CC BY
58
Сер. 3. 2009. Вып. 1
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
УДК 577.112. 31
Е. Ю. Павлова, Д. А. Жебрун, Т. Н. Прияткина
ОСОБЕННОСТИ НУКЛЕАЗНОЙ ФРАГМЕНТАЦИИ ДНК В ХРОМАТИНЕ ДЕРЕПРЕССИРОВАННЫХ ГЕНОВ
Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра биохимии биолого-почвенного факультета
Введение. С развитием нуклеосомной концепции стали известны основные принципы упаковки ДНК в хроматине [30, 41]. Механизмы обратных процессов — декомпакти-зации нуклеосомных цепей для реализации ее матричных функций — остаются до конца не выясненными. В исследовании характера преобразования (ремоделирования) нуклеосом для транскрипции перспективным подходом является анализ нуклеазной фрагментации ДНК в составе ядер, позволяющий установить изменения в характере ДНК-гистоновых взаимодействий. Наиболее изучено действие ДНКазы I и микрококковой нуклеазы (МНазы). Регулярное чередование участков ДНК, прочно связанных с гистонами в составе компактных частиц, и свободной ДНК межнуклеосомных линкеров в структурных единицах компактного хроматина (нуклеосомах) определяет нуклеосомную — 200 п. н. (пар нуклеотидов) — периодичность в распределении нуклеазных разрывов и достижение лимита реакции при переваривании свободных линкеров и выщеплении мононуклеосом-ных фрагментов [17, 28, 30, 40, 60].
Имеющиеся данные пока не привели к ясному пониманию характера преобразований нуклеосом в хроматине кодирующих областей на различных стадиях активации генов. Наиболее общим биохимическим критерием дерепрессированного хроматина является доступность всей внутринуклеосомной ДНК для расщепления ДНКазой I [8, 21, 24, 57, 60] и для сиквенс-специфического белкового связывания [14, 16, 39, 43].
Новый подход высоко разрешающего картирования ДНК-гистоновой ассоциации in vivo в масштабах целых геномов дрожжей, дрозофилы и человека, включающий имму-нопреципитацию хроматиновых фрагментов и сканирование преципитата на содержание ген-специфических сегментов, позволил установить, что как промоторная ДНК [9], так и ДНК единиц транскрипции многих активных генов не связаны с гистонами [31, 51, 59, 62]. На индуцибельном дрожжевом гене gal удалось показать, что связь ДНК с гистонами теряется сразу после добавления индуктора и возобновляется через 1 мин после прекращения транскрипции [51]. Потеря ДНК-гистоновых контактов на всем протяжении кодирующей области gal регистрируется и при 10-кратном снижении индекса индукции и продукции gal-РНК [51]. Анологичное, независимое от интенсивности транскрипции, освобождение ДНК из комплекса с гистонами в границах единицы транскрипции наблюдали также при индукции гена hsp82 дрозофилы [62].
О декомпактизации нуклеосом, связанной с процессом транскрипции, свидетельствуют и данные ультраструктурного анализа, визуализирущего полностью развернутую кон-формацию ДНК (соответствующую длине B формы) в активных единицах транскрипции,
© Е. Ю. Павлова, Д. А. Жебрун, Т. Н. Прияткина, 2009
независимо от плотности распределения элонгирующих РНК полимераз [20, 26, 37, 52, 54]. Однако в хроматиновой оси транскрибируемых участков иммунохимическими методами выявляются все коровые гистоны [37]. Более того, ДНК кодирующих областей активных и компетентных к транскрипции генов, полностью расщепляемая ДНКазой I до кисло-торастворимых продуктов, резистентна к действию микрококковой нуклеазы (МНазы) [8, 21, 57]. По вопросу о том, соответствует ли характер протекции нуклеосомному типу организации хроматина, данные противоречивы [обз. 11, 12, 60].
В первых исследованиях, проведенных на глобиновых и овальбуминовых [8, 21, 57], а также р-РНК генах [35, 36, 44, 45] с использованием еще техники гибридизации в растворе, не было обнаружено различий между их активным и репрессированным состояниями по скорости переваривания ДНК МНазой и ее распределению в спектре фрагментов, кратных структурной единице. Последующие анализы методом блот-гибридизации, позволяющим получать более точные результаты, выявили большое разнообразие хроматина дерепрессированных генов по характеру МНазной фрагментации их ДНК. Наряду с данными о сохранении нуклеосомной регулярности МНазных разрывов [3, 9, 22], существуют многочисленные свидетельства ее нарушений. В частности, продукция монотонных по длине фрагментов, накладывающихся на фрагменты нуклеосомного ладера [6, 33, 42, 48, 29], или полная потеря дискретности — образование широкого спектра МНазоустой-чивых фрагментов гетерогенной величины [12, 13, 39, 55, 58]. При картировании сайтов разрывов методом непрямого концевого мечения фрагментов ДНК [61] было установлено, что после индукции ряда генов доступные для МНазы участки в кодирующих областях не совпадают с позициями межнуклеосомных линкеров [6, 42, 49]. Эти данные привели к предположению о смещении нуклеосом при транскрипции или существовании на активных генах нескольких фаз нуклеосомного устройства.
В качестве причин неоднозначности результатов рассматривают множественность состояний, в которых могут быть представлены индивидуальные гены и их участки в клеточной популяции. Одновременное присутствие в однотипных клетках репрессированой, компетентной и транскрибируемой форм показано для некоторых повторяющихся генных кластеров [13, 16, 19]. Того же можно ожидать для уникальных генов, индуцируемых к транскрипции от репрессированного состояния в интерфазе. Действие внутриядерных нуклеаз и протеаз во время инкубации и потеря нативной конформации хроматина при накоплении одно- и двунитевых разрывов ДНК [10] создают дополнительные трудности в оценке наблюдаемых характеров его фрагментации экзогенными ферментами. Противоречивость данных по организации активного хроматина не позволяет прийти к определенным заключениям о механизмах транскрипции эукариотических генов.
