CC BY
6
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
УДК 571.27
Роль изоформ протеинкиназы С в образовании нейтрофильных внеклеточных ловушек
Н.В. Воробьева1' * , С.С. Вахлярская2, Б.В. Черняк3
Кафедра иммунологии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,
Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12;
2Отделение клинической иммунологии и ревматологии, Российская детская клиническая больница, Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова,
Россия, 119571, г. Москва, Ленинский проспект, д. 117; 3Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Россия, 119992, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40 *e-mail: nvvorobjeva@mail.ru
Нейтрофилы высвобождают деконденсированный ядерный хроматин, или нейтрофиль-ные внеклеточные ловушки (NET, от Neutrophil Extracellular Trap) в ответ на большое количество разнообразных физиологических и фармакологических стимулов. Однако, кроме защиты хозяина от инфекции, NET играют важную роль в патогенезе различных аутоиммунных, воспалительных и злокачественных заболеваний. В этой связи понимание молекулярных механизмов образования NET, ведущее, как правило, к гибели ней-трофилов (НЕТоз), крайне важно для обеспечения контроля последствий аберрантного или избыточного выброса хроматина. Протеинкиназа C (PKC, protein kinase C) представляет собой серин/треониновую киназу, которая участвует в разнообразных функциях нейтрофилов, однако ее участие в НЕТозе изучено недостаточно. Поскольку у ней-трофилов человека описано пять изоформ РКС (а, Щ, Щ1, б и Z), в нашей работе был изучен их вклад в НЕТоз и окислительный взрыв с использованием ингибиторного анализа. Используя специфические ингибиторы изоформ PKC, мы показали, что PKCP, PKC6 и PKCZ участвуют в окислительном взрыве и НЕТозе, индуцированном кальциевым ионофором A23187, тогда как PKCP участвует в окислительном взрыве и НЕТозе при активации клеток миметиком диацилглицерола форбол-12-миристат-13-ацетатом.
Ключевые слова: нейтрофилы человека, нейтрофильные внеклеточные ловушки, НЕТоз, окислительный взрыв, изоформы протеинкиназы С
Нейтрофилы являются наиболее многочисленными лейкоцитами крови и первой линией защиты хозяина от патогенов. Являясь профессиональными фагоцитами, нейтрофилы содержат антимикробные ферменты в гранулах и отвечают в очагах воспаления за такие эффекторные функции, как фагоцитоз и дегрануляция, а также вызывают окислительный взрыв, который состоит в интенсивном образовании активных форм кислорода (АФК) при активации ферментного комплекса НАДФН-оксидазы. Новой эффекторной функцией нейтрофилов, впервые обнаруженной Такей и соавт. [1] и всесторонне исследованной в лаборатории Циклинского [2], является образование нейтрофильных внеклеточных ловушек (NET, от Neutrophil Extracellular Trap). NET состоят из деконденсированного хроматина, покрытого гистонами, антимикробными ферментами и кати-онными пептидами гранул, а также цитозольными белками [2, 3]. Процесс образования NET, веду-
щий к программируемой гибели клеток, был назван НЕТозом [4].
Впоследствии стало ясно, что, помимо защитной функции, NET играют существенную роль в патогенезе большого количества аутоиммунных, воспалительных и онкологических заболеваний [5—8]. В связи с этим понимание молекулярных механизмов НЕТоза важно для обеспечения контроля последствий нерегулируемого или избыточного образования NET.
Классический НЕТоз представляет собой многостадийный процесс, включающий активацию, образование АФК НАДФН-оксидазой, диссоциацию под действием пероксида водорода «азуросом», белковых комплексов, расположенных в мембранах азуросомных гранул [9], выход из азуросом сериновых протеаз (нейтрофильной эла-стазы — НЭ, катепсина G и азуроцидина) и миело-пероксидазы (МПО) в цитоплазму, миграцию НЭ и МПО в ядро, где вместе с пептидил-аргининде-
заминазой 4 (РЛБ4, рерИёук^шпе ёе1тта8е-4), цитруллинирующей гистоны, они способствуют деконденсации ядерного хроматина [2].
