CC BY
26
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
DOI:10.25930/0372-3054-2018-1-11-98-106 УДК 636.32/. 38:611/612
ОСОБЕННОСТИ МИКРОСАТЕЛЛИТНОГО ПРОФИЛЯ ОВЕЦ, РАЗВОДИМЫХ В УСЛОВИЯХ КЫРГЫЗСТАНА
М.И. Селионова, Е.М. Лущихина, Л.Н. Чижова
Ценность местных локальных пород сельскохозяйственных животных, в том числе и овец, заключается в том, что они сформированы на протяжении многовековой, так называемой «народной селекции», что обусловливает у них уникальные свойства, отсутствующие у животных широко распространенных специализированных пород.
Современные интенсивные животноводческие технологии с использованием зачастую ограниченного числа выдающихся производителей приводят к сокращению местных локальных пород, вплоть до их исчезновения. Это обедняет видовой генофонд, сужает возможность селекции по использованию наследственного потенциала уникального генофонда местных пород.
Микросателлиты (Short Tandem Repeats, STR), короткие тандемные повторы, широко представленные всему геному благодаря высокому генетическому полиморфизму, маркируют генетическую структуру породы, тем самым становятся генетическим ориентиром при сохранении генофонда редких и исчезающих пород.
Использованием полилокусного микросателлитного анализа, метода кластеризации изучен и проанализирован полиморфизм двенадцати микросателлитных локусов ДНК (BLT001B, CSRD247, FCB20, CSAP36, MAF65, McM147, OarCP49, D5S2, HSC, BMS2213, INRA23, BL1001) у овец разного направления продуктивности, разводимых в условиях Кыргызстана. Установлена специфичность микросателлитного профиля, характерная для каждой популяции. Выявлены различия в степени гетерогенности исследованных пород и архара. Проведен анализ эволюционно-генетических связей и на основе полученных результатов по микросателлитным локусам ДНК обсуждаются вопросы их происхождения, некоторые исторические факты. Делается заключение о высокой информативности результатов микросателлитного анализа для организации и проведения селекционно-племенной работы по сохранению и рациональному использованию уникального генофонда пород овец Кыргызстана.
Ключевые слова: биоразнообразие, полиморфизм, генотипирование, микросателлиты, породы овец
FEATURES OF MICROSATELLITE PROFILE IN SHEEP BRED IN THE CONDITIONS OF KYRGYZ REPUBLIC
M.I. Selionova, E M. Lushchikhina, L.N. Chizhova
The value of local breeds of farm animals, including sheep, lies in the fact that they are formed during the centures-old so-called "people's breeding", possess many properties that are absent in animals of widely distributed specialized breeds.
Modern intensive animal-breeding technologies, using often a limited number of outstanding sires, lead to the reduction of local breeds up to their disappearance. This impoverishes the species gene pool, narrows the possibility of selection for using the hereditary potential of a unique gene pool of local breeds.
Microsatellites (Short Tandem Repeats, STR), widely represented to the whole genome due to high genetic polymorphism, mark the genetic structure of the breed, thereby be-
coming a genetic reference point with preservation of the gene pool of rare and disappeared breeds.
Using polylocus microsatellite analysis, together with the clusterization method, the polymorphism of twelve microsatellite loci of DNA (BLT001B, CSRD247, FCB20, CSAP36, MAF65, McM147, OarCP49, D5S2, HSC, BMS2213, INRA23, BL1001) in sheep of different directions of productivity reared in the conditions of Kyrgyzstan was studied and analyzed. Specificity of the microsatellite profile, characteristic for each sheep population is established. Differences in the degree of heterogeneity of the breeds and argali studied are revealed. The analysis of evolutionary - genetic relationships is cartried out, and based on results obtained on microsatellite DNA loci, questions on their origin, some historical facts are discussed. It is concluded that the results of microsatellite analysis are highly informative for the organization and conduct of selection and breeding work on the preservation and rational use of the sheep unique gene pool in Kyrgyzstan.