Мы исследовали характер фрагментации ДНК генов trp-оксигеназы (to) и tyr-аминотрансферазы (tat) в ядрах клеток печени (где они экспрессируются) и мозга крыс (находятся в репрессированном состоянии) тремя нуклеазами: МНазой, ДНКазой I и ДНКа-зой II, различающимися по механизму нуклеолитического действия [15, 17]. ДНКаза I вводит одноцепочечные разрывы и расщепляет свободную ДНК в сайтах их совпадений. МНаза осуществляет одновременный симметричный разрыв двух цепей двойной спирали. ДНКаза II продуцирует одно- и двунитевые разрывы с равной вероятностью [7].
To и tat гены представлены одной копией в геноме крыс. Их экспрессия тканеспеци-фична и две ступени активации разделены во времени. Компетентность к транскрипции устанавливается в предшественниках гепатоцитов на конечных стадиях эмбриогенеза и сохраняется при последующих клеточных генерациях. Транскрипция индуцируется в раннем постнатальном развитии [4, 50, 53]. Такая система регуляции to и tat генов
исключает присутствие в клетках печени взрослых животных их репрессированных форм. Число копий этих генов, вовлеченных в транскрипцию, в норме в печени взрослых крыс, по-видимому, не превышает 40 %, остальные сохраняют компетентное к транскрипции (доступность к индуцирующим сигналам) состояние [23, 46].
Также был попытка свести к минимуму воздействие внутриядерных нуклеаз и про-теаз в процессе получения ядер и инкубации с экзогенными ферментами. Для этого все операции по очистке ядер проводили при температуре около 0°, растворы охлаждали до от -1 °С ... -3 °С, все промывающие растворы предварительно охлаждали до -2 °С ... -3 °С, инкубацию ядер вели в градиенте температур от 0 °С до +20 °С в течение 10-15 мин. Интенсивность обработки регулировали только вариациями концентрации ферментов. Полагаем, что при этих условиях время их действия является достаточно кратким.
Нами установлено, что ни одна из нуклеаз (ДНКаза I, ДНКаза II и МНаза) практически не продуцирует в ядрах клеток печени фрагментов генов to и tat с длиной мономеров или олигомеров нуклеосомного повтора, образующихся при нуклеазной фрагментации хроматина с канонической нуклеосомной структурой. В лимите переваривания МНазой, который достигается при кратком действии фермента в насыщающей концентрации, ДНК кодирующих областей обоих генов сохраняется в гидролизатах преимущественно в виде протяженных (от 1500 п. н.) фрагментов, значительная часть которых соответствует по длине полноразмерным единицам транскрипции (19 000 и 11 000 п. н. для to и tat соответственно [50, 53]). В сходных условиях под действием ДНКазы I вся to- и tat-ДНК переходит в короткие кислоторастворимые или негибридизующиеся фрагменты. ДНКаза II по характеру фрагментации хроматина to и tat генов в их активном состоянии оказалась сходной с МНазой.
Методы исследования. Для получения ДНК-зондов в работе использовали плазмиду pUS19x (pC), содержащую tat-ген [53], и pTO (E-3,3), включающую центральный сегмент кодирующей области гена to [2].
Ядра выделяли из клеток печени и мозга беспородных белых крыс после лизиса цитоплазмы в растворе тритона Х 100. Охлажденную во льду ткань промывали раствором 1 (0,05 М tris-HCl буфер, pH 7,5/0,025 M KCl/0,005 M MgCl2/ 0,25 M сахароза, ТКМ [34]), измельчали в ледяной суспензии ТКМ и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в десятикратном по отношению к исходной массе ткани (m) объеме (v) ТКМ. Гомогенат фильтровали через капроновый фильтр и центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин. Осадок промывали тем же раствором и суспендировали (2 мин тефлон-стекло гомогенизации) в растворе 2 (0,5 % тритон Х 100 в буфере ТКМ, 1:2, m:v). Суспензию выдерживали 10 мин при 2 °С ... 4 °C, затем разбавляли в 5 раз ТКМ и центрифугировали. Плотный белый осадок ядер промывали 2 раза ТКМ (1:10, m:v) и затем раствором 3 (0,01 М tris-HCl буфер, pH 7,5; 0,003 M CaCl2) в том же соотношении к массе исходной ткани. При всех промывках ядерные осадки суспендировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком и осаждали центрифугированием при 1000 g в течение 7-10 мин. Всю операцию по очистке ядер проводили при температуре около 0 °C. Все промывающие растворы предварительно охлаждали до -1° ... -3 °С.
Для действия МНазы ядерные осадки суспендировали в 0,010 М tris-HCl буфере, pH 7,5, содержащем 1,5 мМ CaCl2 и 1 мМ PMSF («Sigma») (1:1, m:v). К суспензии, охлажденной до 0° ... 2 °C, добавляли МНазу («Sigma», 10-360 A260 ед. на 1 мг ДНК). Пробы помещали в водяную баню с температурой 20 °C на 10-15 мин. Обработку ДНКазой I («Sigma») проводили при тех же условиях в буфере ТКМ, разведенном в 2 раза (БД I), ДНКазой II («Sigma») — в 0,010 М tris-HCl буфере, pH 7,0, содержащем 0,8 мМ MgCl2 (БД II).
Во все инкубационные растворы добавляли PMSF до 1 мМ. Реакцию останавливали добавлением Ds-Na, ЭДТА и ЭГТА.
ДНК из ядер печени и мозга выделяли с помощью фенольной депротеинизации в стандартных условиях [1] после обработки протеиназой K («Sigma») и РНКазой (по 200-400 мкг/мл) в 0,05 М tris-HCl буфере, pH 8,0, содержащем 0,5 % Ds-Na, 0,2 М NaCl, 10 мМ ЭДТА, 2 мМ ЭГТА при 37 °C в течение 2 ч. ДНК осаждали этанолом при -20 °C и растворяли в буфере ТЕ [1].
Фрагменты ДНК разделяли электрофорезом в 1 %-ных агарозных гелях (0,3 х 7 х 8 см) в буфере ТАЕ [1]. Перенос ДНК на мембрану Hybond N («Amersham») осуществляли элек-трофоретически с использованием аппарата «Blotter» для полусухого переноса в 0,025 М tris-HCl буфере, pH 8,0 при силе тока 0,8 мА в течение 2 ч. ДНК фиксировали на мембране облучением УФ-светом на трансиллюминаторе «Флускоп 2» при длине волны 310 нм в течение 2-3 мин, затем мембраны выдерживали при 90 °C в течение 1 ч.
