CC BY
10
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
УДК 571.27
NADPH-оксидаза модулирует Са2+-зависимое образование нейтрофильных внеклеточных ловушек
Н.В. Воробьева1*, Б.В. Черняк2
Кафедра иммунологии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,
Россия, 119991, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12;
Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Россия, 119992, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40
*e-mail: nvvorobjeva@mail.ru
Хроническая гранулематозная болезнь (ХГБ) представляет собой тяжелый наследственный иммунодефицит, при котором пациенты страдают от рецидивирующих бактериальных и грибковых инфекций, а также аберрантных воспалительных процессов. Фенотип ХГБ обусловлен дефицитом фагоцитарной NADPH-оксидазы, приводящим к неспособности фагоцитов образовывать активные формы кислорода (АФК). Такие фагоциты ограничены в возможности осуществлять фагоцитоз, дегрануляцию, а также образование нейтрофильных внеклеточных ловушек (NET) в ответ на многие рецепторные и фармакологические стимулы. Однако образование ловушек нейтрофилами пациентов с ХГБ в ответ на кальциевые ионофоры было описано нами в предыдущей работе. В ряде работ было показано, что дефицитные по NADPH-оксидазе нейтрофилы не только не могут генерировать АФК, но и благодаря отсутствию электрогенной функции фермента и деполяризации мембраны при активации имеют существенные нарушения притока внеклеточного Ca2+ и, как следствие, множественные отклонения в синтезе провоспали-тельных цитокинов. В настоящей работе мы показали, что образование нейтрофильных ловушек дефицитными по NADPH-оксидазе нейтрофилами в ответ на кальциевый ио-нофор А23187 сопровождается избыточным накоплением внутриклеточного Ca2+. Такое нарушение мы объясняем отсутствием электрогенной функции мутантной NADPH-оксидазы, которая в норме вызывает деполяризацию плазматической мембраны. Результаты указывают на важную функцию фагоцитарной NADPH-оксидазы как модулятора транспорта внеклеточного Ca2+ и могут быть использованы для поиска средств борьбы с таким заболеванием, как ХГБ.
Ключевые слова: нейтрофилы человека, окислительный взрыв, активные формы кислорода, нейтрофильные внеклеточные ловушки, НЕТоз, хроническая гранулематозная болезнь
Хроническая гранулематозная болезнь (ХГБ) представляет собой наследственный иммунодефицит, при котором фагоциты не образуют супероксид-анион-радикалы (О2-) и их производные [1]. Невозможность генерировать супероксид-анион-радикалы связана с дефицитом многокомпонентного ферментного комплекса НАБРИ-оксидазы [2], что обусловлено мутациями генов, кодирующих его субъединицы (р47рИох, р67рИох, р40рИох, £р91рИох, р22рИох и ГТФаза Яае2). Пациенты с ХГБ страдают от рецидивирующих бактериальных и грибковых инфекций, а также аберрантных воспалительных процессов. В связи с этим понимание сигнальных путей, ведущих к развитию фенотипа ХГБ, является важной задачей для поиска средств борьбы с этим недугом.
Ранее было показано, что стимуляция нейтро-филов рецепторными стимулами сопровождается повышением концентрации внутриклеточного Са2+, играющего важную роль в активации ряда
эффекторных функций, например, дегрануляции и окислительного взрыва [3]. Наиболее хорошо изученным механизмом, связанным с повышением концентрации Са2+, является образование инозитол-1,4,5-трифосфата, который, в свою очередь, активирует выход Са2+ из внутриклеточных депо (эндоплазматический ретикулум) [4]. Истощение Са2+ в хранилищах клетки приводит к активации сенсорных белков STIM1 и STIM2 (stromal interaction molecule) и последующей стимуляции Са2+-активируемых каналов (CRAC, calcium release activated Са2+ channel), расположенных в цитоплаз-матической мембране [5]. Активация CRAC-каналов способствует притоку Са2+ внутрь клетки из внеклеточного пространства. После активации нейтрофила хемоаттрактантом А-формил-метионин-лейцин-фенилаланином (fMLP), а также активатором протеинкиназы С форбол-12-ми-ристат-13-ацетатом (ФМА) происходит подавление входа внеклеточного Са2+. Таким образом, суммар-
ное поступление Са2+ в клетку обеспечивается действием двух конкурирующих механизмов: стимулирующего и ингибирующего.
