CC BY
0
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
УДК 571.27
Особенности образования нейтрофильных внеклеточных ловушек
у кроликов породы шиншилла
Н.В. Воробьева1' *©, М.С. Мунтян2©
Кафедра иммунологии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,
Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12;
2НИИфизико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40
*e-mail: nvvorobjeva@mail.ru
Нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET, Neutrophil Extracellular Traps) представляют собой деконденсированный ядерный хроматин, «декорированный» бактерицидными белками различных органелл клетки и выполняющий эффекторную функцию, направленную на борьбу с патогенами в очаге воспаления. Вместе с тем, NET играют важную роль в патогенезе многих аутоиммунных и воспалительных заболеваний, а также злокачественных новообразований. Кролики являются одним из наиболее часто используемых видов лабораторных животных в медицинских и биологических исследованиях. На кроликах разработано большое количество моделей различных заболеваний сердечно-сосудистой, иммунной и других систем человека. Однако в научной литературе отсутствуют сведения о способности нейтрофилов кролика подвергаться NETозу (программируемой гибели клеток в процессе образования NET) в ответ на известные фармакологические стимулы. Целью представленной работы было изучение в системе in vitro способности нейтрофилов кролика породы Советская шиншилла образовывать NET в ответ на миметик диацилглицерола форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) и кальциевый ионофор А23187. Для выделения нейтрофилов кролика использовали метод центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности Ficoll-Hypaque с модификациями. Окислительный взрыв оценивали методом регистрации люминол-зависи-мой хемилюминесценции, а образование NET — с помощью иммунофлуоресцентного анализа. В работе впервые показано, что нейтрофилы кролика Советская шиншилла не образуют NET в ответ на ФМА, но формируют ловушки в ответ на А23187, а также обладают низким уровнем окислительного взрыва в ответ на ФМА, А23187 и хемоаттрактант N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин.
Ключевые слова: нейтрофилы кролика, нейтрофильные внеклеточные ловушки, NET, окислительный взрыв, форбол-12-миристат-13-ацетат, А23187
DOI: 10.55959/MSU0137-0952-16-79-1-7
Открытие Артуро Циклински [1] в 2004 г. нейтрофильных внеклеточных ловушек (NET, Neutrophil Extracellular Traps) привлекло внимание большого числа исследователей и стимулировало огромное количество научных публикаций. Подавляющее большинство этих работ было проведено на нейтрофилах человека или грызунов (мышей и крыс). Показано, что NET состоят из остова хроматина, деконденсированного до ну-клеосомного уровня упаковки ДНК и «декорированного» несколькими десятками типов белков гранул (миелопероксидаза, МП О; эластаза), ядра (гистоны) и цитоплазмы [2]. Индукторами образования NET являются разнообразные физиологические стимулы, такие как бактерии, грибы, виру© Воробьева Н.В., Мунтян М.С., 2024
сы и простейшие [1], а также химические стимулы, антитела, иммунные комплексы, хемо-кины, цитокины и хемоаттрактанты. Наиболее широко используемыми фармакологическими стимулами образования NET являются форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) и кальциевые ио-нофоры (иономицин, А23187). Высвобождение хроматина было постулировано как новая эффек-торная функция нейтрофилов для борьбы с патогенами, дополняющая фагоцитоз, дегрануляцию и генерацию активных форм кислорода (АФК). Впоследствии выяснилось, что хроматин могут выделять и другие гранулоциты, например, эози-нофилы, базофилы и тучные клетки, а также моноциты, макрофаги и В-лимфоциты [3]. Вскоре
стало ясно, что нейтрофилы многих млекопитающих, включая кошек, собак, крупный рогатый скот, овец, коз и свиней, выделяют хроматин для защиты хозяина от патогенов [4]. Сообщалось, что специфические клетки птиц и рыб [4], некоторых представителей беспозвоночных [5] и растений [6] также способны высвобождать ядерный хроматин. Таким образом, выделение хроматина, направленное на защиту хозяина от патогенов, является эво-люционно консервативным механизмом.
Однако впоследствии оказалось, что, помимо защитной функции, NET играют важную роль в патогенезе таких аутоиммунных и воспалительных заболеваний, как системная красная волчанка, ревматоидный артрит, васкулит мелких сосудов и псориаз [7—11], а также злокачественных новообразований [12]. Таким образом, существует тонкий баланс между высвобождением NET и их своевременным устранением, что обеспечивает защитные или повреждающие последствия их образования.