Образование НЕТ может быть индуцировано большим количеством разнообразных физиологических стимулов, таких как бактерии, грибы, простейшие, вирусы и продукты клеточной стенки бактерий (липополисахариды). НЕТоз также могут индуцировать антитела [10], цитокины (1Ь-8, 1Ь-1Р, ТНБ-а) [3, 11], микрокристаллы [12], кальциевые и калиевые [13] ионофоры, а также фармакологические стимулы — например, фор-боловые эфиры.
Большинство этих стимулов активирует НЕТоз, зависящий от АФК, генерируемых многокомпонентным ферментным комплексом НАДФН-оксидазой. НАДФН-оксидаза активируется после сборки четырех цитозольных субъединиц (р47рИох, р67рИох, р40рИох и Иае2) с трансмембранными субъединицами ^р91рИох и р22рИох), и его работа тонко регулируется фосфорилирова-нием протеинкиназой С [14].
В соответствии с общепринятой моделью активация РКС происходит после ее транслокации из цитозоля в мембрану. После активации РКС фосфорилирует остатки серина и треонина на субъединицах НАДФН-оксидазы. Семейство РКС млекопитающих включает 12 изоформ, разделенных на три подсемейства в соответствии с их доменной структурой и регуляцией [15]. Классические изоформы РКС (сРКС) включают РКСа, РКСР1, РКСРП и РКСу и активируются при связывании с фосфатидилсерином, диацилглицеро-лом (ДАГ) и Са2+, а также с миметиком ДАГ, ФМА (форбол-12-миристат-13-ацетат). Новые изоформы РКС (пРКС) включают РКСб, РКС£, РКСп и РКС9. Эти киназы нечувствительны к кальцию и активируются ДАГ и ФМА. Атипичные РКС (аРКС) представлены изоформами РКС^ и РКСтД, они нечувствительны к кальцию и не отвечают на ФМА и ДАГ, однако активируются фосфоинозитид-зависимой протеинкина-зой-1, фосфатидилинозитол-3-киназой и ее продуктом фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфатом. Как было показано в многочисленных исследованиях, нейтрофилы человека содержат пять изо-форм РКС (а, |31, РН, б и [16, 17].
Ранее было установлено, что изоформы РКС участвуют в различных функциях нейтрофилов, таких как окислительный взрыв, адгезия, деграну-ляция, фагоцитоз и апоптоз [18]. Однако мало что известно о том, какие изоформы РКС участвуют в НЕТозе, активируемом различными физиологическими и фармакологическими стимулами. В нашем исследовании было всесторонне изучено влияние классических, новых и атипичных изоформ РКС на НЕТоз нейтрофилов человека, активированных ионофором кальция А23187 и форболо-вым эфиром ФМА.
Материалы и методы
Реагенты. ФМА, A23187, хелеритрин (ингибитор всех изоформ PKC), роттлерин (ингибитор PKC6), LY333531 (ингибитор PKCß), миристои-лированный псевдосубстрат PKCZ (ингибитор PKCZ), верапамил, люминол были приобретены у Sigma-Aldrich (США). Краситель SYBR Green и смола ProLong Gold были закуплены в Thermo Fisher Scientific (Invitrogen, США).
Выделение первичных нейтрофилов человека. Все исследования с кровью проводили в соответствии с Хельсинкской деклараций ВМА 2000 г. и протоколом Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г. и были одобрены локальным комитетом по этике. Периферическую кровь здоровых доноров или пациентов с хронической гранулематозной болезнью (ХГБ) забирали в утренние часы натощак в полипропиленовые пробирки с гепарином (20 МЕ х мл-1 крови). Ней-трофилы выделяли с помощью центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности Ficoll-Hypaque (плотность 1,077 г/см3) в течение 25 мин при 400g и комнатной температуре как описано ранее [19]. Основную массу эритроцитов удаляли путем седиментации в декстране. Оставшиеся эритроциты лизировали в гипотоническом растворе хлорида натрия (0,2% NaCl) в течение 30 с и далее восстанавливали физиологический солевой состав путем добавления гипертонического хлорида натрия (1,6% NaCl). Нейтрофилы ресуспендировали в полной культуральной среде (ПКС), включающей RPMI 1640 с добавлением 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина и 1% инактиви-рованной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Полученные клетки были представлены на 98% гранулоцитами, а их жизнеспособность составляла более 99%, что определяли по исключению 0,1% трипанового синего. Нейтрофилы инкубировали в течение 1 ч при 4 °С перед экспериментом.
