода при охлаждении растений // Физиол. раст. 2002. Т. 49, № 5. С. 697-702.

Рогожин В.В. Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов. СПб.: ГИОРД, 2004. 240 с.

Савич И.М. Пероксидазы - стрессовые белки растений // Успехи совр. биол. 1989. Т. 107, № 3. С. 406-417.

Таланова В.В. и др. Раздельное и комбинированное действие засоления и закаливающих температур на растения // Физиол. раст. 1993. Т. 40, № 4. С. 584-588.

Таран Н.Ю. та ін. Вторинний оксидний стрес як елемент загальної адаптивної відповіді рослин

на дш несприятливих фактор1в довшлля // Физиол. и биох. культ. растений. 2004. Т. 36, № 1. С. 3-14.

Трунова Т.И. Растение и низкотемпературный стресс. М.: Наука, 2007. 55 с.

Часов А.В. и др. Пероксидаза клеточной

поверхности - генератор супероксид-аниона в корневых клетках пшеницы при раневом

стрессе // Цитология. 2002. Т. 44, № 7. С. 691696.

Чудинова Л.А., Суворов В.И., Механошина Л.И. Влияние гипертермии на устойчивость

кукурузы к последующему засолению //

Вестник Перм. ун-та. 2001. Вып. 4. С. 85-89.

Hale H.B. Cross adaptation // Environm. Res. 1969. Vol. 2. P. 324

Dat J. et al. Dual action of the active oxygen species during plant stress responses // Cell. Mol. Life Sci. 2000. Vol. 57. P. 779-795.

Larkindale J., Huang B. Effects fo abscisic acid, salicylic acid, ethylene and hydrogen peroxide in ther-motolerance and recovery for creeping bentgrass // Plant Growth Regul. 2005. Vol. 47. P. 17-28.

Lopez-Delgado H. et al. Induction of thermotolerance in potato microplants by acetylsalicylic acid and H2O2 // J. Exp. Bot. 1998. Vol. 49. P. 713-720.

Pnueli P. et al. Growth suppression, altered stomatal responses, and augmented induction of heat shock proteins in cytosolic ascorbate peroxidase (Apx1)-deficient Arabidopsis plants // Plant J. 2003. Vol. 34. P. 187-203.

Skulachov V.P. Membrane-linked Systems Preventing Superoxide formation // Bioscience Reports. 1997. Vol. 17. P. 347-360.

Suzuki N., Mittler R. Reactive oxygen species and temperature stresses: A delicate balance between signaling and destruction // Physiol. Plant. 2006. Vol. 126. P. 45-51

Поступила в редакцию 22.02.2013

Change of a peroksidazny complex at wheat sprouts in experiments on cross adaptation

L. A. Chudinova, candidate of biology, associate professor V. I. Suvorov, candidate of biology, associate professor C. C. Hudenkih, student

Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia,614990; [email protected]; (342)2396203

Research of the separate and combined influence of a hyperthermia and chloride salinization on peroxide generation in wheat leaves, and also on dynamics of activity of a peroxidase is conducted. Participation of peroksidazny system in development of cross adaptation to salinization after action of not lethal tempering temperature at wheat sprouts is shown.

Key words: peroxide of hydrogen; peroxydase; hyperthermia; salinization; cross adaptation.

Чудинова Лариса Алексеевна, кандидат биологических наук, доцент Суворов Василий Иванович, кандидат биологических наук, доцент Худеньких Светлана Сергеевна, студентка

ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

Изменение пероксидазного комплекса у проростков пшеницы

5