Кролики являются одним из наиболее часто используемых видов лабораторных животных в медицинских и биологических исследованиях. На них разработано большое количество моделей различных болезней человека, в частности, заболеваний сердечно-сосудистой и иммунной систем. Поскольку кролики имеют больше общих офтальмологических характеристик с людьми по сравнению с мелкими грызунами, это делает их удобной моделью для исследований в области офтальмологии и изучения таких заболеваний человека, как синдром сухого глаза, глаукома, катаракта и увеит [13—15]. Хотя в научной литературе отсутствуют данные о способности нейтрофилов кроликов развивать NETоз в ответ на фармакологические стимулы в системе in vitro, образование NET недавно было обнаружено в легких и печени кроликов, инфицированных возбудителем туляремии Francisella tularensis [16].
Ввиду широкого использования кроликов для разработки моделей ряда заболеваний человека, важно также учитывать способность их нейтрофилов образовывать NET как фактор патогенеза воспалительных и аутоиммунных процессов. В связи с этим целью работы было изучение способности нейтрофилов кроликов породы Советская шиншилла образовывать NET в ответ на классические активаторы NETоза, ФМА и А23187, в системе in vitro.
Материалы и методы
Реагенты. ФМА, A23187, А-формил-метионил-лейцил-фенилаланин (fMLP, А-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine), диметилсульфоксид, Тритон Х-100 были приобретены в компании Sigma-Aldrich (США). SYBR Green, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), смола ProLong Gold и моноклональ-ные FITC-меченные антитела к МПО были заку-
плены в Thermo Fisher Scientific (Invitrogen, США), декстран Т-500 - в Pharmacosmos (Дания).
Выделение первичных нейтрофилов из крови кроликов породы Советская шиншилла. Все исследования с кровью проводились в соответствии с биоэтическими нормами Европейского Союза и РФ. Нейтрофилы кролика выделяли с использованием одноступенчатого градиента Ficoll-Hypaque, ранее разработанного для выделения нейтрофилов человека [17], однако с небольшими модификациями. Периферическую кровь кроликов отбирали из ушной вены в полипропиленовые пробирки с гепарином (20 МЕ х мл-1 крови). Цельную кровь разводили средой 199 в соотношении 1:1 и наслаивали на Ficoll-Hypaque с плотностью 1,077 г/см3. Центрифугирование проводили при 478 g в течение 30 мин и комнатной температуре. Эритроцитарную массу доводили до первоначального объема крови, добавляли декстран Т-500 (конечная концентрация — 1%) и оставляли на 15 мин для осаждения основной массы эритроцитов. Верхний прозрачный слой отбирали, доводили средой 199 до 10 мл и проводили центрифугирование при 400 g в течение 10 мин. Оставшиеся эритроциты лизировали в гипотоническом растворе хлорида натрия (0,2%-ный NaCl) в течение 30 с и далее восстанавливали изотоничность путем добавления гипертонического раствора хлорида натрия (1,6%-ный NaCl). Осаждали клетки при 400 g в течение 10 мин и разводили осадок в полной культуральной среде, содержащей RPMI 1640, 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамин и 1%-ную инак-тивированную эмбриональную телячью сыворотку, для последующего исследования NETоза. Для исследования окислительного взрыва осадок суспендировали в фосфатном буфере Кребса-Ринге-ра (120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,7 мМ KH2PO4, 8,3 мМ Na^PO4, 10 мМ глюкоза, 1 мМ CaCl2, 1,5 мМ MgQ2, рН — 7,3). Полученные клетки были представлены на 92% нейтрофилами, а их жизнеспособность составляла не менее 99%, что определяли по исключению 0,1%-ного трипано-вого синего. Изменение условий центрифугирования в градиенте плотности позволило выделять нейтрофилы кролика в количестве 1,5—2,0 х 106 на 1 мл цельной крови, что коррелирует с данными литературы [18]. Нейтрофилы инкубировали в течение 1 ч при 4° С перед экспериментом для достижения состояния покоя.
