CC BY
17
Хвойные бореальной зоны, XXXI, № 3 - 4, 2013
УДК 630*181.324
особенности криозащиты набухающих почек хвойных в экологических условиях центральной сибири
Е.В. Алаудинова, П.В. Миронов
ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет» 660049 Красноярск, пр. Мира, 82; е-mail: alaudinovaev@yandex.ru
Приведены результаты исследования антинуклеационных свойств водорастворимых белков, синтезируемых в цитоплазме меристематических клеток почек ели сибирской (Picea obovata L.) и пихты сибирской (Abies sibirica L.) в апреле. Показана способность этих белков обеспечивать переохлаждение внутриклеточных растворов, формируя, таким образом, криозащи-ту хвойных зачатков при набухании почек весной.
Ключевые слова: ель сибирская (Picea obovata L.), пихта сибирская (Abies sibirica L.), меристемы почек, водорастворимые белки цитоплазмы, дифференциально-термический анализ, антинуклеационная активность, переохлаждение.
Research antinucleatic properties of water-soluble proteins of cytoplasm synthesised in a considerable quantity in of buds meristematic tissues of buds of a fur-tree and a fir in the spring was the purpose of this work. It has been shown, that in the middle of April level of water-soluble proteins increases at a fur-tree and a fir to a maximum: 33-34 % from аЛт. of tissues. Spring growth of the maintenance of proteins is co-ordinated with process of swelling of buds. In April the water level in meristems in comparison with winter increases almost twice - to 2-2,5 g / g dry mass of tissuess. At such maintenance of water concentration of water-soluble substances in cytoplasm reaches 15-17 %.
By method of differential-thermal analysis establishes ability of low-molecular water-soluble proteins to provide overcooling of endocellular solutions, forming, thus, necessarily level cryoresistance of meristems at swelling of buds. It is supposed, that the coordination of spring increase of the maintenance in meristems water-soluble proteins and increase in the maintenance of water at swelling of buds is caused necessity of additional protection of cells from endocellular crystallisation in the conditions of spring frosts. During this period even short-term increase of the maintenance in cytoplasm of living cells high-hydrophilic low-molecular water-soluble proteins effectively for prevention possible low-temperature damages.
Keywords: Siberian spruce (Picea obovata L.), Siberian fir (Abies sibirica L.), buds meristems, water-soluble cytoplasmic proteins, differential-thermal analysis, antinucleation activity, overcooling.
ВВЕДЕНИЕ
Важнейшая особенность сезонного изменения содержания и состава водорастворимых веществ в живых (меристематических) тканях почек лесообра-зующих хвойных видов Центральной Сибири связана с водорастворимыми белками. Так для сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) и сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica Rupr Mayr.) круглый год характерно сравнительно низкое содержание этих соединений, варьирующее в пределах 3-5 % на абсолютно сухую массу (а.с.м.) ткани. Для ели сибирской (Picea obovata L.) и пихты сибирской (Abies sibirica L.), напротив, в условиях сезонного снижения температуры окружающей среды в осенне-зимний период типично значительное увеличение содержания водорастворимых белков - от 10-12 до 28-30 % на а.с.м. ткани (Миронов и др., 2001).
Столь существенное отличие белкового метаболизма у хвойных, произрастающих в одинаковых экологических условиях, весьма неожиданно. Поэтому для объяснения данного факта нами были изучены антинуклеационные свойства водорастворимых белков цитоплазмы меристем зимующих почек ели и пихты (Миронов и др., 2003). Результаты этих исследования показали, что водорастворимые белки, активно синтезируемые в осенне-зимний период,
обладают выраженным криозащитным действием. Причем наибольшее переохлаждение внутриклеточных растворов обеспечивают их высокомолекулярные фракции с молекулярными массами выше 100 кД; с меньшим переохлаждением замерзают растворы суммарного водорастворимого белка; еще в меньшей степени обеспечивают переохлаждение цитоплазматических растворов низкомолекулярные фракции водорастворимого белка с молекулярными массами ниже 5 кД.
Таким образом, эксперимент показал, что водорастворимые белки цитоплазмы меристем зимующих почек ели сибирской и пихты сибирской, содержание которых почти втрое возрастало при снижении температуры окружающей среды, как и аналогичные белки лиственницы сибирской, обладают антинуклеационным действием. Данное действие выражается в ингибировании образования устойчивых зародышей ледяных кристаллов в водных растворах и, как следствие, приводит к снижению температуры внутриклеточной кристаллизации (Миронов, Лоскутов, 1998).