Оценка люминолзависимой хемилюминесценции.
Люминолзависимую хемилюминесценцию использовали для оценки суммарных АФК (внутри-и внеклеточных) как описано ранее [20].
Индукция и флуоресцентное окрашивание NET. Для обнаружения NET использовали флуоресцентную микроскопию. Для этого свежевыделен-ные нейтрофилы (2 х 105 кл/мл) в ПКС с 1% ЭТС адгезировали на круглых покровных стеклах, находящихся в 24-луночном планшете в объеме 500 мкл, в течение 30 мин при 37 °С. Нейтрофилы инкубировали в лунках с одним из ингибиторов РКС в течение 30 мин при 37 °С и 5% СО2. Образование NET индуцировали 30 нМ ФМА или 2 мкМ А23187 в течение 2 ч 40 мин и 4 ч соответственно. После стимуляции НЕТоза клетки фиксировали в лунках в 4%-ном растворе параформальдегида в течение 15 мин. Препараты погружали в SYBR Green, разведенный в PBS в соотношении 1:10000
в соответствии с рекомендацией производителя, и окрашивали в течение 7 мин при комнатной температуре в темноте. Подсчитывали общее количество клеток и количество нетотических клеток в каждом поле зрения, оценивали процент НЕТоза в нескольких полях зрения.
Статистическая обработка. Статистическую обработку данных проводили с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ЛКОУЛ), сопровождаемого тестом множественного сравнения Бонферрони для оценки различий между группами. Данные в тексте и на рисунках представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Статистически значимые значения p указаны на графиках: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001.
Результаты и обсуждение
Протеинкиназа С участвует в окислительном взрыве и НЕТозе, индуцированными различными стимулами. Чтобы выяснить, зависит ли НЕТоз нейтрофилов человека, активированный Л23187 и ФМА, от РКС, был применен специфический ингибитор всех изоформ РКС, хелеритрин. Действие хелеритрина также оценивали на модели окислительного взрыва, индуцированного Л23187 и ФМА, методом регистрации люминолзависимой хемилюминесции.
На рис. 1 (A, Б) можно видеть, что инкубация нейтрофилов с хелеретрином в возрастающих концентрациях приводила к значительному и до-зозависимому подавлению окислительного взрыва, индуцированного обоими стимулами. НЕТоз, стимулированный A23187 и ФМА, также дозоза-висимо подавлялся хелеритрином (рис. 1, В, Г и рис. Прилож.1А), что указывает на его зависимость от активации PKC при обоих способах стимуляции.
Мы предположили, что PKC, помимо субъединиц НАДФН-оксидазы (окислительный взрыв), может фосфорилировать некоторые другие субстраты, играющие важную роль в активации НЕТоза. Для проверки этого предположения мы использовали нейтрофилы, выделенные из крови больных ХГБ, имеющих мутации, полностью инак-тивирующие НАДФН-оксидазу. Такие нейтрофи-лы не способны генерировать оксидаза-зависимые АФК, а также не образуют NET в ответ на многие стимулы, включая ФМА (рис. Прилож.1Б), однако образуют NET в ответ на А23187 (2 мкМ). Инкубация нейтрофилов больных ХГБ в присутствии хе-леритрина в течение 30 мин приводила к значительному подавлению НЕТоза (рис.1, Д и рис. Прилож.1Б), что указывало на участие в нем дополнительных субстратов РКС.
о 1 2
Хелеритрин (цМ)
Рис. 1. Оценка участия протеинкиназы С в окислительном взрыве и НЕТозе нейтрофилов человека.
Свежевыделенные нейтрофилы человека инкубировали в присутствии специфического ингибитора РКС хелеритрина в течение 30 мин. Окислительный взрыв индуцировали 2 мкМ A23187 (A) или 30 нМ ФМА (Б). Продукцию АФК рассчитывали как площадь под кривыми люминолзависимой хемилюминесценции и выражали в процентах от контроля (контроль, 100% — стимулированные нейтрофилы).