Плазмидные ДНК выделяли из клеток бактерий методом щелочного лизиса и очищали равновесным центрифугированием в градиенте плотности CsCl [1]. Обработку рестриктазами осуществляли в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Фрагменты генов, используемые для гибридизации, получали после препаративного электрофореза смеси рестриктов в 6 %-ном ПААГ.
Для введения в ДНК флуоресцентной метки и детекции меченой ДНК в гибридах использовали два модуля набора ECL — Random prime labelling module (RPN 3540) и Star detection module (RPN 3510) («Amersham»). Условия блот-гибридизации ДНК, фиксированной на Hybond N-мембранах, с фрагментами генов to и tat и условия выявления гибридов соответствовали рекомендациям фирмы «Amersham». Для визуализации флуоресцентной метки использовали высокочувствительную рентгеновскую пленку (Hyperfilm ECL, «Amersham»). Время экспозиции варьировали от 1 до 16 ч.
Результаты исследования. Фрагменты генов to и tat в суммарной ДНК нуклеазных гидролизатов выявляли с помощью блот-гибридизации. В качестве зондов использовали сегменты их кодирующих областей — зонд ТАТ1 с координатами (+800 / +3700 п. н.) и ТО 1 (+5000 /+8300 п. н.).
Для выявления всех потенциально доступных для нуклеазной фрагментации сайтов ДНК в хроматине при кратковременном действии фермента требуется сверхвысокая его концентрация. Мы установили, что лимит в переваривании общей ДНК в составе ядер достигался при 120-150 А260 ед./1мг ДНК МНазы (А260 ед.), 160 и 1200 Kunits/Ыг ДНК (KU) ДНКазы I и ДНКазы II соответственно. Дальнейшее увеличение концентрации ферментов не приводило к заметным изменениям в спектре продуцируемых фрагментов общей ДНК. Количество образующихся кислоторастворимых продуктов при достижении этого лимита оказалось крайне низким (от 1 до 3 %) для всех трех нуклеаз.
Рис. 1 иллюстрирует различия в характере фрагментации репрессированного (общего) (рис. 1, А) и активного (гена tat) хроматина (рис. 1, Б, В) при интенсивном МНазном переваривании ядер клеток печени (в интервале концентраций фермента от 120 до 360 А260 ед.). При 120 ед. МНазы общая ДНК оказывается представленной в гидролизатах короткими фрагментами моно- и динуклеосомной длины (200-400 п. н., см. рис. 1, А, дор. 1), тогда как ДНК tat гена выявляется в пике высокополимерных фрагментов (от 1500 до 10 000 п. н. или выше (рис. 1, Б, В, дор. 1), представляющем минорную фракцию в тотальной ДНК гидролизатов (см. рис. 1, А, дор. 1, верх). При сверхвысоких концентрациях МНазы (240-360 А260 ед.) в гидролизатах сохраняются моно- и динуклеосомные фрагменты ДНК общего хроматина (см. рис. 1, А, дор. 2, 3), тогда как ДНК кодирующей области tat практически
А Б В А
М 1 2 3 4 М 1 2 3 4 М 1 2 3 4 М
Рис. 1. Сравнение характера фрагментации ДНК общего хроматина и хроматина кодирующей области гена tat в ядрах печени крыс при концентрацииях МНазы, обеспечивающих лимит в переваривании
ДНК в составе ядер
А — электрофореграмма фрагментов ДНК в 1 %-ном агарозном геле, окраска бромистым этидием; Б, В — автографы с электрофореграммы после гибридизации с зондом ТАТ1, 1 ч. (Б) и 4 ч. (В) экспозиции рентгеновской пленки. 1-3 — ДНК из ядер, инкубированных с МНазой при 120, 240 и 360 А260ед./1мг ДНК соответственно; 4 — из ядер, инкубированных без МНазы. М — маркер: ДНК фага X, рестрицированная Hind III, цифры справа — длина фрагментов рестрикции (в п. н.).
полностью переходит в кислоторастворимую (или негибридизующуюся) форму (см. рис. 1, Б, В, дор. 2, 3). Важно отметить, что на промежуточных стадиях этого перехода сохраняются наиболее крупные фрагменты tat и не наблюдается накопления продуктов в виде мономеров или олигомеров нуклеосомного повтора (см. рис. 1, Б, В, дор. 2). Максимальная длина МНазорезистентных областей в дерепрессированном гене tat, по приблизительной оценке, коррелирует с размерами его единиц транскрипции (11 000 п. н. [53]). В ядрах печени, инкубированных без МНазы, вся tat-ДНК представлена фрагментами такой длины (см. рис. 1, Б, В, дор. 4). Это показывает, что разрывы по границам единиц транскрипции tat происходят без участия этого фермента, тогда как их субфрагменты образуются в результате МНазного действия.
Различие двух форм хроматина обнаруживается и при исчерпывающем переваривании ядер печени ДНКазами I и II (рис. 2, А и Б). Как видно из рис. 2, А, уже при 160 KU
М 1 2 3 4 5 6 7 М 1 2 3 4 5 6 7
Рис. 2. Сравнение характера фрагментации ДНК общего хроматина и хроматина кодирующей области гена tat в ядрах печени крыс ДНКазой I и ДНКазой II при концентрациях, обеспечивающих лимит
в переваривании ДНК в составе ядер А — электрофореграмма фрагментов ДНК в 1 %-ном агарозном геле, окраска бромистым этидием; Б — автограф с электрофореграммы после гибридизации с зондом ТАТ1. 1-3 — ДНК из ядер печени, инкубированных с ДНКазой I при концентрации 160, 320 и 480 Кип^/1мг ДНК (KU) соответственно; 4-6 — из ядер печени, инкубированных с ДНКазой II при концентрациях фермента 1200, 2400 и 3600 KU соответственно; 7 — из ядер печени, инкубированных без ДНКазы. M — маркер:1 kb Ladder ("Fermentas").
ДНКазы I расщепление ДНК происходит практически в каждом межнуклеосомном линкере репрессированного хроматина (см. рис. 2, А, дор. 1), фрагменты мононуклеосомной длины сохраняются при увеличении концентрации ДНКазы I до 480 KU (см. рис. 2, А, дор. 2, 3). При этом кодирующая область tat гена в том же диапазоне концентраций ДНКазы I переваривается до кислоторастворимого материала (см. рис. 2, Б, дор. 1-3).