Учитывая, что функция NADPH-оксидазы в нейтрофилах здоровых доноров заключается в переносе одного электрона с NADPH на молекулярный кислород, в 80-е гг. было высказано предположение, что подавление притока внеклеточного Са2+ при активации связано с электрогенной функцией фермента, приводящей к деполяризации мембраны. Эта гипотеза была доказана в экспериментах на нейтрофилах человека, показавших корреляцию между деполяризацией мембраны и подавлением входа внеклеточного Са2+ в клетки [6]. Было установлено, что у нейтрофилов, выделенных из крови пациентов с ХГБ и имеющих дефицитную NADPH-оксидазу, такое подавление отсутствует, а накопление Са2+ в эндоплазматиче-ским ретикулуме происходит значительно быстрее, чем у нейтрофилов здоровых доноров [7].
Будучи «профессиональными» фагоцитами, нейтрофилы обеспечивают «первую линию» защиты от патогенов в очаге воспаления, осуществляя фагоцитоз, дегрануляцию и образование активных форм кислорода (АФК). В 2004 г. в лаборатории А. Циклински [8] был описан новый защитный механизм нейтрофилов, который заключается в высвобождении из клеток декон-денсированного хроматина, «декорированного» белками гранул, ядра и цитоплазмы. Такие структуры были названы нейтрофильными внеклеточными ловушками, или NET (Neutrophil Extracellular Traps), поскольку их главная функция состоит в ограничении распространения патогенов из первичного очага воспаления [8]. Следует отметить, что образование NET, как правило, сопровождается гибелью клетки, в связи с чем этот процесс был назван НЕТозом [9].
НЕТоз представляет собой многоступенчатый последовательно развивающийся процесс, при котором происходит образование АФК с участием NADPH-оксидазы и транслокация ферментов азурофильных гранул нейтрофильной эластазы (НЭ) и миелопероксидазы (МПО) в ядро [10]. В ядре, совместно с пептидил-аргинин-дезамина-зой 4 (PAD4), цитруллинирующей гистоны, НЭ и МПО осуществляют деконденсацию хроматина, что приводит к его последующему выбросу за пределы клетки — НЕТозу [11]. Было показано, что при активации НЕТоза также происходит повышение концентрации внутриклеточного Са2+ [12], и в настоящее время известны две ключевые Са2+-чувствительные мишени этого процесса: протеин-киназа C, ответственная за фосфорилирование субъединиц NADPH-оксидазы, и PAD4.
В ряде работ было установлено, что нейтро-филы пациентов с ХГБ, помимо невозможности генерировать АФК, также неспособны образовывать NET в ответ на многие рецепторные и фарма-
кологические стимулы (ФМА) [13, 14]. Вместе с тем, дефицитные по NADPH-оксидазе нейтрофилы все же образуют NET в ответ на кальциевые ионофоры иономицин и А23187 при участии ми-тохондриальных АФК (мтАФК) [14, 15].
Мы предположили, что дефицитные по NADPH-оксидазе нейтрофилы не только не способны к генерации оксидаза-зависимых АФК, но и, благодаря отсутствию деполяризации мембраны при активации [7] и избыточному поступлению Са2+ в клетки, имеют более глубокие нарушения агонист-индуцированных сигнальных путей. В соответствии с нашей гипотезой, нейтрофилы, выделенные из крови здоровых доноров и пациентов с ХГБ, стимулированные к НЕТозу кальциевым ионофором А23187, должны по-разному отвечать на истощение внутриклеточного Са2+, что и было проверено в нашей работе.
Материалы и методы
Реагенты. ФМА, А23187, fMLP, BAPTA-AM (1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N', N'-tetraacetic acid tetrakis(acetoxymethyl ester), лю-минол (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione) были закуплены в Sigma-Aldrich (США); SYBR Green, смола ProLong Gold — в Thermo Fisher Scientific (США).