Для оценки НЕТоза нейтрофилы здоровых доноров предварительно инкубировали на покровных стеклах с хелеритрином в течение 30 мин. Образование NET индуцировали 2 мкМ A23187 (В) или 30 нМ ФМА (Г) в течение 4 ч и 2 ч 40 мин соответственно. Клетки фиксировали 4%-ным параформальдегидом и окрашивали SYBR Green для визуализации хроматина; n=5; *** p < 0,001. (Д) Нейтрофилы, выделенные из крови больных ХГБ, инкубировали в присутствии хелеритрина (0,5 мкМ) в течение 30 мин. Образование NET индуцировали 2 мкМ A23187 в течение 4 ч; n = 3; *** p < 0,001.
Таким образом, наши результаты подтвердили, что PKC участвует в НАДФН-оксидаза-зависимом окислительном взрыве, индуцированном A23187 и ФМА. Кроме того, процесс образования NET зависит не только от НАДФН-оксидазы, но и от РКС-зависимого фосфорилирования других неизвестных мишеней.
Роль различных изоформ РКС в окислительном взрыве и НЕТозе. Нам было интересно выяснить, какие изоформы PKC участвуют в НЕТозе, стимулированном А23187 и ФМА, поскольку ранее были получены противоречивые данные [21, 22]. Учитывая, что в нейтрофилах человека обнаружено всего пять изоформ РКС (a, PI, PII, б и Z), причем РКСа содержится в минорных количествах [23], мы использовали селективные ингибиторы PKCP (LY333531), PKC6 (роттлерин) и PKCZ (псевдосубстрат PKCZ)
Эффекты ингибиторов были исследованы на модели окислительного взрыва, индуцированного А23187 и ФМА. На рис. 2 (А, Б) можно видеть, что ингибиторы PKCP и PKC6 подавляли А23187-индуцированный окислительный взрыв эффективно и дозозависимым способом (подавление ингибитором PKCZ не показано). Это указывает на то, что все три изоформы РКС участвуют в фосфо-рилировании субъединиц НАДФН-оксидазы. Однако в случае стимуляции ФМА только ингибиторы PKCP и PKC6 подавляли окислительный взрыв (рис. 2, В, Г), в то время как ингибитор изоформы PKCZ был неэффективен (не показано). Этот результат согласуется с тем, что изоформа PKCZ не чувствительна к ДАГ.
Действие ингибиторов PKC было исследовано при стимуляции НЕТоза как А23187, так и ФМА. Как показано на рис. 2 (Д, Е), ингибиторы изоформ PKCP и PKCZ эффективно и дозозависимо подавляли А23187-индуцированный НЕТоз, что совпадало с ингибированием окислительного взрыва. Однако ингибитор PKC6 роттлерин, к нашему большому удивлению, был абсолютно неэффективен при использовании в широком диапазоне концентраций (не показано). В случае ФМА-стимули-рованного НЕТоза только ингибитор изоформы PKCP LY333531 оказывал на него подавляющее действие (рис. 2, Ж), в то время как ингибитор PKCZ и роттлерин были неэффективны (не показано).
Таким образом, из полученных результатов видно, что хотя роттлерин подавлял окислительный взрыв, индуцированный А23187 и ФМА, НЕТоз в этих условиях не был подавлен. Мы можем объяснить это явление остаточной функцией НАДФН-оксидазы в случае ФМА-индуцированного НЕТоза и образованием митохондриальных АФК в случае А23187-индуцированного НЕТоза, как это происходит в нейтрофилах больных ХГБ [24].
Нам также было интересно выяснить, участвуют ли изоформы PKC (Р, б и Z) в фосфорилирова-нии других компонентов нетотического каскада
помимо НАДФН-оксидазы. Для этого мы исследовали НЕТоз, индуцированный А23187, в нейтрофилах больных ХГБ. Как показано на рис. 2 (З) и рис. Прилож.2, ингибиторы PKCP, PKC6 и PKCZ подавляли А23187-индуцированный НЕТоз в нейтрофилах больных ХГБ. Таким образом, все три изоформы РКС участвуют в фосфорилировании иных мишеней, кроме субъединиц НАДФН-оксидазы, необходимых для образования NET.