Доступность линкерной ДНК в хроматине печени к ДНКазе I выше, чем к ДНКазе II. Длина мононуклеосомной ДНК в гидролизатах ДНКазы II составляет около 210 н. п., согласно анализу по программе (Total lab), а ДНКазы I — около 150 п. н. (рис. 2, А). Кроме того, продуктами конечной стадии переваривания хроматина ДНКазой II является серия олигону-клеосомных фрагментов ДНК (см. рис. 2, А, дор. 4-6). Против ожидания, по характеру фрагментации кодирующей области дерепрессированного в печени tat-гена ДНКаза II оказалась сходной с МНазой (см. рис. 2, Б, дор. 4-6): в обоих гидролизатах ДНК его кодирующей области была представлена протяженными фрагментами—от 1000 до около 10 000 п. н. (см. рис. 1, Б и рис. 2, Б, дор. 4-6). Последние близки к длине единицы транскрипции tat (11000 п. н.).
Отличный от общей ДНК и сходный с ДНК гена tat характер фрагментации МНазой и ДНКазами I и II в составе ядер печени обнаружил и другой ген, дерепрессированный в клетках печени — ген to (длина единицы транскрипции 19000 п. н. [50]) (рис. 3, 4 и 6). При действии МНазы в насыщающей концентрации (120 А260 ед.) и распаде общего хроматина на моно- и динуклеосомы (рис. 3, А, дор. 3 и 4) в гидролизатах сохраняются высокополимерные фрагменты to (рис. 3, Б, дор. 3), часть из которых сопоставима с величиной его единицы транскрипции (около 20 000 п. н.). В ядрах мозга (в репрессированном состоянии) (см. рис. 3, Б, дор. 4) тот же ген расщепляется на моно- и динуклеосомные фрагменты, как и общий хроматин (см. рис. 3, Б, В, дор. 3 и 4).
1 2 3 4 M
1 2 3 4 M
1 2 3 4 M
Рис. 3. Сравнение характера фрагментации ДНК общего хроматина и хроматина кодирующей области гена to в ядрах печени и мозга крыс при концентрации МНазы 120A260 ед./1мг ДНК, обеспечивающей
достижение лимита в переваривании ДНК в составе ядер А — электрофореграмма фрагментов ДНК в 1 %-ном агарозном геле, окраска бромистым этидием. Б — автограф с электрофореграммы после гибридизации с зондом ТО1. В — гибридизация с флуоресцентно-меченой суммарной ДНК из печени крыс. 1 и 2 — ДНК из ядер печени и мозга крыс соответственно, инкубированных в отсутствие МНазы; 3 и 4 — из тех же ядер, инкубированных с МНазой при 120 A260 ед./1мг ДНК. М — ДНК фага X, рестрицированная Hind III. К пробе М в качестве положительного контроля гибридизации добавлено около 1 пкг
немеченой ТО1-ДНК.
А Б А В
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 М 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Рис. 4. Фрагменты генов to и tat в ядрах печени крыс, продуцируемые ДНКазой I в диапазоне концентраций фермента от 5 до 320 KU
А — электрофореграмма фрагментов ДНК в 1 %-ном агарозном геле, окраска бромистым этидием. Б, В — автографы с электрофореграммы после гибридизации с зондом ТО1 и ТАТ1 соответственно. 1 — ДНК исходных ядер; 2 — ДНК из ядер печени, инкубированых без ДНКазы; 3-9 — из ядер печени, инкубированных с ДНКазой I при концентрации 5,10, 20, 40, 80, 160, 320 KU соответственно. М — ДНК фага X, рестрицированная Hind III. Стрелки обозначают позиции в геле фрагментов to-ДНК (Б) и tat-ДНК (В) на дорожке 7.
Динамику переваривания ДНК общего хроматина и кодирующей области to и tat генов в ядрах клеток печени и мозга крыс при возрастании концентрации ДНКазы I от 5 до 320 KU иллюстрируют данные, представленные на рис. 4 и рис. 5. Фракция фрагментов, образующих нуклеосомный ладер, представлена в этих гидролизатах в минорном количестве (см. рис. 4, А и рис. 5, А). Это показывает, что в интервале концентрации ДНКазы I от 5 до 160 KU совпадение однонитевых разрывов (ников) на комлементарных цепях ДНК (расщепление двойной спирали) является редким событием. Длина ДНК общего хроматина снижается монотонно, возможно, за счет последовательной реализации разрывов в иерархии сайтов гиперчувствительных к ДНКазе I (ГЧ-сайтах). При 80 KU ДНКазы I преимущественно образуются фрагменты ДНК с длиной от 3000 до 10 000 п. н. (см. рис. 4, А, дор. 7). Концентрация 160 KU оказывается критической. Общий хроматин переваривается до мононуклеосом (см. рис. 4, А, дор. 8), что свидетельствует о появлении двунитевых разрывов ДНК практически во всех межнуклеосомных линкерах.
Фрагментация ДНК кодирующих областей дерепрессированных to и tat генов в ядрах печени при возрастании концентрации ДНКазы I сходна по своей динамике с распадом общей ДНК. Однако фрагменты каждой стадии их переваривания концентрируются в узких зонах геля (рис. 4, Б, В). При 80 KU ДНКазы I длина фрагментов to и tat генов снижается до величины их единиц транскрипции (около 20 000 и 10 000 п. н. соответственно (см. рис. 4, Б, В, дор. 7, стрелки). При дальнейшем увеличении концентрации фермента ДНК как to, так и tat генов переваривается до коротких кислоторастворимых или негибридизующихся фрагментов (см. рис. 4, Б, В, дор. 8, 9). Это показывает, что в их кодирующих областях отсутствуют компактные нуклеазорезистентные частицы, соответствующие нуклеосо-мам. В ядрах мозга (в репрессированном состоянии) конечным продуктом переваривания ДНКазой I гена to является мононуклеосомная ДНК, не отличающаяся по размерам от ДНК нуклеосом, образующихся из общего хроматина (рис. 5, А, Б, дор. 7).