Позднее нами было показано (Alaudinova, Мтопо^ 2010), что сезонное изменение содержания водорастворимых белков в тканях ели и пихты связано не только с зимним повышением их уровня. Многолетние наблюдения позволили выявить наличие аб-
солютного максимума содержания водорастворимых белков у этих видов во второй половине апреля. Хотя весенний максимум, в отличие от зимнего, продолжается менее недели, в количественном отношении содержание белка даже превышает средне-зимнее содержание примерно на 5-10 %. Было не вполне понятно, зачем дереву в этот период много водорастворимого белка. Ведь о таком количестве белков-ферментов речь идти не может. В связи с последними данными нами была поставлена задача исследования антинуклеационных свойств водорастворимых белков, синтезирующихся в меристемах ели и пихты весной при набухании почек.
объекты и методы
Объекты исследования: ель сибирская (Picea obovata L.) и пихта сибирская (Abies sibirica L.) (далее - ель и пихта). Сбор образцов меристемати-ческих тканей вегетативных почек производился в ходе годового цикла (с августа по май) с модельных деревьев II-III класса возраста, произрастающих в одинаковых экологических условиях на постоянных пробных площадях в Среднесибирском подтаежно-лесостепном районе (Мининское лесничество).
При изучении переохлаждения воды и водных растворов белков для достижения максимально возможного переохлаждения применялась эмульсионная методика (Rasmussen, Loper, 1976) с добавлением эмульгатора, при использовании которой можно избежать влияния центров гетерогенного зароды-шеобразования и достичь максимально возможного переохлаждения растворов. В этом случае вода в каплях эмульсии (эмульсия типа «вода в масле») будет замерзать по механизму гомогенного зародышеобра-зования, поскольку центры гетерогенной кристаллизации, как правило, всегда присутствующие в малом количестве в воде и водных растворах, будут изолированы в небольшом числе отдельных капель малого размера.
Для приготовления эмульсий использовали вазелиновое масло. Эмульсии воды и водных растворов в масле получали с помощью гомогенизатора. Соотношение масла и воды по объему составляло 10 : 1. Диаметр капель определяли микроскопически: 90 % капель имело диаметр от 3 до 7 дм. Образцы, содержащие около 5 мг воды, охлаждали в калориметре со скоростью 10 °С/ч. За температуру гетерогенной нуклеации принимали температуру максимума тепловыделения при низкотемпературной кристаллизации воды. Данный подход позволяет оценить непосредственное влияние растворенных веществ (в данном случае фракций водорастворимых белков) на кристаллизацию переохлажденной воды по механизму гомогенной нуклеации.
результаты и их обсуждение
Сравнение динамики содержания водорастворимых белков и воды в клетках меристематических
тканей в период набухания почек и потери низкотемпературной устойчивости показало, что весной процесс набухания согласован с ростом содержания белков (рисунок 1).
40
s
га 35 ь
Ъ 30 га
Б 25
<?
га
* 20 &
>о
ф 15 s
I
га * 10 а ф а
Я 5
а 1
vr /Л
•—\ у А (n
ч z
3,5
2,5
*
а ф 1
о и
III IV
Время отбора проб, месяц
—♦—лиственница
ель -*— пихта
-1 - водосодержание лиственницы
-2 - водосодержание ели, пихты
Рисунок 1 - Изменение содержания водорастворимых белков и воды в меристематических тканях весной в период набухания почек
В апреле уровень воды в меристемах по сравнению с зимой увеличивается почти вдвое - от 1,3-1,4 до 2-2,5 г / г а.с.м. ткани, при этом содержание водорастворимого белка достигает очень высоких значений: 33-34 % от а.с.м. ткани.
Результаты определения переохлаждения растворов суммарного водорастворимого белка, выделенного из меристем набухающих почек в апреле, приведены на рисунке 2.
Там же, для сравнения, приведены данные по переохлаждению водных растворов различными фракциями водорастворимого белка, выделенного из зимующих меристем.
Как оказалось, в момент весеннего максимума содержания водорастворимый белок все еще обладает определенной антинуклеационной активностью, соответствующей активности низкомолекулярного белка цитоплазмы зимующих меристем. Это вполне согласуется с данными показывающими, что фракционный состав синтезирующегося в апреле водорастворимого белка значительно отличаются от такового зимнего периода (Alaudinova, М1гопо% 2010). Например, весной в составе белка полностью исчезают высокомолекулярные фракции, обеспечивающие наибольшее переохлаждение внутриклеточных растворов в условиях низких зимних температур, но взамен синтезируется большое количество новых низкомолекулярных фракций с молекулярными массами около 5 кД и ниже.
4
3
2
1,5
0
0,5
II
Хвойныеборешьнойзоны, XXXI, №3-4,2013
7
6
О 5
<ц
» 4
8 3
Р.