Выделение первичных нейтрофилов человека. Образцы крови пациентов с хронической грануле-матозной болезнью были получены в процессе их планового обследования в Отделении клинической иммунологии и ревматологии Российской детской клинической больницы ФГАОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России. Образцы крови доноров были получены с их добровольного согласия в отделении переливания крови Российской детской клинической больницы. Исследования проводили согласно Хельсинкской декларации Всемирной Медицинской Ассоциации об этических принципах проведения медицинских исследований 2000 г. и протокола Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г. Исследования были одобрены локальным комитетом по этике Российской детской клинической больницы ФГАОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России.
Нейтрофилы выделяли из периферической крови с помощью центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности Ficoll-Hypaque (плотность 1,077 г/см3) в течение 25 мин при 400g и комнатной температуре, как описано ранее [16]. Основную массу эритроцитов удаляли путем седиментации в декстране. Оставшиеся эритроциты лизировали в гипотоническом растворе NaCl (0,2%) в течение 30 с и далее восстанавливали физиологический солевой состав путем добавления гипертонического NaCl (1,6%). Нейтрофилы ресуспендировали в полной культуральной среде
(ПКС), включающей RPMI 1640 с добавлением 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина и 1% инактиви-рованной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Полученные клетки были представлены на 98% гранул оцитами, а их жизнеспособность составляла более 99%, что определяли по исключению 0,1%-ного трипанового синего. Нейтрофилы инкубировали в течение 1 ч при 4°С перед экспериментом.
Оценка люминол-зависимой хемилюминесцен-ции (ХЛ). Люминол-зависимую ХЛ использовали для оценки концентрации суммарных АФК (внутри- и внеклеточных) как описано ранее [17]. Све-жевыделенные нейтрофилы в концентрации 2,5Т06 кл./мл (4,5-105 клеток) инкубировали с BAPTA-AM в возрастающих концентрациях в течение 20 мин в условиях 37оС и 5% СО2 в ПКС (5% ЭТС). Далее ПКС заменяли на фосфатный буфер Кребса-Рингера (120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,7 мМ KH2PO4, 8,3 мМ Na2HPO4, 10 мМ глюкоза, 1 мМ CaCl2, 1,5 мМ MgCl2, рН 7,3). К 2-105 клеток добавляли люминол (80 мкМ, конечная концентрация) и проводили стимуляцию окислительного взрыва 2,5 мкМ А23187, 30 нМ ФМА или 800 нМ fMLP. Люминол-зависимую ХЛ анализировали сразу после стимуляции в течение 30 мин при 37°С в планшетном хемилюминометре Lucy 1 («Anthos Labtec», Австрия). Оценивали площадь, занимаемую кривыми ХЛ, и выражали степень окислительного взрыва в процентах от контроля (контроль: стимулированные нейтрофилы; 100%) в виде гистограмм.
Индукция и флуоресцентное окрашивание NET. Для обнаружения NET использовали флуоресцентную микроскопию. Для этого свежевыделен-ные нейтрофилы (2-105 кл./мл) адгезировали на круглых покровных стеклах, находящихся в 24-лу-ночном планшете в 500 мкл ПКС (1% ЭТС), в течение 30 мин при 37°С. Нейтрофилы инкубировали в лунках с BAPTA-AM в течение 20 мин при 37°С и 5% СО2. Образование NET индуцировали 30 нМ ФМА пли 2,5 мкМ А23187 в течение 2 ч 40 мин и 4 ч соответственно. После стимуляции НЕТоза клетки фиксировали в растворе 4%-ного параформальдегида в течение 15 мин. Препараты погружали в SYBR Green, разведенный в фосфат-но-солевом буфере в соотношении 1:10000 в соответствии с рекомендацией производителя, и окрашивали в течение 6 мин при комнатной температуре в темноте. Препараты погружали в смолу ProLong Gold и анализировали клетки с использованием флуоресцентного микроскопа Leica DM LB (Leica Microsystems, Германия). Фотографирование проводили с помощью камеры Leica DC300F.