Плейотропное действие роттлерина в нейтро-филах человека. В предыдущем разделе нашего исследования мы получили противоречивые данные о влиянии роттлерина на различные эффекторные функции нейтрофилов. С одной стороны, роттле-рин ингибировал А23187- и ФМА-индуцирован-ный окислительный взрыв, а с другой — не оказывал какого-либо действия на НЕТоз. Кроме того, роттлерин подавлял А23187-индуцированный НЕТоз в нейтрофилах больных ХГБ. Объяснение этих эффектов, возможно, связано с тем, что ротт-лерин, помимо ингибирования PKC6, оказывает плейотропное действие на различные клетки [25].
Известно, что почти все иммунные реакции нейтрофилов, включая окислительный взрыв и НЕТоз, на определенной стадии требуют повышения уровня цитоплазматического Ca2+. Нейтро-филы как невозбудимые клетки используют для генерации кальциевых сигналов депо-управляе-мые Ca2+-каналы плазматической мембраны [26]. Однако, как недавно стало известно, в нейтро-филах имеются также потенциал-зависимые Ca2+-каналы (voltage-gated Ca2+ channels, VGCC) L-типа [27], больше характерные для возбудимых клеток. На модели хрусталика глаза мышей было показано, что роттлерин является агонистом кальциевых каналов L-типа [28].
Мы предположили, что роттлерин способствовал открытию этих каналов и повышению концентрации цитоплазматического Ca2+, компенсируя его действие как ингибитора PKC6, снижающего активность НАДФН-оксидазы. Для доказательства нашей гипотезы мы использовали А23187 и ФМА в концентрациях, которые вызывали слабый НЕТоз (рис. 3). Добавление роттлерина на фоне таких доз стимуляторов вызывало дозоза-висимое повышение НЕТоза (рис. 3, А, Б). Чтобы подтвердить, что роттлерин усиливает НЕТоз, действуя на VGCC L-типа, мы использовали хорошо известный антагонист этих каналов, верапа-мил. На рис. 3 (В, Г) и рис. Прилож.3 видно, что стимуляция как А23187-, так и ФМА-индуци-рованного НЕТоза под действием роттлерина была подавлена верапамилом. Интересно, что ве-рапамил не только компенсировал стимулирующее действие роттлерина, но и ингибировал НЕТоз, индуцированный А23187 и ФМА. Эти данные указывают на то, что как А23187, так и ФМА могут стимулировать открытие VGCC L-типа, что вносит существенный вклад в индукцию НЕТоза.
Рис. 2. Оценка участия изоформ РКС в окислительном взрыве и НЕТозе, индуцированных различными стимулами. Нейтрофилы инкубировали в присутствии селективных ингибиторов изоформ РКС ТУ333531 (ингибитор РКС|3) В, Д, Ж, З), роттлерина (ингибитор РКСб) (Б, Г, З) или псевдосубстрата РКС^ (ингибитор РКС^) (Е, З) в течение 30 мин. Окислительный взрыв и НЕТоз индуцировали и анализировали как указано на рис. 1; п=3; * р < 0,05; *** р < 0,001.
Рис. 3. Действие роттлерина на НЕТоз, индуцированный стимуляторами в низких дозах
(А, Б) Нейтрофилы здоровых доноров инкубировали в присутствии роттлерина в повышающихся концентрациях, далее проводили стимуляцию НЕТоза A23187 (1,5 мкМ) или ФМА (20 нМ) в низких дозах в течение 4 ч и 2 ч 40 мин соответственно. (В, Г) Нейтрофилы инкубировали в присутствии 50 мкМ верапамила в течение 10 мин, далее добавляли 10 мкМ роттлерина и продолжали инкубацию в течение 30 мин. НЕТоз индуцировали 1,5 мкМ A23187 или 20 нМ PMA в течение 4 ч и 2 ч 40 мин соответственно. Клетки окрашивали и анализировали как указано на рис. 1; n = 3; *** p < 0,001.