Рис. 5. Фрагменты гена to, продуцируемые в ядрах клеток мозга крыс ДНКазой I в диапазоне концентрации от 5 до 160 KU
А — электрофореграмма фрагментов ДНК в 1 %-ном агарозном геле, окраска бромистым этидием; Б — автограф с электрофореграммы после гибридизации с зондом ТО1. 1 — ДНК из ядер мозга, инкубированных без ДНКазы; 2-7 — из ядер мозга, инкубированных с ДНКазой I при концентрации 5, 10, 20, 40, 80, 160 KU соответственно. M — 1 kb Ladder, в качестве положительного контроля гибридизации добавлено около 1 пкг немеченой ТО1-ДНК.
Таким образом, протяженные участки кодирующих областей to и tat генов в дере-прессированном состоянии резистентны к действию МНазы и ДНКазы II и в то же время доступны для переваривания ДНКазой I. Сохранение в гидролизатах после интенсивного переваривания ядер МНазой и ДНКазой II фрагментов активных генов длиной около 10 000 и 20 000 п. н., 50 и 100 единиц в нуклеосомном эквиваленте (для tat и ^ соответственно), указывает на то, что, по-видимому, нам удалось свести к минимуму влияние эндогенных ядерных ферментов и наблюдаемые картины фрагментации адекватно отражают распределение в хроматине доступных для нуклеаз участков.
ДНКазы I и II обладают сходным характером нуклеолитического действия: в отличие от МНазы, могут продуцировать однонитевые разрывы внутринуклеосомной ДНК, однако различаются по зависимости активности от дивалентных катионов [17, 30, 40]. Концентрация ионов М§2+, требующаяся для максимальной активности ДНКазы I, ингибирует действие ДНКазы II. С другой стороны, дивалентные катионы влияют на компактность нуклеогистоновых фибрилл и, возможно, на доступность ДНК для нуклеазной фрагментации.
Был проведен анализ длины фрагментов ДНК, образующихся в ядрах печени при инкубации с ДНКазой I в буфере для ДНКазы II (БД II, 0,8 мМ М§2+) и с ДНКазой II в буфере БД I (2,5 мМ М§2+) (рис. 6, А, Б). Сравнение данных, представленных на рис. 2, Б и рис. 6, Б, показывает, что характер фрагментации ДНК кодирующей области ^ и tat генов не зависит от состава среды инкубации. В обоих буферных растворах при действии ДНКазы I в насыщающей концентрации их ДНК переваривается до кислоторастворимых продуктов (см. рис. 2, Б, дор. 1-3 и рис. 6, Б, дор. 3); при действии ДНКазы II сохраняется
А
Б
10000 'ша:|000
4000 3500
1 2 3 4 5
М1 1 2 3 4 5 М2
Рис. 6. Фрагментация кодирующей области гена to в ядрах печени крыс под действием ДНКазы I в буфере для ДНКазы II (БД II) и ДНКазы II в буфере для ДНКазы I (БД I)
А — электрофореграмма фрагментов ДНК в 1 %-ном агарозном геле, окраска бромистым этидием; Б — автограф с электрофореграммы после гибридизации с зондом ТО1. 1 — ДНК из ядер печени, инкубированных без ДНКазы; 2, 3 — из ядер печени, инкубированных в буфере БД II с ДНКазой I при концентрации 40 и 160 KU соответственно; 4, 5 — из ядер печени, инкубированных в буфере БД I с ДНКазой II при концентрации 400 и 1600 KU соответственно. M1 — ДНК фага X, рестрицированная Hind III, в качестве положительного контроля гибридизации добавлено около
1 пкг немеченой ТО1-ДНК; M2 — 1 kb Ladder.
в виде высокополимерных фрагментов (см. рис. 2, Б, дор. 4-6 и рис. 6, Б, дор. 5). Не наблюдалось также различий в частоте однонитевых разрывов мононуклеосомной ДНК, продуцируемых ДНКазой I в ядрах печени при инкубации в растворах БД I и БД II (данные не представлены).
Обсуждение результатов исследования. Согласно наиболее популярной модели транскрипции процесс элонгации идет на нуклеосомной матрице при разворачивании ну-клеосом во фронте движения полимеразы и ресборке позади нее [5, 11, 25, 56]. Полученные авторами данные не подтверждают эту точку зрения. На всем протяжении кодирующих областей ^ и tat генов, активных и активированных (компетентных к транскрипции), не обнаруживается нуклеосомных устройств — цепей нуклеазорезистентных компактных частиц, разделенных сегментами свободной ДНК — межнуклеосомными линкерами.
Так, О и tat-ДНК не представлены во фракции мононуклеосом или коротких олигону-клеосом, образующихся на конечных стадиях переваривания хроматина печени МНазой (см. рис. 1 и рис. 3, Б, дор. 3), ДНКазой I (см. рис. 2, дор. 1-3) и ДНКазой II (см. рис. 2, дор. 4-6, рис. 6, дор. 5). При достижении лимита в переваривании хроматина ДНКазой I вся tat-и ОДНК переходит в кислоторастворимую форму (см. рис. 2, А, Б, дор. 1 и рис. 6, Б. дор. 3), в случае МНазы и ДНКазы II — сохраняется в виде высокополимерных фрагментов. При сверхвысоких концентрациях ДНКазы I (см. рис. 2 и 4) или МНазы (рис. 1) в гидролизатах печени сохраняются фрагменты общего хроматина моно- или динуклеосомной длины, а ДНК ^ и tat генов полностью переходит в кислоторастворимую форму, не давая, таким образом, конечного продукта нуклеазного распада нуклеосомных цепей — хроматосом или коровых частиц. Действие ДНКазы II отличается от МНазного действия в том отношении, что спектр продуцируемых ею фрагментов общего хроматина (см. рис. 2, А, дор. 4-6) и хроматина кодирующей области гена tat в ядрах печени (см. рис. 2, Б. дор. 4-6) остается неизменным при возрастании концентрации фермента от 1200 до 3600 КИ.
Важно отметить, что как полноразмерные to и tat единицы транскрипции, так и их субфрагменты обнаруживаются в гидролизатах МНазы и ДНКазы II в условиях лимита нуклеазного переваривания ДНК в составе ядер (ее расщепление практически во всех потенциально доступных сайтах хроматина). Если в таких гидролизатах сохраняются полноразмерные единицы транскрипции, то их сегменты гетерогенной величины происходят из другой разновидности генных копий, содержащих в кодирующих областях нерегулярные чувствительные к МНазе и ДНКазе II зоны. Логично предположить, что две формы, различающиеся по характеру нуклеазной протекции, отражают два функциональных состояния, в которых могут быть представлены гены to и tat в этой ткани.
