CC BY
19
УДК 630*181.324
ОСОБЕННОСТИ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ АДАПТАЦИИ ХВОЙНЫХ СИБИРИ: ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ И НЕРАСТВОРИМЫХ КОМПОНЕНТОВ КЛЕТОК
Е.В. Алаудинова, П.В. Миронов
ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет» 660049 Красноярск, пр. Мира, 82; e-mail: alaudinovaev@yandex.ru
Приведена динамика водорастворимых веществ цитоплазмы и нерастворимых компонентов в мери-стематических клетках почек Larix sibirica L., Picea obovata L., Abies sibirica L., Pinus sylvestris L. и Pinus sibirica Rupr Mayr) в различные периоды годового цикла. Отмечается, что у исследованных видов осенью на фоне общего снижения активности метаболических процессов в меристематических клетках наблюдалась инициация целого ряда адаптивных механизмов, включающих изменение физико-химических свойств цито-золя посредством синтеза водорастворимых соединений и увеличение компартментации цитоплазмы за счет повышения количества мембранных структур.
Ключевые слова: Larix sibirica L., Picea obovata L., Abies sibirica L., Pinus sylvestris L., Pinus sibirica Rupr Mayr., почка, меристематические клетки, водорастворимые вещества цитоплазмы, нерастворимые компоненты.
Dynamics of water-soluble substances of cytoplasm and insoluble components in meristematic cells of buds of Larix sibirica L., Picea obovata L., Abies sibirica L., Pinus sylvestris L. and Pinus sibirica Rupr Mayr. during the various periods of an annual cycle are resulted. It is noticed, that at the investigated species in the autumn against the general decrease in activity of metabolic processes in meristematic cells it was observed initiation variety of the adaptive mechanisms including change of physical and chemical properties cytosol by means of synthesis of water-soluble compounds and increase of compartmentation of cytoplasm at the expense of quantity increase of membraneous structures.
Keywords: Larix sibirica L., Picea obovata L., Abies sibirica L., Pinus sylvestris L., Pinus sibirica Rupr Mayr, bud, meristematic cells, water-soluble substances of cytoplasm, insoluble components.
ВЕДЕНИЕ
Клетка - это первый уровень организации живого, который способен воспринимать сигналы из окружающей среды и формировать в ответ комплекс собственных неспецифических морфологических и функциональных изменений для защиты от различного рода внешних стрессовых воздействий. В условиях Сибири главным абиотическим стрессором, отрицательно влияющим на метаболизм многолетних растения, являются низкие зимние температуры. Многочисленные исследования показывают, что в клетках зимующих растений осенью, помимо снижения содержания воды (Хлебникова и др., 1963; Quamme, 1978; Sakai, 1979; Красавцев и др., 1984), разнообразных биохимических изменений (Судачкова и др., 1977; Griffith, 1996; Попков, 2007; Трунова, 2007), наблюдаются структурные преобразования, повышающие компартментацию клеток (Полякова, Преснухина, 1977; Трунова, 1984; Drossopoulus, Niavis, 1988). Однако почти все многочисленные данные по структурному преобразованию клеток не включали количественную оценку изменения растворимых и нерастворимых компонентов, а также были получены при изучении разнородных по происхождению, составу и анатомическому строению
образцов (листья, почки, кора, корни, стволовая древесина, побеги, камбиальная зона и т.д.). Вместе с тем, повышенной чувствительностью к морозам обладают почки деревьев и кустарников, поэтому исследования изменений меристематических тканей почек морозоустойчивых видов, позволяющие успешно переносить зимние условия и сохранять жизнеспособность, до настоящего времени актуальны.
Ранее нами было показано, что в состоянии глубокого покоя содержание воды в меристематических тканях почек морозоустойчивых хвойных снижается почти вдвое: с 2,5-2,7 до 1,3-1,4 г/г а.с.м. ткани (Миронов и др. 2001; Алаудинова и др. 2007). Затем дана характеристика распределения жидкой фазы внутриклеточной воды, находящейся при отрицательных температурах в равновесии со льдом, между растворимыми и нерастворимыми компонентами меристе-матических клеток (Алаудинова, Миронов, 2009). Показано, что при снижении температуры до минус 20 °С в меристемах остается около 0,45 г незамерзшей воды на г а.с.м. ткани; в капиллярной системе клеточных стенок и мембран воды, способной кристаллизоваться и, таким образом, повреждать клеточные мембраны, практически не остается.