й
2
А Д ■
А ■ □ + ( +
Д
□ ■ С . ж
▲ □
■ о ж +
0 1 2 3 4 5 6 Концентрация, %
• - низкомолекулярная фракция белков ели; ■ - суммарный водорастворимый белок ели; ▲— высокомолекулярная фракция белков ели; ж — суммарный водорастворимый белок ели (весенний максимум со дер) жания белка); О — низкомолекулярная фракция белков пихты; □ - суммарный водорастворимый белок пихты; Д и высокомолекулярная фракция белков пихты; + — суммарный водорастворимый белок пихты (весенний максимум содержания белка).
в t
- h L п j
лизуетсяиосредством синтезабольшого коотчества низкомолекулярйыа высоеопщрафимсныа низтомол ловухшрныхбенков. (Збти]эуя^^нл[ая антияпклеаилон-н;м активностн водовкслвоиимык белков ригуплсз-синулотрсмищхст т теич1^тетьу^^р косичаслсох в меуистемас иоеек ели с иттты обсенеекоськ
необходимый уровель криозащиты тканей. Возрастание содержания таких белков, обладающих даже не очень высокой антинуклеационной активностью (вл-султленшс в еимстмивысиктмолекулзфнымв: сяркямс(, в экотпмриод ывязаос с ^{^с^лртдаиясттю ебесеенивавс персохлаоедемет тквней е ^^х^о виях бы-ьиртго увевиленрм содержеиия ввды вклтеви при ноИухании почек.
и
2 х о
Щ
H
^ — температура кристаллизации переохлажденных растворов; б0 й температур кристалиизации переохлажденной воды; ^ — температура плавления замерзших растворов и воды; Д1 — переохлаждение.
Рисунок2-Зависимостьстепенипереохлаждения раствороввысоко-инизкомолекулярных белков ели и пихтыотихконцентрации
Как показали несложные расчеты, при содержании воды 2-2,5 г / г а.с.м. ткани концентрация водорастворимых веществ в цитоплазме ровна 15-17 %. Несмотря на то, что точка плавления внутриклеточного раствора при этой концентрации составляет около минус 1 °С (Миронов и др., 2001), температура начала кристаллизации при таком уровне содержания переохлажденной воды в клетках будет значительно ниже-примерноминус 20 °С (рисунокЗ).
В климатических условиях г. Красноярска и его окрестностей в апреле нередко наблюдаются заморозки, значит вероятность внутриклеточной кристаллизации и гибели растительных клеток с повышенным водосодержанием велика. Очевидно, наличие антинуклеационных свойств у водорастворимого белкав момент весеннегомаксимумаегосодержания связано с необходимостью дополнительной защиты клеток от внутриклеточной кристаллизации. Таким образом, весенняя криозащита у ели и пихты реа-
-20 -10 Т ампул-явлс еС
1 и 2 - набухшие почки скорость охлаждения 20 и15 оС;
3 и 4 - тепловыделение при кристаллизации через двое суток и через неделю после распускания почек
РисунокЗ-Калориметрическиекривыеохлаждения отрезков побегов с почкамиеливпроцессе набухания почек
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
По многолетним данным Красноярского центра по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды снижение температуры воздуха во второй половине апреля до минус 20 °С и ниже уже маловероятно. Вместе с тем, в условиях Центральной Сибири небольшие заморозки для этого времени года - явление обычное. Поэтому можно считать, что согласованность весеннего повышения содержания в меристемах водорастворимых белков и увеличения содержания воды объясняется необходимостью дополнительной защиты меристе-матических клеток от внутриклеточной кристаллизации в условиях возможных весенних заморозков при набухании и в момент распускания почек. В этот период даже кратковременное повышение содержания в цитоплазме живых клеток водорастворимых белков способно эффективно предотвратить низкотемпературное повреждение живых тканей хвойных зачатков.
1
0
7
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Миронов, П.В. Низкотемпературная устойчивость живых тканей хвойных / П. В. Миронов, Е.В. Алаудинова, С.М. Репях. - Красноярск: СибГТУ, 2001. - 253 с.
Миронов, П.В. Исследование морозостойкости древесных растений, интродуцируемых в дендрарии Института леса СО РАН. 1. Роль белков-криопротекторов в переохлаждении внутриклеточной воды в тканях лиственницы сибирской / П.В. Миронов, С. Р. Лоскутов // Лесн. журн. -1998. - № 6. - С. 24-29.
Физико-химические свойства водорастворимых белков меристем зимующих почек ели и пихты / П.В. Миронов [и др.) // Лесн. журн. - 2003. -№ 6. - С. 75-82.
Alaudinova, E. V Comparative characterctics of water-soluble proteins from Larix sibirica, Picea obovata and Abies sibirica Bud Meristems / E. V. Alaudinova, P. V. Mironov // Chemitry of Natural Compounds. -V 46. - N 3. - 2010. - P. 430-435.
Rasmussen, D.N. DSC: A rapid method for isothermal rate nucleation measurement / D.N. Rasmussen, C.K. Loper // Acta Metalling. - 1976. - V. 24. -P. 117-123.