Предполагаем, что устойчивость ДНК к МНазе и ДНКазе II на всем протяжении кодирующих областей присуща генным копиям, сохраняющим в дифференцированных клетках компетентное состояние. При транскрипции возникают нуклеазочувствительные зоны, которые, возможно, фланкируют элонгирующие РНК-полимеразы. После их расщепления остаются устойчивые к перевариванию фрагменты различной протяженности, которые (по этой модели) представляют собой сегменты кодирующих последовательностей, лежащие между очагами транскрипции.
МНаза является единственной из трех исследуемых нуклеаз, субстратом которой, помимо двуцепочечных ДНК, могут быть однонитевые ДНК и РНК. Можно предположить, что действие МНазы в сверхвысокой концентрации (см. рис. 1, Б, В) приводит к потере насцентной РНК, за которой следует диссоциация полимеразы и дезинграция транскрибируемых и прилегающих участков хроматина.
Имеющиеся данные во многом согласуются с предполагаемой нами организацией единиц транскрипции в активном и компетентном к транскрипции состояниях. Впервые A. Levy и M. Noll [32] показали, что при МНазном распаде общего хроматина в ядрах клеток дрозофилы на мультиплеты нуклеосомного повтора вся кодирующая область hsp70 в отсутствие индукции (в компетентном к транскрипции состоянии) выявляется в гидролизатах как целостный фрагмент длиной около 2000 п. н., с границами, примыкающими к 5'- и 3'-концам единицы транскрипции. При тепловом шоке она переваривается до кислоторастворимых продуктов.
Далее, S. C. R. Elgin и соавторы [18] при картировании позиций нуклеосом в области 67B1 генома дрозофилы, включающей три гена hsp, обнаружили, что при определенных условиях действия МНазы единицы транскрипции всех трех генов выявляются как резистентные зоны (футпринты в спектре фрагментов), не содержащие, в отличие от спейсерного хроматина, доступных для МНазы участков, соответствующих межну-клеосомным линкерам.
J. A. Ridsdale и J. R. Davie [47] обрабатывали ядра эритроцитов птиц МНазой и образующиеся фрагменты хроматина разделяли гельфильтрацией. Оказалось, что в гидролизатах, где превалировали моно- и короткие олигонуклеосомы, практически вся ß-глобиновая ДНК была сосредоточена во фракции фрагментов длиной более 2000 п. н., степень обо-гащенности которой глобиновыми нуклеотидными последовательностями превышала 50-кратную. При созревании эритроцитов прекращается транскрипция генов ß-глобина, но хроматин в этом локусе не переходит в компактную форму. По существующим критериям [24] в структурном отношении он сохраняет компетентное к транскрипции состояние [12, 27, 47]. В условиях транскрипции ß-глобина в культуре фибробластов наблюдается другой характер его фрагментации — продукция МНазоустойчивых фрагментов с монотонным распределением по длине [12]. Этот «ненуклеосомный» (по характеру МНазной фрагментации) хроматин [12] находился в пределах кодирующей области ß-глобина, его
S'-граница совпадала с ближайшим к старту сайтом нуклеазной гиперчувствительности. «Ненуклеосомный» характер [12] MHазной фрагментации хроматина в пределах единиц транскрипции (продукция монотонно убывающих по длине фрагментов) наблюдали для многих генов, программированных на экспрессию в эмбриогенезе и экспрессируемых в специализированных клетках под действием специфических индуцирующих воздействий [12, 29, 48, SS, S8], а также для дрожжевых индуцибельных генов [6, ЗЗ, 42].
Полученные нами для генов to и tat и ряд других данных [12, 2Q, 29, S1, 62] указывают на то, что преобразование (ремоделирование) нуклеосомной структуры на всем протяжении кодирующих областей при активации генов может предшествовать инициации транскрипции. В in vivo ремоделированной форме повторяющиеся структурные единицы хроматина не подразделяются на «коровую» и линкерную области, различающиеся по доступности ДНК к нуклеазам: вся внутринуклеосомная ДНК доступна для расщепления ДНКазой I, но не содержит регулярных сайтов нуклеазной доступности, соответствующих межнуклеосомным линкерам. Это свидетельствует об изменении как ДНК-гистоновых, так и гистон-гистоновых взаимодействий.
Согласно данным биохимического анализа (химическая пришивка гистонов к ДНК с разрывом полинуклеотидной цепи в сайте ковлентного связывания [З8]), дающего прямую и наиболее адекватную информацию о ДНК-гистоновых взаимодействиях, половина двойной спирали ДНК (4-S фосфодиэфирных связей на виток) экранирована гистонами в компактных нуклеосомных частицах [З8]. Такая организация определяет устойчивость внутрикоровой ДНК к расщеплению (двунитевому разрыву) ДНКазой I.
Высокая вероятность двунитевых разрывов ДНК в хроматине дерепрессированных генов (распада до кислоторастворимых продуктов) при действии ДНКазы I [8, 21, S7] свидетельствует о полном или частичном освобождении фосфодиэфирных связей, блокированных гистонами в компактных частицах. Однако при этом освобождении на всем протяжении структурных единиц хроматина возникают стерические препятствия для действия MHазы — одновременного разрыва двух фосфодиэфирных связей, противолежащих на двойной спирали.
Возможно, что при переходе хроматина в активную конформацию линеаризация ДНК структурных единиц хроматина [19, 2Q, 26, S2, S4] сопряжена с декомпактизацией (расхождением гистоновых складок) октамера, его преобразованием в линейную двуце-почечную структуру, перекрывающую всю нуклеосомную ДНК и сохраняющую с ней ограниченный контакт, который может прерываться в центрах транскрипции. Однако это предположение требует экспериментального подтверждения.
Литература
1. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Ыетод^1 генной инженерии. Ыолекулярное клонирование. M., 1984.
2. Чихиржина Г. И., Федорова С. А., Чесноков И. Н., Романовская Е. В. Ядерные белки, специфически связывающиеся с регуляторной областью гена ТО // Биохимия. 199З. Т. S8. C. З92-З98.