Хвойные бореальной зоны, XXXIII, № 1 - 2, 2015
Таким образом, незамерзшую воду, способную кристаллизоваться при дальнейшем снижении температуры вплоть до минус 40 °С, внутри клетки связывают только водорастворимые вещества цитоплазмы, обладающие выраженными водоудерживающими свойствами. В этой связи, оценивая сезонные изменения состояния меристематических тканей почек хвойных, возникает необходимость контролировать их структурные трансформации при адаптации к низким температурам осенью и при утрате устойчивости весной, в первую очередь, изменение массовой доли водорастворимых веществ цитоплазмы и нерастворимых компонентов меристематических клеток, что и явилось целью данной работы.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования являлись меристемати-ческие ткани вегетативных почек распространенных в Красноярском крае хвойных видов семейства Pina-ceae: лиственницы сибирской (Larix sibirica L.), ели сибирской (Picea obovata L.), пихты сибирской (Abies sibirica L.), сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) и сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica Rupr Mayr.).
Постоянные пробные площади находятся в Среднесибирском подтаежно-лесостепном районе на территории Мининского лесничества (смешанные дре-востои со сходными лесоводствено-таксационными характеристиками на серых средне оподзоленных тяжелосуглинистых почвах). Сбор образцов производился в разные периоды годового цикла, в соответствии с различными фенологическими фазами развития почек. Побеги последнего года отбирали со средних деревьев II - III класса возраста. Меристема-тические ткани вегетативных почек срезали скальпелем по границе с ксилемой побега.
Меристематические клетки являются растительными клетками, у которых целлюлозная оболочка (клеточная стенка) не лигнифицирована; в центре клетки отсутствует крупная вакуоль. Поэтому для получения суммарного бесклеточного гомогената выбран сравнительно мягкий способ гомогенизации ткани - растирание вручную пестиком в ступке. Суммарные фракции растворимых и нерастворимых клеточных компонентов получали следующим образом: меристе-матические ткани гомогенизировали в ледяной дистиллированной воде; время гомогенизации 2 минуты, соотношение массы меристематических тканей и воды - 1 : 20. Растертую массу количественно переносили в центрифужную полиэтиленовую пробирку. Гомогенат центрифугировали при 500g в течение 3 минут. При этом осаждались ядра и клеточные стенки, имеющие высокую плотность и большие размеры. Супернатант осторожно сливали. Осадок дополнительно гомогенизировали со свежей порцией ледяной воды и центрифугировали в тех же условиях, супернатанты и осадки объединяли. Осадок, отделявшийся при 500g в дальнейшем называли клеточными стенками.
Супернатант, содержащий клеточные органеллы, их фрагменты, клеточные мембраны центрифугиро-
вали при 22 000g в течение 30 минут. Осадок дважды промывали ледяной водой и центрифугировали в тех же условиях. Осадок, отделявшийся при 22 000g называли комплексом клеточных мембран. Надосадоч-ная жидкость содержала водорастворимые вещества цитоплазмы меристематических клеток.
Содержание водорастворимых веществ цитоплазмы (ВВЦ), комплекса клеточных мембран (ККМ) и клеточных стенок (КС) в образцах меристем определяли гравиметрически.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Сезонная динамика суммарного содержания водорастворимых веществ цитоплазмы в меристемах почек хвойных видов представлена на рисунке 1.