Оценка люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ). ЛЗХЛ использовали для оценки суммарных АФК (внутри- и внеклеточных), как описано ранее [17]. В лунки 96-луночного планшета добавляли нейтрофилы кролика в количестве 2,5 х 105 клеток в фосфатном буфере Кребса-Рингера, лю-минол (80 мкМ — конечная концентрация) и один из активаторов окислительного взрыва — А23187 (2,5 мкМ), ФМА (35 нМ) или MLP (800 нМ). Планшет немедленно помещали в хемилюмино-
метр Lucy 1 (Anthos Labtec, Австрия) для регистрации ЛЗХЛ. По окончании ЛЗХЛ оценивали площадь, занимаемую кривыми хемилюминесценции (суммарная эмиссия света), и степень окислительного взрыва выражали в виде гистограмм.
Индукция и иммунофлуоресцентное окрашивание NET. Свежевыделенные нейтрофилы кролика (2 х 105 кл/мл в 500 мкл полной культуральной среды), адгезированные на круглых покровных стеклах, находящихся в лунках 24-луночного планшета, стимулировали ФМА (35, 50, 100 нМ) или 2,5 мкМ А23187 в течение 3 ч и 4 ч соответственно. После стимуляции НЕТоза клетки фиксировали в лунках в 200 мкл 4%-ного раствора па-раформальдегида в течение 15 мин. Препараты окрашивали проникающим через мембраны клеток красителем SYBR Green, разведенным в фос-фатно-солевом буфере (PBS, phosphate-buffered
saline) в соотношении 1:10000 в соответствии с рекомендацией производителя, в течение 7 мин в темноте. Для иммунофлуоресцентного окрашивания фиксированные нейтрофилы промывали в PBS и пермеабилизировали с Тритоном Х-100 в течение 1 мин при комнатной температуре. Неспецифическое связывание уменьшали путем инкубации клеток в блокирующем буфере (иммуноглобулины человека) в течение 20 мин. Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили с использованием FITC-меченных моноклональ-ных антител против МПО. Хроматин окашивали флуоресцентным красителем DAPI в течение 10 мин. Стекла промывали 2 раза в PBS и 1 раз в дистиллированной воде, далее погружали в смолу ProLong Gold. Клетки анализировали с использованием флуоресцентного микроскопа Leica DM LB (Leica Microsystems, Германия), а фотографи-
анти-МПО
совмещение
спонт
/
--
V
/
спонт У«
* yf * *
% / . '
*
ФМА, 35 нМ ФМА, 35 нМ v. ' ФМА, 35 нМ ч /
Ч X t' - ^ , * . * / т
\ X -г ' ч - 4 \ sr
Г 100 90 f 80 а. 70
I 60
* 50
Л 40
в4
Н 30
g 20
10
о
спонт.фон ФМА, 35 нМ А23187, 2.5 мкМ
Рис. 1. Оценка NETra, индуцированного в нейтрофилах кролика породы Советская шиншилла ФМА и А23187. Свежевыделенные нейтрофилы кролика, адгезированные на покровных стеклах, инкубировали в присутствии растворителя (А), ФМА (35 нМ) (Б) или А23187 (2,5 мкМ) (В) в течение 3 ч (ФМА) или 4 ч (А23187). Клетки фиксировали в 4%-ном параформальдегиде и окрашивали флуоресцентными красителями. (А) Для оценки чистоты выделения нейтрофилы кролика окрашивали DAPI (тест на хроматин, голубое свечение) и меченными FITC моноклональными антителами против МПО (зеленое свечение). Белые стрелки указывают на нейтрофилы, красные — на мононуклеары. Для оценки NETra нейтрофилы кролика окрашивали меченными FITC моноклональными антителами против МПО и DAPI (Б) или SYBR Green (В). Масштаб — 25 мкм. (Г) Гистограмма, отражающая процент NETra, индуцированного различными стимулами, n = 5, *** p < 0,001
рование проводили с помощью камеры Leica DC300F (Leica Microsystems, Германия). Подсчитывали общее количество клеток и количество не-тотических клеток в каждом поле зрения, оценивали процент NETоза в нескольких полях зрения (не менее 500 клеток).
Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы GraphPad InStat 3.06 (GraphPad Software, США). Данные в тексте и на рисунках представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Статистический анализ осуществляли с использованием параметрических методов, статистически значимыми считали различия приp < 0,05.