Подсчитывали общее число клеток и число нетотических клеток в каждом поле зрения, и далее оценивали процент НЕТоза в нескольких полях зрения. Для каждого варианта стимуляции
было поставлено не менее 3 экспериментов, а для каждой концентрации ингибитора анализировали не менее 500 нейтрофилов.
Статистическая обработка. Статистическую обработку данных проводили с использованием одномерного дисперсионного анализа (ANOVA), сопровождаемого тестом множественного сравнения Бонферрони для оценки различий между группами. Данные выражали в виде среднего ± ошибка среднего. Статистически значимые значения p указаны на графиках: * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** -р < 0,001.
Результаты и обсуждение
Ранее нами было показано, что нейтрофилы, выделенные из образцов крови многих пациентов с ХГБ, обладают повышенным спонтанным НЕТозом, достигающим в некоторых случаях 5-10%. Такое состояние указывало на предакти-вацию нейтрофилов в организме, ведущую к аберрантному НЕТозу.
Если активация НЕТоза под действием кальциевого ионофора А23187 у дефицитных по NADPH-оксидазе нейтрофилов приводит к избыточному входу Са2+ подобно тому, как это происходит при активации лигандами типа fMLP [6], можно ожидать, что инкубация таких клеток с хе-латором внутриклеточного Са2+ BAPTA-AM не должна вызывать существенного подавления НЕТоза. Вместе с тем, НЕТоз, индуцированный А23187 у нейтрофилов здоровых доноров, должен быть подавлен BAPTA-AM эффективно и дозоза-висимым способом, что и было проверено в нашей работе.
Диагноз ХГБ у всех исследованных больных был поставлен на основании абсолютного отсутствия у них окислительного взрыва в ответ на зимозан, что было определено методом регистрации люминол- и люцигенин-зависимой хемилю-минесценции в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, а также генетического подтверждения с помощью секвенирования по Сенгеру в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рога-чева» Минздрава России. Все больные с ХГБ имели одну из мутаций в гене CYBB, кодирующем субъединицу gp91phox (Х-сцепленнная ХГБ).
С использованием регистрации люминол-зависимой ХЛ мы подтвердили, что у всех пациентов с ХГБ нейтрофилы не образовывают АФК в ответ на стимуляцию ФМА, fMLP или А23187, то есть являются полностью дефицитными по NADPH-оксидазе (данные не приведены). Кроме того, такие нейтрофилы не образовывали NET в ответ на ФМА (рис. 1, Д), поскольку для ФМА-индуцированного НЕТоза требуется наличие АФК [13]. Вместе с тем ионофор А23187 инду-
цировал НЕТоз через 4 ч (рис. 1, В, Д). Инкубация нейтрофилов здоровых доноров с BAPTA-AM приводила к дозозависимому и эффективному подавлению НЕТоза, индуцированного как А23187, так и ФМА (рис. 1, А, Б), в то время как инкубация дефицитных по NADPH-оксидазе нейтрофилов с BAPTA-AM практически не вела к подавлению выброса хроматина (рис. 1, В, Д).
Мы полагаем, что отсутствие подавления А23187-индуцированного НЕТоза хелатором
BAPTA-AM у дефицитных по NADPH-оксидазе нейтрофилов (ХГБ) связано с избыточным входом внеклеточного Са2+ внутрь клетки. При активации нейтрофилов с помощью fMLP происходит быстрое открытие каналов CRAC и последующее закрытие этих каналов, обусловленное деполяризацией мембраны. В нейтрофилах пациентов с ХГБ деполяризация мембраны не происходит и каналы CRAC остаются открытыми, обеспечивая избыточный вход внеклеточного Са2+ [6]. По-
Рис. 1. Действие ингибитора внутриклеточного Са2+ BAPTA-AM на ФМА- и А23187-индуцированный НЕТоз
Нейтрофилы, выделенные из крови здоровых доноров (А, Б, Г) и пациентов с ХГБ (В, Д), адгезировали на покровных стеклах и далее инкубировали с BAPTA-AM в возрастающих концентрациях в течение 20 мин при 37°С. НЕТоз индуцировали А23187 или ФМА в течение 4 ч и 2 ч 40 мин соответственно. Данные представлены как среднее ± ошибка среднего для нейтрофилов здоровых доноров (n=3) и нейтрофилов пациентов с ХГБ (n=3). * - р < 0,05; *** - р < 0,001. На фотографиях представлены ней-трофилы здорового донора (Г) и нейтрофилы пациента с ХГБ (Д), прединкубированные с 5 мкМ BAPTA-AM в течение 20 мин при 37°С и стимулированные ФМА или А23187. Масштаб — 25 мкм. Увеличение 20*.