3. Baer B. W., Rhodes D. Eukaryotic RNA polymerase II binds to nucleosome cores from transcribed genes // Nature. 198З. Vol. 301. P. 482-488.
4. Becker P., Renkawitz R., Schütz G. Tissue-specific DNaseI hypersensitive sites in the S'-flanking sequences of the tryptophan oxygenase and the tyrosine aminotransferase genes // EMBO J. 1984. Vol. З. P. 2Q1S-2Q2Q.
5. Belotserkovskaya R., Saunders A., Lis J. T., Reinberg D. Transcription through chromatin: understanding a complex FACT // Biochim. Biophys. Acta, 2QQ4. Vol. 1677. P. 87-99.
6. Bergman L. W., Kramer R. A. Modulation of chromatin structure associated with derepression of the acid phosphatase gene of Saccaromyces cerevisiae // J. Biol. Chem. 198З. Vol. 2S8. P. 722З-7227.
7. Bernardi G. 11 Spleen Acid Deoxyribonuclease // The Enzymes. 1971. Vol. 4. P. 271-287.
8. Bloom K. S., Anderson J. N. Conformations of ovalbumin and globin genes in chromatin during differential gene expression // J. Biol. Chem. 1978. Vol. 254. P. 10532-10539.
9. Boeger H., Griesenbeck J., Strattan J. S., KornbergR. D. Nucleosomes unfold completely at a transcriptionally active promoter // Mol. Cell. 2003. Vol. 11. P. 1587-1598.
10. Caplan A., Kimura T., Gould H., Allan J. Perturbation of chromatin structure in the region of the adult beta-globin gene in chicken erythrocyte chromatin // J. Mol. Biol. 1987. Vol. 193. P. 57-70.
11. ClarkD. J. Transcription through the nucleosome // The Nucleus. 1995. Vol. 1. Greenwich. P. 207-239.
12. Cohen R. B., Sfefffery M. Nucleosome disruption precedes transcription and is largely limited to the transcribed domain of globin genes in murine erythroleukemia cells // J. Mol. Biol. 1985. Vol. 182. P. 109-129.
13. Conconi A., Widmer R. M., Koller T. Sogo J. M. Two different chromatin structures coexist in ribo-somal RNA genes throughout the cell cycle // Cell. 1989. Vol. 57. P. 753-761.
14. Cote J., Quinn J., Workman J. L., Peterson C. L. The yeast SWI/SNF complex facilitates the binding of GAL4 derivatives to nucleosomal DNA// Science. 1994. Vol. 2. 65. P. 53-60.
15. Cousins D. J., Islam S. A., Sanderson M. R., Proykova Y. G., Crane-Robinson C., Staynov D. Z. Redefinition of the cleavage sites of Dnase I on the nucleosome core particle // J. Mol. Biol. 2004. Vol. 335. P. 1199-1211.
16. Dammann R., Lucchini R., Koller T., Sogo J. M. Transcription in the yeast rRNA locus: distribution of the active gene copies and chromatin structure of their flanking regulatory sequences // Mol. Cell. Biol. 1995. Vol. 15. P. 5294-5303.
17. Drew H. R. Structural specificities of five commonly used DNA nucleases // J. Mol. Biol. 1984. Vol. 176. P. 535-557.
18. Elgin S. C. R., Cartwright I. L., Fleischmann G., Lowenhaupt K., Keene M. A. Cleavage reagents as probes of DNA sequence organization and chromatin structure: Drosophila melanogaster locus 67B1 // Cold Spr. Harbor. Symp. Quant. Biol. 1983. Vol. 47. P. 529-538.
19. Fahy D., Conconi A., Smerdon M. J. Rapid changes in transcription and chromatin structure of ribo-somal genes in yeast during growth phase transitions // Exp. Cell Res. 2005. Vol. 305. P. 365-373.
20. Foe V. E. Modulation of ribosomal RNA synthesis in Oncopeltus fasciatus: an electron microscopic study of the relationship between changes in chromatin structure and transcriptional activity // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1978. Vol. 42. P. 723-740.
21. Garel A., Axel R. The structure of the transcriptionally active ovalbumin genes in chromatin // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1978. Vol. 42. P. 701-708.
22. Gottesfeld J. M., Melton D. A. The length of nucleosome-associated DNA is the same in both transcribed and nontranscribed regions of chromatin // Nature. 1978. Vol. 273. P. 317-319.
23. Grange Th., Roux J., PictetR. Two remote glucocorticoid responsive units interact cooperatively to promote glucocorticoid induction of rat tyrosine aminotransferase gene expression // Nucleic Acids Res. 1989. Vol. 17. P. 8695-8709.
24. Gross D. S., Garrard W. T. Nuclease hypersensitive sites in chromatin // Ann. Rev. Biochem. 1988. Vol. 57. P. 159-197.
25. Hahn S. Structure and mechanism of the RNA polymerase II transcription machinery // Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. Vol. 11. P. 394-403.
26. Hamkalo B. A., Miller O. L., Bakken A. H. Ultrastructure of active eucariotic genomes // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1974. Vol. 38. P. 915-919.
27. Hebbes T. R., Thorne A. W., Crane-Robinson C. A. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin // EMBO J. 1988. Vol. 7. P. 1395-1403.
28. Hewish D. R., Burgoyhe L. A. Chromatin substructure. The digestion of chromatin DNA at regularly spaced sites by a nuclear deoxyribonuclease // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973. Vol. 52. P. 504-510.
29. Huang S. Y., Barnard M. B., XuM., Matsui S. I., Rose S. M., Garrard W. T. The active immunoglobulin kappa chain gene is packaged by non-ubiquitin-conjugated nucleosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. Vol. 83. P. 3738-3742.
30. Kornberg R. D., Lorch Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome // Cell. 1999. Vol. 98. P. 285-294.
31. Lee C. K., Shibata Y., Rao B., Strahl B. D., Lieb J. D. Evidence for nucleosome depletion at active regulatory regulation genome wide // Nat. Genet. 2004. Vol. 36. P. 900-905.
32. Levy A., Noll M. Chromatin fine structure of active and repressed genes // Nature. 1981. Vol. 289. P. 198-203.
33. LohrD. Chromatin fine structure of actively expressed, single copy yeast gene // Nucleic. Acid Res. 1983. Vol. 11. P. 6755-6773.