Результаты и их обсуждение
Использование метода одноступенчатого градиента плотности Ficoll-Hypaque, ранее разработанного для выделения нейтрофилов человека [17], не позволило получить чистую фракцию нейтрофилов кролика — по-видимому, из-за плотностных особенностей этих клеток. В связи с этим в работе пришлось изменить ряд параметров выделения, что позволило нам получить чистую фракцию нейтрофилов. Чистоту выделения нейтрофилов оценивали в предварительных экспериментах с использованием меченных FITC моноклональных антител против МПО. МПО является компонентом азуро-фильных гранул нейтрофилов, которые отсутствуют в мононуклеарных клетках (моноциты, лимфоциты). В покоящихся нейтрофилах, как правило, можно наблюдать характерное распределение МПО в составе гранул, заполняющих цитозоль клетки, тогда как в нетотических нейтрофилах МПО колокализуется с деконденсированным хроматином. На рис. 1А можно видеть неактивированные нейтрофилы кролика, маркированные зеленой меткой (МПО, белые стрелки), в то время как отдельные мононуклеары такой маркировкой не обладают (красные стрелки).
Поскольку в научной литературе практически отсутствует информация о способности нейтрофилов кролика к NETозу [16], нам было интересно выяснить, будут ли эти клетки образовывать NET в ответ на классические активаторы этого процесса, ФМА и кальциевый ионофор А23187 в системе in vitro. Для этого клетки инкубировали в присутствии ФМА в возрастающих концентрациях (от 35 нМ до 100 нМ) или 2,5 мкМ А23187 в течение 3 ч и 4 ч соответственно. Результаты показали (рис. 1, Б и Г), что стимуляция нейтрофилов ФМА не приводит к заметной деконденсации хроматина, характерной для NETоза человека, хотя ядерные сегменты слегка увеличивались в размерах. Увеличение дозы ФМА до 100 нМ не способствовало каким-либо изменениям в сторону NETоза. В то же время инкубация нейтрофилов с А23187 в течение 4 ч приводила к практически 100%-ной деконденса-ции ядерного хроматина (рис. 1, В и Г).
Поскольку ФМА является миметиком диа-цилглицерола, который при активации связывается с протеинкиназой С, отсутствие ответа на ФМА можно бы было объяснить недостатком этого фермента или особенностями клеточной мембраны нейтрофилов кроликов, препятствующими свободному проникновению ФМА в клетки. Другим возможным объяснением может быть низкий уровень активации НАДФН-оксидазы и связанный с этим дефицит АФК, которые необходимы для индукции ФМА-индуцированного НЕТоза. Для проверки этой гипотезы мы провели оценку люминол-амплифицированного окислительного взрыва, индуцированного ФМА, А23187 и fMLP. На рис. 2 можно видеть, что все три классических активатора окислительного взрыва вызывали крайне низкую стимуляцию образования АФК у нейтрофилов кролика по сравнению с нейтро-филами человека, что может объяснить отсутствие у них НЕТоза в ответ на ФМА. Как нами было обнаружено ранее, НЕТоз в ответ на кальциевые ио-
Рис. 2. Оценка окислительного взрыва нейтрофилов кролика, индуцированного различными стимулами. Нейтрофилы кролика стимулировали ФМА (35 нМ), A23187 (2,5 мкМ) или fMLP (800 нМ) в присутствии 80 мкМ люминола. Люминол-зависи-мую хемилюминесценцию (ЛЗХЛ) оценивали сразу после добавления стимулов в планшетном хемилюминометре Lucy 1. (А) Представлены типичные кинетические кривые ЛЗХЛ, индуцированной в нейтрофилах кролика активаторами окислительного взрыва. Для сравнения приведены типичные кинетические кривые ЛЗХЛ, полученные для нейтрофилов человека [17]. По оси абсцисс: время, мин. По оси ординат: интенсивность хеми-люминесценции, мВ/мин. (Б) Представлена эмиссия света, индуцированная активаторами окислительного взрыва и выраженная в виде площади под кривыми ЛЗХЛ, n = 5.
нофоры может происходить и без стимуляции НАДФН-оксидазы и в основном зависит от мито-хондриальных АФК [19]. В этой связи, низкий уровень окислительного взрыва под влиянием А23187 не играет существенной роли в этом процессе. Что касается fMLP, то этот хемоаттрактант не является активатором образования NET [19].