В предварительных экспериментах мы показали, что роттлерин не вызывает НЕТоз в неактивированных нейтрофилах (данные не представлены). Это позволило предположить, что роттлерин действует как агонист УОСС Ь-типа лишь после деполяризации мембраны (которая сопровождает активацию нейтрофилов), как это происходит в возбудимых клетках. Деполяризация мембраны нейтрофилов возникает при активации НАДФН-оксидазы благодаря ее электрогенной функции [26]. В нейтрофилах больных ХГБ деполяризация мембраны не происходит, что предотвращает открытие УОСС Ь-типа под действием роттлерина, и в отсутствие компенсаторного эффекта роттле-рин подавляет НЕТоз как ингибитор РКС5.
Таким образом, наши результаты показали, что РКС5 критически важна для активации НЕТоза, по крайней мере, в нейтрофилах больных ХГБ. Вместе с тем полученные результаты не позволяют оценить роль РКС5 в НЕТозе нейтрофи-лов здоровых доноров, поскольку ингибитор
РКС5 роттлерин является также агонистом УОСС Ь-типа и стимулирует НЕТоз, компенсируя возможный ингибиторный эффект.
Таким образом, в нашей работе было впервые показано, что кальциевый ионофор А23187 индуцирует окислительный взрыв и НЕТоз при участии классических (РКСр), новых (РКС5) и атипичных (РКС£) изоформ РКС (рис. 2, 3). Наши результаты показали, что миметик ДАГ, ФМА, стимулировал окислительный взрыв при участии РКСР и РКС5 (рис. 2), в то время как для индукции НЕТоза доказано лишь участие РКСр.
Работа выполнена в рамках проекта «Молекулярные и клеточные основы иммунитета» (проект 21-1-21, номер ЦИТИС 121042600047-9). Исследования были одобрены локальным комитетом по этике Российской детской клинической больницы ФГАОУ ВО «РНИМУ имени Н И. Пирогова» Минздрава России. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
CTHCOK AHTEPATYPH
1. Takei H., Araki A., Watanabe H., Ichinose A., Sendo F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis // J. Leukoc. Biol. 1996. Vol. 59. N 2. P. 229-240.
2. Brinkmann V., Reichard U., Goosmann C., Fauler B., Uhlemann Y., Weiss D.S., Weinrauch Y, Zychlinsky A. Neutrophil extracellular traps kill bacteria // Science. 2004. Vol. 303. N 5663. P. 1532-1535.
3. Fuchs T.A., Abed U., Goosmann C., Hurwitz R., Schulze I., Wahn V., Weinrauch Y., Brinkmann V., Zychlinsky A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps // J. Cell. Biol. 2007. Vol. 176. N 2. P. 231-241.
4. Steinberg B.E., Grinstein S. Unconventional roles of the NADPH oxidase: signaling, ion homeostasis, and cell death // Sci. STKE. 2007. Vol. 2007. N 379: pe11.
5. Vorobjeva N.V., Pinegin B.V. Neutrophil extracellular traps: mechanisms of formation and role in health and disease // Biochemistry (Mosc). 2014. Vol. 79. N 12. P. 1286-1296.
6. Pinegin B., Vorobjeva N., Pinegin V. Neutrophil extracellular traps and their role in the development of chronic inflammation and autoimmunity // Autoimmun. Rev. 2015. Vol. 14. N 7. P. 633-640.
7. Vorobjeva N.V., Chernyak B.V. NETosis: molecular mechanisms, role in physiology and pathology // Biochemistry (Mosc). 2020. Vol. 85. N 10. P. 1178-1190.
8. Vorobjeva N.V. Neutrophil extracellular traps: new aspects // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2020. Vol. 75. N 4. P. 173-188.
9. Metzler K.D., Goosmann C., Lubojemska A., Zychlinsky A., Papayannopoulos V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis // Cell. Rep. 2014. Vol. 8. N 3. P. 883-896.
10. Garcia-Romo G.S., Caielli S., Vega B., Connolly J., Allantaz F., Xu Z., Punaro M., Baisch J., Guiducci C., Coffman R.L., Barrat F.J., Banchereau J., Pascual V. Netting neutrophils are major inducers of type I IFN production in pediatric systemic lupus erythematosus // Sci. Transl. Med. 2011. Vol. 3. N 73: 73ra20.
11. Keshari R.S., Jyoti A., Dubey M., Kothari N., Kohli M., Bogra J., Barthwal M.K., Dikshit M. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition // PLoS One. 2012. Vol. 7. N 10: e48111.