Key words: biodiversity, polymorphism, genotyping, microsatellites, sheep breeds
Введение. В настоящее время проблема сохранения биоразнообразия животных является одной из главных и приобрела международное значение, так как затрагивает многие страны мира. Человечество несет колоссальные потери в результате вымирания беспредельного количества незаменимых видов [1].
Исходя из информации ФАО (2016) около 17% пород сельскохозяйственных животных во всем мире находятся на грани исчезновения. За период с 2000 до 2014 года почти 100 пород домашних животных уже исчезли. Самая высокая доля пород, находящихся на грани исчезновения, приходится на Европу и Кавказ. В течение последних 5 лет было потеряно 60 пород: в среднем по 1 породе в месяц.
Анализ количественных и качественных характеристик видового, породного разнообразия сельскохозяйственных животных России также свидетельствует о существовании угрозы не только дальнейшего сокращения биоразнообразия, но и потере собственных генетических ресурсов. На грани исчезновения романовская, опаринская породы овец, в молочном скотоводстве - ярославская и ряд других пород сельскохозяйственных животных [2]. Опасность ситуации заключается в том, что потеря породного разнообразия сказывается не только на утрате уникального и бесценного генетического разнообразия, но и на сужении генетического потенциала, что приводит к исчезновению генов, генных комбинаций, которые могли быть использованы в селекционной работе не только в настоящее время, но и в будущем.
Существующий уровень генетического разнообразия подвержен влиянию многих факторов, одним из них является быстрое распространение современных технологий, предусматривающих использование высокопродуктивных пород и, как правило, ограниченного генетического материала в системе воспроизводства. Это приводит к сокращению местных, локальных пород, вплоть до их исчезновения, обладающих видовой специфичностью генофонда, тем самым сужая возможность генетического разнообразия.
Кроме того, генофонд отечественных пород систематически подвергается генетической эрозии за счет использования в селекции экзотических пород, что приводит к дисбалансу в породном разнообразии.
Сохранение специфических генных комплексов, сбалансированной системы генов, обусловливающих фенотипические породные характеристики, связанные с эксте-рьерными особенностями, продуктивностью, резистентностью животных, невозможно без использования молекулярно-генетических методов, в частности, микросателлитно-го анализа, позволяющего получать большой объем информации для решения не только фундаментальных, но и прикладных проблем науки и практики [3, 4, 5].
Вышеизложенное послужило основанием для применения микросателлитных маркеров ДНК для изучения особенностей их полиморфизма у овец разных пород, разводимых в условиях Кыргызстана. До настоящего времени их генетические особенности не исследовались. В этой связи изучение пород и популяций овец Кыргызстана, как с точки зрения их генетической локализации в мировом генофонде пород, так и в практическом аспекте изменения их генетической структуры под влиянием селекционных процессов, определило цель и актуальность настоящего исследования.
Материалы и методы исследований. Биоматериалом служила ДНК, выделенная из образцов крови овец (n=93) гиссарской грубошерстной породы нескольких популяций овец, разводимых в чистоте: таджикской ( n=14); гиссарской 1 (n=21); гиссарской 2 (n=10) и помесей I поколения, полученных от скрещивания с породой авасси (n=10), местных кыргызских грубошерстных курдючных овец (n=5); алайской полугрубошерстной курдючной породы (n=20), кыргызского горного мериноса (n=7) и архаров (n=6). Генотипирование проводилось по 12 микросателлитным локусам (BLT001B, CSRD247, FCB20, CSAP36, MAF65, McM147, OarCP49, D5S2, HSC, BMS2213, INRA23, BL1001) на генетическом анализаторе ABI3130xl (Applied Biosystems, США) с использованием программного обеспечения Gene Mapper v. 4 (Applied Biosystems, США). Для расчета среднего числа аллелей на локус (Na), эффективного (Ne) и числа информативных аллелей, т.е. с частотой встречаемости более 5% (Na>5%), ожидаемой (He) и наблюдаемой (Ho) гетерозиготности, коэффициента инбридинга (Fis) использовалась программа GenAIEx 6,5 [6]. Степень генетической дифференциации пород оценивали по показателю Fst [7] и генетическим дистанциям Нея (DN) [8] при попарной кластеризации.