добное открытие каналов CRAC может происходить и под действием А23187 благодаря высвобождению Са2+ из внутриклеточных депо, хотя этот эффект по данным Магомед и Андерсон [18] может быть слабо выражен. Возможно, перенос Са2+, катализируемый ионофорами, также тормозится при деполяризации мембраны. Однако это может быть связано с тем, что наряду с электронейтральным обменом ионов Са2+ на протоны А23187 и иономицин переносят через мембрану положительно-заряженные комплексы Са2+ [19].
Нам было интересно выяснить, как истощение внутриклеточного Са2+ будет действовать на такую эффекторную функцию нейтрофилов, как окислительный взрыв. В следующей серии экспериментов нейтрофилы здоровых доноров инкубировали в присутствии BAPTA-AM в течение 20 мин и далее стимулировали окислительный взрыв А23187, ФМА и рецепторным активатором хемоаттрактантом fMLP. На рис. 2 можно видеть, что BAPTA-AM дозозависимо подавлял окислительный взрыв, индуцированный А23187 и fMLP, но не ФМА. Кроме того, ФМА-индуцированный окислительный взрыв происходил с одинаковой интенсивностью как в кальцийсодержащей, так и в безкальциевой среде (данные не приведены). Эти результаты указывают на то, что активация NADPH-оксидазы форболовым эфиром может происходить в отсутствие притока внеклеточного Са2+, что совпадает с данными других авторов [20], а фосфорилирование субъединиц ферментного комплекса может обеспечиваться Са2+-нечувствительными изоформами протеинкиназы С (PKCó, PKQ).
Что касается ФМА-индуцированного НЕТо-за, то, вероятно, основной мишенью BAPTA-AM в этом сигнальном пути является Са2+-чувст-вительный фермент PAD4.
Ранее мы показали [14], что А23187-инду-цированный НЕТоз нейтрофилов здоровых доноров и нейтрофилов, дефицитных по NADPH-ок-сидазе, происходит с участием митохондриальных АФК (мтАФК). В то же время в нормальных ней-трофилах активация NADPH-оксидазы также была необходима для индукции НЕТоза. По-видимому, генерация мтАФК существенно повышена при дефиците NADPH-оксидазы. Результаты, полученные в настоящей работе, позволяют объяснить этот феномен. Повышенный уровень внутриклеточного Са2+ у дефицитных по NADPH-оксидазе нейтрофилов должен стимулировать де-гидрогеназы в матриксе митохондрий и дыхание, способствуя усиленному образованию мтАФК. Кроме того, мы установили, что А23187-зави-симый нетотический сигнальный каскад происходит при активации митохондриальной поры, mPTP [14]. Повышенное содержание Са2+ в митохондриях нейтрофилов, дефицитных по NADPH-
Рис. 2. Оценка окислительного взрыва у нейтрофилов здоровых доноров.
Нейтрофилы здоровых доноров инкубировали в течение 20 мин в присутствии ВАРТА-АМ при 37°С. Далее стимулировали окислительный взрыв 2,5 мкМ А23187 (А), 30 нМ ФМА (Б) или 800 нМ ШЬР (В) в присутствии люминола (80 мкМ) и регистрировали хемилюминесценцию как указано в разделе «Материалы и методы». Данные представлены как среднее ± ошибка среднего (п = 5). *** -р < 0,001.