Время отбора проб0, месяц
—•— лиственница —■— ель —*— пихта —сосна —*— кедр
Рисунок 1 - Сезонная динамика содержания водорастворимых веществ цитоплазмы
Установлено, что в течение периода исследования содержание ВВЦ в меристемах почеку хвойных существенно изменялось: у лиственницы - от 38 до 54 %, у ели - от 37 до 64 %, у пихты - от 36 до 61 %, у сосны - о т 32 до 49 %, у кедра - от 31 до 43 % от а.с.м. ткани. Характер динамики содержания в осенне-зимний период у всех пород имел сходство. В тоже время в течение всего периода исследования уровень содержания водорастворимых веществ у лиственницы, ели и пихты был выше, чем у сосны и кедра: в августе (формирующиеся почки) примерно на 4-8 %; зимой (почки в состоянии низкотемпературной устойчивости) - на 10-15 %; весной (набухшие почки перед распусканием) - на 5-10 % от а.с.м. ткани. В начале сентября содержание водорастворимых веществ у всех видов начинало возрастать, что по срокам совпадало с началом снижения содержания в них воды (Алаудинова и др. 2007) При этом наблюдалась обратная корреляция между содержанием водорастворимых и влажностью меристем: у кедра - R2 = 0,87; у сосны - R2 = 0,93; у ели, пихты и лиственницы -R2 = 0,95. Максимальный зимний уровень ВВЦ у ели, пихты, сосны и кедра достигался практически одновременно - во второй половине ноября; у лиственницы значительно раньше - к середине октя-
бря. В течение всего зимнего периода содержание водорастворимых веществ оставалось высоким и стабильным: около 52 % у лиственницы, 59 % у ели, 56 % у пихты, 45 % у сосны и 43 % у кедра.
Весной, когда процессы жизнедеятельности в клетках активизировались, характер динамики ВВЦ у исследованных видов приобретал свои особенности. Обращает на себя внимание, что в меристемах вегетативных почек лиственницы, ели и пихты некоторое снижение их содержания наблюдалось уже в конце февраля (примерно на 10 % от зимнего уровня), подтверждающее, что в клетках живых тканей метаболические процессы протекают даже при отрицательных температурах воздуха. Однако уже во второй половине марта содержание ВВЦ начинало резко возрастать, достигая весеннего максимума у ели и пихты в середине апреля, а у лиственницы на неделю позже - в третьей декаде месяца. Максимум фиксировался примерно в течение недели. Затем содержание водорастворимых веществ начинало снижаться, и к моменту распускания почек (начало мая) составляло 41-45 % от а.с.м. ткани.
Следует отметить, что изменение содержания (как рост, так и снижение), наблюдавшееся в меристемах почек этих пород весной, совпадало с ростом водосо-держания (рисунок 2).
70
5 «я
6 *
Я н
февраль март апрель май
Время отбора проб, месяц
—♦— лиственница —■—ель
* пихта —♦—сосна —кедр
— 1 - влажность лиственницы, ели,пихты -2 - влажность сосны, кедра
Рисунок 2 - Изменение содержания водорастворимых веществ цитоплазмы и воды в клетках меристем в период набухания почек и потери устойчивости
Это свидетельствует о согласованности изменения содержания ВВЦ, процесса набухания почек, а также структурной подготовки клеток фотосинтетического аппарата к вегетации.
В меристемах почек сосны весной так же, как и у пород первой группы (лиственницы, ели и пихты) наблюдался рост содержания водорастворимых веществ. По времени он начинался, как и у лиственницы, на две недели позже - в конце марта и не предварялся снижением их содержания. Рост содержания
водорастворимых веществ в меристемах почек сосны также был связан с ростом водосодержания (см. рисунок 2). Максимального содержания (около 49 % от а.с.м. ткани) водорастворимые вещества достигали в последней декаде апреля. Далее, вплоть до распускания хвои, их уровень в меристемах снижался. У кедра весеннего максимума водорастворимых веществ, характерного для остальных пород, не обнаружено. Однако высокое и стабильное зимнее содержание водорастворимых сохранялось вплоть до середины апреля и только затем начинало снижаться быстрыми темпами. В набухших почках сосны и кедра перед распусканием уровень ВВЦ составлял около 35 % от а.с.м. ткани.
Результаты определения содержания нерастворимых клеточных компонентов в меристемах в различные сезоны года, в соответствии с фенологическими фазами развития почек приведены на рисунке 3.
Кедр
о— ч
ч \ /
1
\ —•— -— : I
Ч; ■ .....V
■—♦— Л \ <1 1
V?
70
65
I 60
* 55
о
о 50
£
к 45
|40 д
° 35 30
Время отбора проб, месяц
-■- лиственница —♦— ель —а— пихта -4• сосна кедр
Рисунок 3 - Сезонная динамика содержания нерастворимых компонентов (комплекса клеточных стенок и мембран)
Оказалось, что количество этих компонентов в меристематических клетках существенно зависит не только от сезона года, фенофазы развития почек, но и от породы. Для сосны и кедра характерно более высокое содержание нерастворимых компонентов по сравнению с лиственницей, елью и пихтой. Кроме того, в течение всего периода исследования содержание нерастворимых компонентов в меристемах сосны и кедра было выше, чем содержание водорастворимых веществ. Осенью у этих пород содержание нерастворимых компонентов в меристемах снижалось примерно на 18-20 % от а.с.м. ткани. У лиственницы, ели и пихты динамика содержания нерастворимых компонентов в осенне-зимний период аналогична - их количество уменьшалось от 6264 % осенью до 42-48 % зимой.