12. Rada B. Neutrophil extracellular traps and microcrystals // J. Immunol. Res. 2017. Vol. 2017: 2896380.
13. Kenny E.F., Herzig A., Krüger R., Muth A., Mondal S., Thompson P.R., Brinkmann V., Bernuth H.V., Zychlinsky A. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways // Elife. 2017. Vol. 6: e24437.
14. Babior B.M. NADPH oxidase // Curr. Opin. Immunol. 2004. Vol. 16. N 1. P. 42-47.
15. Steinberg S.F. Mechanisms for redox-regulation of protein kinase C // Front. Pharmacol. 2015. Vol. 6: 128.
16. Korchak H.M., Kilpatrick L.E. Roles for beta II-protein kinase C and RACK1 in positive and negative signaling for superoxide anion generation in differentiated
HL60 cells // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. N 12. P. 8910-8917.
17. Waki K., Inanami O., Yamamori T., Nagahata H., Kuwabara M. Involvement of protein kinase Cdelta in the activation of NADPH oxidase and the phagocytosis of neutrophils // Free Radic. Res. 2006. Vol. 40. N 4. P. 359-367.
18. Bertram A., Ley K. Protein kinase C isoforms in neutrophil adhesion and activation // Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.). 2011. Vol. 59. N 2. P. 79-87.
19. Vorobjeva N., Prikhodko A., Galkin I., Pletjushkina O., Zinovkin R., Sud'ina G., Chernyak B., Pinegin B. Mitochondrial reactive oxygen species are involved in chemoattractant-induced oxidative burst and degranulation of human neutrophils in vitro // Eur. J. Cell. Biol. 2017. Vol. 96. N 3. P. 254-265.
20. Vorobjeva N.V., Pinegin B.V. Effects of the antioxidants Trolox, Tiron and Tempol on neutrophil extracellular trap formation // Immunobiology. 2016. Vol. 221. N 2. P. 208-219.
21. Neeli I., Radic M. Opposition between PKC isoforms regulates histone deimination and neutrophil extracellular chromatin release // Front. Immunol. 2013. Vol. 4: 38.
22. Gray R.D., Lucas C.D., MacKellar A., Li F., Hiersemenzel K., Haslett C., Davidson D.J., Rossi A.G. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps // J. Inflamm. (Lond.). 2013. Vol. 10. N 1: 12.
23. Dang P.M., Hakim J., Perianin A. Immunochemical identification and translocation of protein kinase C zeta in human neutrophils // FEBS Lett. 1994. Vol. 349. N 3. P. 338-342.
24. Vorobjeva N., Galkin I., Pletjushkina O., Golyshev S., Zinovkin R., Prikhodko A., Pinegin V., Kondratenko I., Pinegin B., Chernyak B. Mitochondrial permeability transition pore is involved in oxidative burst and NETosis of human neutrophils // Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis. 2020. Vol. 1866. N 5: 165664.
25. Soltoff S.P. Rottlerin is a mitochondrial uncoupler that decreases cellular ATP levels and indirectly blocks protein kinase Cdelta tyrosine phosphorylation // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. N 41. P. 37986-37992.
26. Geiszt M., Kapus A., Nemet K., Farkas L., Ligeti E. Regulation of capacitative Ca2+ influx in human neutrophil granulocytes. Alterations in chronic granulomatous disease // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. N 42. P. 26471-26478.
27. Harfi I., Corazza F., D'Hondt S., Sariban E. Differential calcium regulation of proinflammatory activities in human neutrophils exposed to the neuropeptide pituitary adenylate cyclase-activating protein // J. Immunol. 2005. Vol. 175. N 6. P. 4091-4102.
28. Xu S.Z. Rottlerin induces calcium influx and protein degradation in cultured lenses independent of effects on protein kinase C delta // Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 2007. Vol. 101. N 6. P. 459-464.