В научной базе данных PubMed практически отсутствуют публикации, касающиеся способности нейтрофилов кроликов осуществлять NETоз. Только в единственной статье Пулавендран и со-авт. [16] было показано в системе in vivo, что ней-трофилы кроликов выбрасывают NET в тканях легких и печени после инфицирования животных возбудителем туляремии. При этом NET не оказывали защитного действия от патогена. Отсутствие информации о NETозе у кроликов может быть связано, по нашему мнению, с превалированием у нейтрофилов этих животных иных эффек-торных функций, например, фагоцитоза и дегра-нуляции. Вместе с тем, в связи с широким использованием кроликов в качестве лабораторных животных и тестированием на них большого
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Brinkmann V., Reichard U., Goosmann C., Fauler B., Uhlemann Y., Weiss D.S., Weinrauch Y., Zychlinsky A. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 2004;303(5663):1532-1535.
2. Urban C.F., Ermert D., Schmid M., Abu-Abed U., Goosmann C., Nacken W., Brinkmann V., Jungblut P.R., Zy-chlinsky A. Neutrophil extracellular traps contain calprotec-tin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoSPathog. 2009;5(10):e1000639.
3. Vorobjeva N.V, Chelombitko M.A., Sud'ina G.F., Zi-novkin R.A., Chernyak B.V Role of mitochondria in the regulation of effector functions ofgranulocytes. Cells. 2023;12(18):2210.
4. Neumann A., Brogden G., von Kockritz-Blick-wede M. Extracellular traps: an ancient weapon of multiple kingdoms. Biology (Basel). 2020;9(2):34.
5. Zhang X., Zhuchenko O., Kuspa A., Soldati T. Social amoebae trap and kill bacteria by casting DNA nets. Nat. Commun. 2016;7:10938.
6. Hawes M., Allen C., Turgeon B.G., Curlango-Rivera G., Minh Tran T., Huskey D.A., Xiong Z. Root border cells and their role in plant defense. Annu. Rev. Phytopathol. 2016;54:143-161.
7. Vorobjeva N.V., Pinegin B.V. Neutrophil extracellular traps: mechanisms of formation and role in health and disease. Biochemistry (Mosc.). 2014;79(12):1286-1296.
8. Pinegin B., Vorobjeva N., Pinegin V. Neutrophil extracellular traps and their role in the development of chronic inflammation and autoimmunity. Autoimmun. Rev. 2015;14(7):633-640.
9. Vorobjeva N.V., Chernyak B.V. NETosis: molecular mechanisms, role in physiology and pathology. Biochemistry (Mosc.). 2020;85(10):1178-1190.
10. Vorobjeva N.V. Neutrophil extracellular traps: new aspects. Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2020;75(4):173-188.
11. Papayannopoulos V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat. Rev. Immunol. 2018;18(2):134-147.
количества химических препаратов, необходимо учитывать возможную активацию NETоза и его цитопатологическое действие на органы и ткани, а также его роль в патогенезе многих аутоиммунных и воспалительных заболеваний.
Таким образом, в представленной работе показано, что нейтрофилы кроликов породы Советская шиншилла не образуют NET в ответ на ФМА в широком диапазоне концентраций, однако с высокой интенсивностью выбрасывают NET в ответ кальциевый ионофор А23187. Отсутствие ответа на ФМА может быть обусловлено низким уровнем образования АФК как важного медиатора этого процесса.
Работа выполнена в рамках проекта «Молекулярные и клеточные основы иммунитета» (проект 21-1-21, номер ЦИТИС 121042600047-9). Образцы крови кроликов получали в компании «НПО Петро-вакс Фарм». Эксперименты проведены с соблюдением этических норм работы с животными и одобрены Комиссией по биоэтике «НПО Петровакс Фарм» (протокол 204092022, от 27 сентября 2022 г.). Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
12. Cools-Lartigue J., Spicer J., Najmeh S., Ferri L. Neutrophil extracellular traps in cancer progression. Cell. Mol. Life Sci. 2014;71(21):4179-4194.
13. Baksheeva V.E., Tiulina V.V., Iomdina E.N., et al. Tear nanoDSF denaturation profile is predictive of glaucoma. Int. J. Mol. Sci. 2023;24(8):7132.