Результаты исследований и их обсуждение. Анализ полученных результатов свидетельствует о генетическом своеобразии пород овец, разводимых в условиях Кыргызстана, выразившемся в значительной вариабельности среднего числа аллелей на ло-кус (табл. 1).
Таблица 1 - Характеристика аллелофонда и параметры генетического _разнообразия изучаемых пород овец_
Порода, популяции Na Ne Na>5 % Ho He Fis
Гиссарская таджикская 8,083± 0,874 5,843± 0,603 5,833± 0,548 0,775± 0,041 0,793 ± 0,036 0,017 ± 0,033
Гиссарская 1 9,667± 0,890 6,114± 0,618 6,000± 0,522 0,732± 0,039 0,808± 0,028 0,095 ± 0,036
Гиссарская 2 6,583± 0,733 4,439± 0,438 6,583± 0,733 0,714± 0,063 0,741 ± 0,035 0,050 ± 0,074
Гиссарская х авасси 7,000± 0,640 4,796± 0,425 7,000± 0,640 0,765± 0,057 0,767 ± 0,028 0,009 ± 0,058
Алайская 9,333± 0,820 5,866± 0,617 6,583± 0,701 0,680± 0,250 0,796 ± 0,033 0,149 ± 0,050
Кыргызская 5,083± 0,468 4,354± 0,402 5,083± 0,468 0,692± 0,078 0,710 ± 0,067 0,020 ± 0,069
Кыргызский горный меринос 5,667± 0,595 4,197± 0,356 5,667± 0,595 0,587± 0,070 0,707 ± 0,065 0,174 ± 0,057
Архар 2,750± 0,592 2,209± 0,452 2,750± 0,592 0,444± 0,115 0,456 ± 0,077 0,059 ± 0,157
В среднем 6,771± 0,48 4,727± 0,47 5,687± 0,43 0,688± 0,064 0,722± 0,046 0,072± 0,066
npuMeHanue:Na - среднее число аллелей на локус; Ne - число эффективных аллелей на локус; Na>5 % - аллелей на локус с частотой встречаемости от 5%; Ho - наблюдаемая гетерозиготность; He -ожидаемая гетерозиготность; Fis - коэффициент инбридинга
Максимальная величина этого показателя была характерна для популяций гис-сарской 1 (9,667±0,890) и полугрубошерстной алайской породы (9,333±0,820), несколько меньшая (8,083±0,874; 7,000±0,640) - для гиссарской породы и помесей гиссарская х авасси, сравнительно одинаковым (5,667±0,595; 5,083±0,468) среднее число аллелей было у горного мериноса и овец кыргызской грубошерстной породы, минимальное (2,75±0,66) - у архаров.
Наибольшее число эффективных аллелей на локус установлено в популяциях гиссарской, таджикской, гиссарской 1 (соответственно 6,114±0,618 и 5,843±0,603) и алайской (5,866±0,617); сравнительно равномерное распределение эффективных аллелей на локус оказалось у помесей гиссарская х авасси (4,796±0,425), гиссарская 2 (4,439±0,438), у местных кыргызских грубошерстных курдючных овец (4,356±0,402) и у горного мериноса (4,197±0,356); минимальное (2,209±0,452) - у архаров.