На следующем этапе нерастворимые компоненты меристематических клеток методом дифференциального центрифугирования разделяли на две фракции: клеточные стенки (КС) и комплекс клеточных мембран (ККМ).
4
2
0
Хвойные бореальной зоны, XXXIII, № 1 - 2, 2015
Лиственница
50
40
30
20
ч
\ \ л /
* г V у
V
Время отбора проб,месяц -комплекс клеточных мембран —■— клеточные стенки
Ель
50
40
30
20
10
5 о
Пихта
50
£ Я
Ч 30
к
8- 10
\ \
\
\ N /
•— / \
Время отбора проб, месяц -комплекс клеточных мембран -«-клеточные стенки
\ \
\ л- л г
V /— X А
\ V / \
Время отбора проб, месяц -комплекс клеточных мембран —•—клеточные стенки
Сосна
50
20
/
Кедр
50
40
30
20
л 8 10
3
Время отбора проб, месяц -комплекс клеточных мембран
клеточные стенки
Время отбора проб,месяц -комплекс клеточных мембран —■— клеточные стенки
Рисунок 4 - Сезонная динамика комплекса клеточных мембран и клеточных стенок
В августе максимально высокое содержание суммы нерастворимых компонентов в меристемах у всех пород обеспечивалось, в основном, за счет клеточных стенок. Их доля была примерно в два-три раза выше, чем доля комплекса клеточных мембран (рисунок 4). Развитие низкотемпературной устойчивости сопровождалось снижением массовой доли клеточных стенок: в результате у всех пород в зимний период доля клеточных стенок становилась на 60-70 % ниже, чем в августе в сформированных почках. Содержание фракции ККМ, напротив, с октября начало увеличиваться. К тому времени содержание водорастворимых веществ у лиственницы, ели и пихты уже достигало 50-55 % от а.с.м. ткани (см. рисунок 1), т.е. приближалось к максимальному среднезимнему значению. Этот момент соответствовал началу роста массовой доли ККМ, который завершался к концу ноября. В меристемах зимующих почек у всех хвойных пород доля ККМ была примерно на 40-45 % выше, чем в августе. Максимально высокой и стабильной доля ККМ оставалась до конца февраля - около 30-39 % от а.с.м. ткани.
Обращает на себя внимание, что динамика содержания клеточных стенок в этот период находилась в обратной зависимости от динамики содержания водорастворимых веществ.
Анализ сезонной динамики растворимых и нерастворимых компонентов позволил обнаружить у морозостойких хвойных древесных видов в осенне-зимний период общую тенденцию: увеличение в меристемах почек доли водорастворимых веществ цитоплазмы и доли комплекса клеточных мембран. В результате такого трансформирования клеток формируется криозащищенная структура.
Очередная структурная перестройка клеток (изменение содержания растворимых и нерастворимых компонентов) начинается еще в условиях отрицательных температур в начале марта, то есть подготовка к вегетации происходит задолго до выхода дерева из состояния вынужденного покоя.
Следует напомнить, что в клетках вплоть до температуры около минус 40 °С остается жидкая фаза,
а 10
0
0
0
40
20
0
40
Ч 30
£ 10
удерживаемая растворимыми веществами цитоплазмы, наличие которой делает возможным протекание метаболических процессов, изменяющих в этих условиях свойства клеток (Миронов и др. 2001).
Показано, что весной в меристемах накапливается большое количество водорастворимых соединений, превышающее среднезимний уровень. Существование второго (весеннего) максимума содержания водорастворимых веществ в период, когда уровень воды в меристемах значительно увеличивается вследствие набухания почек, объясняется необходимостью дополнительной защиты клеток. В этих условиях (при содержании воды 2-2,5 г / г а.с.м. ткани) даже при небольших морозах возрастает вероятность внутриклеточной кристаллизации. Несмотря на то, что при таком содержании воды точка замерзания составляет минус 1-2 °С (Алаудинова и др. 2007), температура начала кристаллизации переохлажденной воды в клетках может достигать минус 20 °С (Миронов и др. 2001). Снижение температуры ниже минус 20 °С в это время маловероятно, поэтому даже кратковременное повышение содержания в цитоплазме клеток водорастворимых соединений обеспечивает эффективную защиту от возможных низкотемпературных повреждений.