14. Chistyakov D.V., Gancharova O.S., Baksheeva V.E., Tiulina V.V., Goriainov S.V., Azbukina N.V., Tsarkova M.S., Zamyatnin A.A., Jr., Philippov P.P., Sergeeva M.G., Senin 1.1., Zernii E.Y. Inflammation in dry eye syndrome: identification and targeting of oxylipin-mediated mechanisms. Biomedicines. 2020;8(9):344.
15. Livingston E.T., Mursalin M.H., Callegan M.C. A Pyrrhic victory: the PMN response to ocular bacterial infections. Microorganisms. 2019;7(11):537.
16. Pulavendran S., Prasanthi M., Ramachandran A., Grant R., Snider T.A., Chow V.T.K., Malayer J.R., Teluguakula N. Production of neutrophil extracellular traps contributes to the pathogenesis of Francisella tularemia. Front. Immunol. 2020;11:679.
17. Vorobjeva N., Dagil Y., Pashenkov M., Pinegin B., Chernyak B. Protein kinase C isoforms mediate the formation of neutrophil extracellular traps. Int. Immunopharmacol. 2023;114:109448.
18. Kouoh F., Gressier B., Luyckx M., Brunet C., Dine T., Ballester L., Cazin M., Cazin J.C. A simple method for isolating human and rabbit polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Biol. Pharm. Bull. 2000;23(11):1382-1383.
19. Vorobjeva N., Galkin I., Pletjushkina O., Golyshev S., Zinovkin R., Prikhodko A., Pinegin V, Kondratenko I., Pinegin B., Chernyak B. Mitochondrial permeability transition pore is involved in oxidative burst and NETosis of human neutrophils. Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis. 2020;1866(5):165664.
Поступила в редакцию 10.12.2023 После доработки 05.04.2024 Принята в печать 16.04.2024
RESEARCH ARTICLE
Peculiarities of neutrophil extracellular traps formation
in chinchilla rabbits
N.V. Vorobjeva1, *©, M.S. Muntyan2©
1Department of Immunology, Biology Faculty, Lomonosov Moscow State University, 1—12 Leninskie Gory, Moscow, 119234, Russia;
2Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, 1—40 Leninskie Gory, Moscow, 119234, Russia *e-mail: nvvorobjeva@mail.ru
Neutrophil extracellular traps (NETs) are decondensed nuclear chromatin, decorated with bactericidal proteins of various cell organelles and performing an effector function aimed to combat pathogens at the site of inflammation. At the same time, NETs play an important role in the pathogenesis of many autoimmune and inflammatory diseases as well as malignancies. Rabbits are one of the most commonly used species of laboratory animals in medical and biological research. A large number of models of various diseases of the cardiovascular, immune and other human systems have been developed in rabbits. However, there is no information in the scientific literature about the ability of rabbit neutrophils to undergo NETosis in response to well-known pharmacological stimuli. The purpose of the present work was to study in in vitro system the ability of neutrophils of Soviet chinchilla rabbit to form NETs in response to mimetic of diacylglycerol phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and calcium ionophore A23187. To isolate rabbit neutrophils, the one-step density gradient centrifugation on Ficoll-Hypaque method with modifications was used. Oxidative burst was assessed with luminol-amplified chemiluminescence method, and NET formation was assessed with immunofluorescence analysis. The work shows for the first time that neutrophils of Soviet chinchilla rabbit do not form NETs in response to PMA, but form traps in response to A23187, as well as have a low level of oxidative burst in response to PMA, A23187 and chemoattractant N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine.
Keywords: rabbit neutrophils, neutrophil extracellular traps, NETs, oxidative burst, phorbol 12-myristate 13-acetate, A23187
Funding: The research was carried out within the framework of the Scientific Project of the State Order of the Government of Russian Federation to Lomonosov Moscow State University (project No. 121042600047-9) and Interdisciplinary Scientific and Educational School of Lomonosov Moscow State University "Molecular Technologies of the Living Systems and Synthetic Biology."
Сведения об авторе
Воробьева Нина Викторовна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. кафедры иммунологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-46-46; e-mail: nvvorobjeva@mail.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5233-9338
Мунтян Мария Сергеевна — канд. биол. наук, вед. науч. сотр. отдела биоэнергетики Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова. Тел.: 8-495-939-53-60; e-mail: muntyan@genebee. msu.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0003-2332-5644