оксидазе, повышает вероятность открытия пор тРТР, что также ведет к усиленной генерации мтАФК. Интересно, что в нейтрофилах пациентов с ХГБ наблюдалась повышенная Са2+-зависимая продукция липидного медиатора воспаления лей-котриена В4 [21]. Можно полагать, что избыточный уровень Са2+ и мтАФК определяет как аберрантный НЕТоз, так и другие воспалительные процессы, ведущие к аутоиммунным и воспалительным заболеваниям, от которых часто страдают пациенты с ХГБ.
Таким образом, в нашей работе было впервые показано, что нейтрофилы пациентов с ХГБ не только ограничены в своей возможности бороться
с большим числом патогенов, но также имеют значительные отклонения в кальциевой регуляции и, как следствие, нарушение такого Са2+-зависимого процесса, как НЕТоз.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект №17-00-00088). Исследования были одобрены локальным комитетом по этике Российской детской клинической больницы ФГАОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Segal A.W. The NADPH oxidase and chronic granulomatous disease // Mol. Med. Today. 1996. Vol. 2. N 3. P. 129-135.
2. Leto T.L. The respiratory burst oxidase // Inflammation basic principles and clinical correlates / Eds. J.I. Gallin and R. Snyderman. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 1999. P. 769-787.
3. Schaff O, Foder B. Regulation of cytosolic calcium in blood cells // Physiol. Rev. 1993. Vol. 73. N 3. P. 547-582.
4. Mikoshiba K. Role of IP3 receptor signaling in cell functions and diseases // Adv. Biol. Regul. 2015. Vol. 57. P. 217-227.
5. Clemens R.A., Lowell C.A. CRAC channel regulation of innate immune cells in health and disease // Cell. Calcium. 2019. Vol. 78. P. 56-65.
6. Geiszt M., Kapus A., Német K., Farkas L., Ligeti E. Regulation of capacitative Ca2+ influx in human neutrophil granulocytes. Alterations in chronic granulomatous disease // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. N 42. P. 26471-26478.
7. Geiszt M., Kapus A., Ligeti E. Chronic granulomatous disease: more than the lack of superoxide? // J. Leukoc. Biol. 2001. Vol. 69. N 2. P. 191-196.
8. Brinkmann V., Reichard U., Goosmann C., Fauler B., Uhlemann Y., Weiss D.S., Weinrauch Y., Zychlinsky A. Neutrophil extracellular traps kill bacteria // Science. 2004. Vol. 303. N 5663. P. 1532-1535.
9. Steinberg B.E., Grinstein S. Unconventional roles of the NADPH oxidase: signaling, ion homeostasis, and cell death // Sci. STKE. 2007. Vol. 2007. N 379. P. pe11.
10. Metzler K.D., Goosmann C., Lubojemska A., Zychlinsky A., Papayannopoulos V. A myeloperoxidase -containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis // Cell. Rep. 2014. Vol. 8. N 3. P. 883-896.
11. Pinegin B., Vorobjeva N., Pinegin V. Neutrophil extracellular traps and their role in the development of chronic inflammation and autoimmunity // Autoimmun. Rev. 2015. Vol. 14. N 7. P. 633-640.
12. Neeli I., Radic M. Opposition between PKC iso-forms regulates histone deimination and neutrophil extracellular chromatin release // Front. Immunol. 2013. Vol. 4: 38.
13. Fuchs T.A., Abed U., Goosmann C., Hurwitz R., Schulze I., Wahn V., Weinrauch Y., Brinkmann V., Zychlin-sky A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps // J. Cell. Biol. 2007. Vol. 176. N 2. P. 231-241.
14. Vorobjeva N, Galkin I., Pletjushkina O., Golyshev S., Zinovkin R., Prikhodko A., Pinegin V., Kondratenko I., Pinegin B, Chernyak B. Mitochondrial permeability transition pore is involved in oxidative burst and NETosis of human neutrophils // Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis. 2020. Vol. 1866. N 5: 165664.
15. Douda D.N., Khan M.A., Grasemann H., Palani-yar N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2015. Vol. 112. N 9. P. 2817-2822.