Неоднозначным оказалось и число информативных аллелей, встречающихся с частотой 5% и более. Наибольшая величина этого показателя была характерна для помесных овец гиссарская х авасси (7,000±0,640). У овец алайской полугрубошерстной породы и популяции гиссарская 2 число информативных аллелей на локус было одинаковым (6,583±0,717). Схожесть количества информативных аллелей выявлена в популяциях таджикской и гиссарской 1, горном мериносе и у местных кыргызских курдючных овец (6,000±0,522; 5,833±0,548; 5,667±0,595; 5,083±0,468 соответственно) и очень низкая (2,750±0,592) - у архаров.
Сравнительный анализ уровня наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности свидетельствует о неоднозначности характера его распределения в исследуемых породах, популяциях овец и архара. Вариабельность наблюдаемой гетерозиготности варьировала от 0,775±0,041 до 0,444±0,115; ожидаемой - от 0,808±0,028 до 0,456±0,077. При этом наиболее высокие показатели наблюдаемой гетерозиготности были характерны для гиссарской породы и ее помесей с авасси, ожидаемой - также для популяций гис-сарской породы и алайской. Минимальные значения изучаемых показателей выявлены у архаров и горного мериноса.
Вариабельность индекса фиксации (Fis), отражающего отклонение частот встречаемости гетерозиготных генотипов от теоретически ожидаемой доли гетерозигот (по Харди-Вайнбергу), то есть являющегося мерой уменьшения гетерозиготности, оказалась достаточно изменчивой и варьировала от максимальных значений (0,174±0,057) -у горного мериноса и алайской породы (0,149±0,050), до минимальных (0,009±0,058; 0,017±0,033; 0,020±0,069) - соответственно у помесей гиссарская х авасси, в таджикской популяции гиссарской породы и у кыргызских грубошерстных курдючных овец. Анализ результатов Fis позволяет сделать заключение о том, что положительные его значения свидетельствуют о дефиците гетерозигот в исследуемом массиве животных. Анализом индекса Fst, являющегося критерием генетических различий и имеющего всегда положительное значение, выявлены минимальные его значения ( Fst=0,019) у таджикской популяции гиссарской породы и гиссарской 1, максимальные - кыргызская грубошерстная - горный меринос (Fst=0,0141), горный меринос - архары (Fst=0,273). Если брать за основу заключение Hartl и Clark [9] о том, что значения Fst, меньшие 0,05, свидетельствуют о незначительной генетической дифференциации, от 0,05 до 0,15 - об умеренной, от 0,15 до 0,25 - о значительной, для большей части исследуемого массива овец характерна незначительная или умеренная генетическая дифференциация, кроме кыргызского горного мериноса и архаров.
Анализ генетических дистанций (Nei, 1972) выявил неоднозначность межпородной удаленности (табл. 2).
Таблица 2 - Значение генетических дистанций между изучаемыми породами и _популяциями овец_
Порода, популяция Гиссарская таджикская Гис-сарс-кая 1 Гис-сар-ская 2 Гиссарская х авасси Алай-ская Кыр-гыз-ская Кыр-гыз-ский меринос Архар
Гиссарская таджикская * 0,019 0,052 0,036 0,034 0,096 0,084 0,221
Гиссарская 1 0,172 * 0,045 0,027 0,031 0,089 0,081 0,222
Гиссарская 2 0,406 0,367 * 0,051 0,054 0,115 0,074 0,250
Гиссарская х авасси 0,315 0,234 0,395 * 0,041 0,090 0,115 0,237
Алайская 0,293 0,287 0,495 0,365 * 0,060 0,089 0,224
Кыргызская 0,554 0,605 0,491 0,626 0,392 * 0,143 0,264
Кыргызский меринос 0,781 0,761 0,937 1,067 0,709 0,994 * 0,273
Архар 1,180 1,277 1,496 1,356 1,238 1,640 1,410 *
Примечание: под диагональю указаны несмещенные генетические дистанции по Нею, над диагональю - значение индекса Fst при парном сравнении
5тЫ)
^^^с^Ьрор
■ ^ МШСПУОЫСП
_I_I_I_I_I_I_I_I_I_
- Архары
- Горный меринос
Авасси х гиссарская Гиссарская таджикская
- Популяция Гиссарская 1
Популяция Гиссарская 2 Алайская порода - Кыргызская местная
Рис. 1 - Филогенетическое дерево на основе матрицы попарных генетических дистанций между исследуемыми породами, популяциями овец и архара
Анализ филогенетического дерева, построенного на основании генетических дистанций, показывает, что исследованные породы и популяции овец образовали два неравнозначных кластера и отдельную ветвь (рис. 1). Первый, самый крупный кластер, представлен двумя подкластерами. Подкластер I-I сформировали породы кыргызская грубошерстная курдючная и алайская, что представляется вполне логичным, поскольку при создании алайской породы материнской основой явились местные кыргызские грубошерстные овцы, которых улучшали породами прекос и сараджинской.