Таким образом, полученные результаты позволяют утверждать, что у лиственницы, ели, пихты, сосны и кедра осенью на фоне общего снижения активности метаболических процессов в меристематических клетках почек наблюдается инициация целого ряда адаптивных механизмов, включающих изменение физико-химических свойств цитозоля посредством синтеза водорастворимых соединений и увеличение структурированности цитоплазмы за счет повышения количества мембранных структур. Такая перестройка позволяет клеткам и тканям высокоморозоустойчивых хвойных видов, успешно переносить низкотемпературное обезвоживание для сохранения жизнеспособности в суровых условиях сибирской зимы.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Алаудинова, Е. В. Сезонные изменения содержания воды
в меристематических тканях почек Picea obovata L.
и Pinus sylvestris L. и её распределение в клетках /
Е. В. Алаудинова, С. Ю. Симкина, П. В. Миронов // Хвойные бореальной зоны. - 2007. - № 4-5. -С. 487-491.
Алаудинова, Е. В. Водоудерживающие свойства меристематических клеток зимующих хвойных: роль низкомолекулярных водорастворимых соединений / Е. В. Алаудинова, П. В. Миронов // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: матер. всерос. конф. - Барнаул, 2009. - Ч.2. - С. 284-288.
3 Красавцев, О. А. Отток воды из переохлажденных зача-
точных бутонов / О. А. Красавцев, О. Н. Разнополов,
H. Н. Хвалин // Физиол. раст. - 1984. - Т. 30. - № 5. -С. 1025-1031.
4 Миронов, П. В. Низкотемпературная устойчивость жи-
вых тканей хвойных / П. В. Миронов, Е. В. Алаудинова, С. М. Репях. - Красноярск : СибГТУ, 2001. - 221с.
5 Полякова, Р. Б. Сезонные изменения ультраструкту-
ры клеток хвои сосны обыкновенной / Р. Б. Полякова, Л. П. Преснухина // Сезонные структурно-метаболические ритмы и адаптация древесных растений. - Уфа, 1977. - С. 87-96.
6 Попков, В. А. Общая химия / В. А. Попков, С. А. Пузаков.
- М. : ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 976 с.
7 Судачкова, Н. Е. Метаболизм хвойных и формирование
древесины / Н. Е. Судачкова. - Новосибирск : Наука, 1977. - 230 с.
8 Трунова, Т. И. Физиологические и биохимические основы
адаптации растений к морозу / Т. И. Трунова // Сельскохозяйственная биология. - 1984. - № 6. - С. 3-10.
9 Трунова, Т. И. Растения и низкотемпературный стресс /
Т. И. Трунова. - М. : Наука, 2007. - 54 с.
10 Хлебникова, Н. А. Физиологическая характеристика хвойных растений Сибири в зимний период / Н. А. Хлебникова, Г. И. Гирс, Р. А. Коловский // Сб. науч. тр. ИЛиД СО АН СССР. - Красноярск, 1963. - Т. 60. - С. 5-16.
11 Drossopoulus, J. P. Seasonal changes of the metabolites in the
leaves, bark and xylem tissues ofolive tree (Olea europaea L.).
I. Nitrogenous compounds / J. P. Drossopoulus, S. A. Niavis // Ann. Bot. - 1988. - V. 62. - N 3. - Р. 313-320.
12 Griffith, M. Extracellular ice formation in freezing-tolerant plants / M. Griffith, M. Antikainen // Adv. Low-Temp. Biol. 1996. - V. 3. - P. 107-139.
13 Quamme, H. A. Mechanism of supercooling in overvintering
peach flover buds / H. A. Quam-me // J. Amer. Soc. Horticult. Sci., 1978. - V. 103. - P. 57-68.
14 Sakai A. Freezing avoidance mechanism of primordial shoots of conifer buds // Plant and Cell Physiol. - 1979. -V. 20. - № 7. - P. 1381-1390.
Поступила в редакцию 10.09.14 Принята к печати 20.12.14