Поступила в редакцию 03.02.2022 После доработки 01.05.2022 Принята в печать 20.05.2022
RESEARCH ARTICLE
The role of protein kinase C isoforms in the formation of neutrophil extracellular traps
N.V. Vorobjeva1' * , S.S. Vakhlyarskaya2, В.У. Chernyak3
1Department of Immunology, Biology Faculty, Lomonosov Moscow State University, 1—12 Leninskie Gory, Moscow, 119234, Russia; 2Russian Children's Clinical Hospital, N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, 117 Leninsky prospect, Moscow, 119571, Russia; 3A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, 1—40 Leninskie Gory, Moscow, 119992, Russia *e-mail: nvvorobjeva@mail.ru
Neutrophils release decondensed nuclear chromatin or neutrophil extracellular traps (NET) in response to a great number of physiological and pharmacological stimuli. However, apart from the host defensive function, NETs play an essential role in the pathogenesis of various autoimmune, inflammatory, and malignant diseases. Therefore, understanding the molecular mechanisms of NET formation, usually leading to the neutrophil death (NETosis), is important to control the consequences of aberrant or excessive NET release. Protein kinase C (PKC) is a serine/threonine kinase that is involved in a variety of neutrophil functions, but its role in NETosis is not well understood. Since five PKC isoforms (а, Щ, PII, 6, and Z) have been described in human neutrophils, we studied their contribution to NETosis and oxidative burst using inhibitory analysis. Using specific PKC isoform inhibitors, we have shown that PKCP, PKC6, and PKCZ are involved in the oxidative burst and NETosis activated by calcium ionophore A23187, while PKCP is involved in the oxidative burst and NETosis upon cell activation by diacylglycerol mimetic phorbol 12-myristate 13-acetate.
Keywords: human neutrophils, neutrophil extracellular traps, NETosis, oxidative burst, protein kinase C isoforms
Funding: The research was carried out within the framework of the project "Molecular and cellular bases of immunity" (project 21-1-21, CITIS no. 121042600047-9).
Сведения об авторах
Воробьева Нина Викторовна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. кафедры иммунологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-46-46. e-mail: nvvorobjeva@mail.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5233-9338
Вахлярская Светлана Сергеевна — канд. мед. наук, врач-аллерголог-иммунолог отделения клинической иммунологии и ревматологии Российской детской клинической больницы. Тел.: 8-800-555-04-94; e-mail: vahlyarskaya@mail.ru
Черняк Борис Викторович — докт. биол. наук, проф., зав. лаб. биоэнергетики клетки НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ. Тел.: 8-495-939-55-50; e-mail: bchernyak1@gmail.com
ПРИЛОЖЕНИЕ
Б Нейтрофилы больного ХГБ
Рис. Прилож.1. Оценка участия протеинкиназы С в НЕТозе нейтрофилов человека.
Представлены фотографии нейтрофилов здорового донора, инкубированные в присутствии хелеритрина и стимулированные А23187 и ФМА. Дозы хелеритрина в случае A23187- и ФМА-стимулированных нейтрофилов составляют 0,5 мкМ и 2 мкМ соответственно. Фотографии получены с помощью микроскопа Leica DM LB, оснащенного камерой Leica DC300F («Leica Microsystems», Германия). Масштаб — 25 мкм.
Нейтрофилы больного ХГБ
Рис. Прилож.2. Оценка участия изоформ РКС в А23187-индуцированном НЕТозе нейтрофилов пациентов с ХГБ. На фотографиях показаны нейтрофилы больного ХГБ, инкубированные в присутствии 5 мкМ ЬУ333531, 10 мкМ роттлерина, 10 мкМ псевдосубстрата РКС<; и стимулированные А23187. Масштаб — 25 мкм.
А23187 r 1AZ3187-WPOTT
. ' * * • f •
!» * • . *
• • с
А23187 + Ротт + Вер j « V
• •• о * г * *
* ••
гтт
S * ? • <<•• • а
* и
v _ ♦ • * i
Л #
ъ
< в
•
ФМА + Ротт
*
• t 4
- .1
> 9 * % -* .1 » *
Рис. Прилож.3. Действие роттлерина на НЕТоз, индуцированный стимуляторами в низких дозах.
На фотографиях показаны нейтрофилы здорового донора, инкубированные в присутствии 50 мкМ верапамила в течение 10 мин, и 10 мкМ роттлерина — в течение последующих 30 мин. НЕТоз индуцировали слабыми дозами A23187 (1,5 мкМ) и PMA (20 нМ) в течение 4 ч и 2 ч 40 мин соответственно. Масштаб — 25 мкм.