16. Vorobjeva N., Prikhodko A., Galkin I., Pletjushkina O., Zinovkin R., Sud'ina G., Chernyak B., Pinegin B. Mi-tochondrial reactive oxygen species are involved in chemoat-tractant-induced oxidative burst and degranulation of human neutrophils in vitro // Eur. J. Cell. Biol. 2017. Vol. 96. N 3. P. 254-265.
17. Vorobjeva N.V., Pinegin B.V. Effects of the antioxidants Trolox, Tiron and Tempol on neutrophil extracellular trap formation // Immunobiology. 2016. Vol. 221. N 2. P. 208-219.
18. Mahomed A.G., Anderson R. Activation of human neutrophils with chemotactic peptide, opsonized zymosan and the calcium ionophore A23187, but not with a phorbol ester, is accompanied by efflux and store-operated influx of calcium // Inflammation. 2000. Vol. 24. N 6. P. 559-569.
19. Fasolato C., Pozzan T. Effect of membrane potential on divalent cation transport catalyzed by the "Electro neutral" ionophores A23187 and ionomycin // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. N 33. P. 19630-19636.
20. Gupta A.K., Giaglis S., Hasler P., Hahn S. Efficient neutrophil extracellular trap induction requires mobilization of both intracellular and extracellular calcium pools and is modulated by cyclosporine A // PLoS One. 2014. Vol. 9: e97088.
21. Song Z., Huang G., Chiquetto Paracatu L., Grimes D., Gu J., Luke C.J., Clemens R.A., Dinauer M.C. NADPH oxidase controls pulmonary neutrophil infiltration in the response to fungal cell walls by limiting LTB4 // Blood. 2020. Vol. 135. N 12. P. 891-903.
Поступила в редакцию 30.04.2020 г.
После доработки 03.06.2020 г.
Принята в печать 23.06.2020 г.
RESEARCH ARTICLE
NADPH oxidase modulates Ca2+-dependent formation of neutrophil extracellular traps
N.V. Vorobjeva1'*, B.V. Chernyak2
1Deptartment of Immunology, Biology Faculty, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1—12, Moscow, 119234, Russia;
2A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1—40, Moscow, 119992, Russia; *e-mail: nvvorobjeva@mail.ru
Chronic granulomatous disease (CGD) is a severe inherited immunodeficiency characterized by recurrent bacterial and fungal infections and aberrant inflammation. The CGD phenotype is due to deficiency of phagocytic NADPH oxidase, unable to generate reactive oxygen species (ROS). Such phagocytes are limited in phagocytosis and degranulation as well as a unique means of combating pathogens, neutrophil extracellular traps (NETs) formation, in response to many receptor and pharmacological stimuli. However, activation of NET formation by neutrophils isolated from the blood of CGD patients in response to calcium ionophores was described in our recent study. As was shown previously, neutrophils deficient in NADPH oxidase are not only unable to form ROS, but also have deficiency in the electrogenic activity of the enzyme and membrane depolarization upon activation. Therefore, these neutrophils have impaired extracellular Ca2+ influx and, as a result, multiple disorders in the synthesis of proinflammatory cytokines. In the present study, we showed that NET formation by CGD neutrophils in response to calcium ionophore A23187 is accompanied by excessive accumulation of intracellular Ca2+. We explain this disorder by the deficiency of the electrogenic function of mutant NADPH oxidase, which in healthy donor neutrophils causes membrane potential depolarization. The results obtained in our study indicate an important function of phagocytic NADPH oxidase as a modulator of Ca2+-dependent signaling pathways, and potentially can be used for treatment of CGD.
Keywords: human neutrophils, oxidative burst, reactive oxygen species, neutrophil extracellular traps, NETosis, chronic granulomatous disease
Сведения об авторах
Воробьева Нина Викторовна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. кафедры иммунологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел.: 8-495-939-46-46. e-mail: nvvorobjeva@mail.ru
Черняк Борис Викторович — докт. биол. наук, проф., зав. лаб. биоэнергетики клетки НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ. Тел.: 8-495-939-55-50; e-mail: bchernyak1@gmail.com