34. Maggio R., Siekevitz Ph., Palade G. E. Studies on isolated nuclei // J. Cell Biol. 1963. Vol. 18. P. 293-312.
35. Mathis D. J., Gorovsky M. A. Subunit structure of rDNA-containing chromatin // Biochemistry. 1976. Vol. 15. P. 750-755.
36. Matsui S., Busch H. Isolation and characterization of rDNA-containing chromatin from nucleoli // Exp. Cell Res. 1977. Vol. 109. P. 151-161.
37. McKnight S. L., Bustin M., Miller O. L. Electron microscopic analysis of chromosome metabolism in the Drosophila melanogaster embryo // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1978. Vol. 42. P. 741-754.
38. MirzabekovA. D., Bavykin S. G., Kapov V. L., Preobrazhenskaya O..V., Ebralidze K. K., Tuneev V. M., MelnikovaA. F., Goguadze E. G., Chenchick A. A., Beabealashvili R. S. Structure of nucleosomes, Cromatin, and RNA-Polymerase-Promotor Complex as revealed by DNA-Protein cross-linking // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1983. Vol. 47. P. 503-510.
39. Ness P. J., Labhart P., Banz E., Koller T., Parish R. W. Chromatin structure along the ribosomal DNA of Dictyostelium. Regional differences and changes accompanying cell differentiation // J. Mol. Biol. 1983. Vol. 166. P. 361-381.
40. Noll M., Kornberg R. D. Action of micrococcal nuclease on chromatin and the location of histone H1 // J. Mol. Biol. 1977. Vol. 109. P. 393-404.
41. Ong M. S., Richmond T. J., Davey C. A. DNA stretching and extreme kinking in the nucleosome core // J. Mol. Biol. 2007. Vol. 368. P. 1067-1074.
42. Perez-Ortin J. E., Estruch F., Matallana E., Franco L. Fine analysis of the chromatin structure of the yeast SUC2 gene and of its changes upon derepression. Comparison between the chromosomal and plasmid-inserted genes // Nucleic Acids Res. 1987. Vol. 15. P. 6937-6956.
43. Pfeiffer W., Zachau H. G. Accessibility of expressed and non-expressed genes to a restriction nuclease // Nucleic Acids Res. 1980. Vol. 8. P. 4621-4638.
44. Piper P. W., Celis J., Kaltoft K., Leer J. C., Nielsen O. F., Westergaard O. Tetrahymena ribosomal RNA gene chromatin is digested by micrococcal nuclease at sites which have the same regular spacing on the DNA as corresponding sites in the bulk nuclear chromatin // Nucleic Acids Res. 1976. Vol. 3. P. 493-505.
45. Reeves R. Ribosomal genes ofXenopus laevis: evidence of nucleosomes in transcriptionally active chromatin // Science. 1976. Vol. 194. P. 529-532.
46. Reik A., Schütz G., Stewart A. F. Glucocorticoids are required for establishment and maintenance of an alteration in chromatin structure: induction leads to a reversible disruption of nucleosomes over an enhancer // EMBO J. 1991. Vol. 10. P. 2569-2576.
47. Ridsdale J. A., Davie J. R. Chicken erytrocyte polynucleosomes which are soluble at physiological ionic strength and contain linker histones are highly enriched in ß-globin sequences // Nucleic Acids Res. 1987. Vol. 15. P. 1081-1096.
48. Rosha E., Davie J. R., Van Hold K. E., Weintraub H. Differential salt fractionation of active and inactive genomic domains in chicken erythrocyte // J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259. P. 8558-8563.
49. Samal B., Worcel A., Louis C., Schedl P. Chromatin structure of the histone genes of D. Melanogaster // Cell. 1981. Vol. 23. P. 401-409.
50. Schmid W., Sherer G., Danesch U., Zentgraf H., Matthias P., Strange C. M., Röwekamp W., Schütz G. Isolation and characterization of the rat tryptophan oxygenase gene // EMBO J. 1982. Vol. 1. P. 1287-1293.
51. SchwabishM. A., StruhlK. Evidence for eviction and rapid deposition ofhistones upon transcriptional elongation by RNA polymerase II // Mol. Cell Biol. 2004. Vol. 24. P. 10111-10117.
52. Sheer U. Structure of lampbrush chromosome loops during different states of transcriptional activity as visualized in the presence of physiological salt concentrations // Biol. Cell. 1987. Vol. 59. P. 33-42
53. Shinomiya T., Sherer G., Schmid W., Zentgraf H., Schütz G. Isolation and characterization of the rat tyrosine aminotransferase gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81. P. 1346-1350.
54. Spring H., Franke W. W. Transcriptionally active chromatin in loops of lampbbrush cchromosomes at physiological salt concentrations as revealed by electron microscopy of sections // Eur. J. Cell Biol. 1981. Vol. 24. P. 298-308.
55. Strätling W. H., Dölle A., Sippel A. E. Chromatin structure of the chicken lysozyme gene domain as determined by chromatin fractionation and micrococcal nuclease digestion // Biochemistry. 1986. Vol. 25. P. 495-502.
56. Walter W., Studitsky V. M. Construction, analysis, and transcription of model nucleosomal templates // Methods. 2004. Vol. 33. P. 18-24.
57. Weintraub H., Groudine M. Chromosomal subunits in active genes have an altered conformation // Science. 1976. Vol. 193. P. 846-856.
58. Widmer R. M., Lucchini R., Lezzi M., Meyer B., Sogo J. M., Edstrom J. E., Koller T. Chromatin structure of a hyperactive secretory protein gene (in Balbiany ring 2) of Chironomus // EMBO J. 1984. Vol. 3. P. 1635-1641.
59. Williams S. K., Tyler J. K. Transcriptional regulation by chromatin disassembly and reassembly // Current Opinion in Genetics and Development. 2007. Vol. 17. P. 88-93.
60. Wolffe A. Chromatin: structure and function. Vol. 1. New York, 1998. P. 8-10.
61. Wu C. The 5' ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNAseI // Nature. 1980 Vol. 286. P. 854-860.
62. Zhao J., Herrera-Diaz J., Gross D. S. Domain-wide displacement of histones by activated heat shock factor occurs independently of Swi/Snf and is not correlated with RNA polymerase II density // Mol. Cell. Biol. 2005.Vol. 25. P. 8985-8999.