При этом наибольшее генетическое сходство в данном подкластере проявили овцы чистопородной «таджикской» популяции и популяции из гиссарской 1. По -видимому, некоторая удаленность популяции овец гиссарской породы из гиссарской 2 обусловлена более значительным периодом ее разведения в условиях Кыргызстана. Возможно, больший промежуток времени адаптации к новым природно-климатическим условиям обусловил начало изменений в генетической структуре этой популяции.
Выделение во второй кластер горного мериноса и пород алайская, кыргызская грубошерстная, популяций гиссарской породы в чистоте, а также помесей с породой авасси, по всей видимости, продиктовано разным направлением продуктивности этих пород и соответственно разным генетическим укладом, формирующим различные признаки продуктивности.
Как отмечалось выше, филогенетический анализ генетических дистанций определил два уже описанных кластера и отдельную ветвь, которую образовали генотипы популяции архара. Ранее считалось, что одним из древних предков современных домашних овец являются архары, от которых произошли жирнохвостые и длиннотоще-хвостые породы, в том числе и тонкорунные, а прародителями курдючных пород были аргали. Однако позднее в результате цитологических исследований было установлено, что дикие бараны имеют три кариотипа. У аргали или архара имеется 56 хромосом, у аркара - 58, а у муфлона - 54 хромосомы, столько же, сколько у домашних овец всех частей мира. Поэтому в настоящее время единственным предком современных овец считается муфлон, а центром распространения - Средняя и Центральная Азия, Средиземноморье.
Полученные в настоящем исследовании данные косвенно указывают на справедливость данного утверждения, поскольку архары сформировали отдельную ветвь с кластером, в который вошла и мериносовая порода овец, а не наоборот, с кластером, в который сформировали исключительно курдючные породы. То есть архары в выполненном анализе показывают генетическую равноудаленность как от исследованных грубошерстных курдючных пород, так и от мериносовой породы.
Заключение. Проведенные исследования, анализ полученных результатов позволяют заключить, что полилокусное генотипирование (по 12 локусам микросателлитов ДНК) позволило оценить параметры генетического разнообразия, популяционную структуру, сходство, различие генофондов местных аборигенных пород овец Кыргызстана. Дана оценка консолидированности изученных пород, популяций, результаты кластеризации свидетельствуют о наличии двух неравнозначных кластеров и отдельной ветви, которую образовали генотипы популяции архаров.
Уникальность генетической структуры изученных пород овец является предпосылкой к формированию генетической структуры пород, отдельных популяций, которые позволили бы сохранить существующую генетическую изменчивость, с одной стороны, и как резерв изменчивости для создания географически адаптированных популяций овец - с другой.
Литература
1. Амерханов Х.А. Овцеводство и козоводство Российской Федерации в цифрах. Ставрополь. 2017.
2. Марзанов Н.С. Сохранение биоразнообразия. Генетические маркеры и селекция животных //Сельскохозяйственная биология. 2006. № 4. С. 3-10.
3. Глазко В.И., Столповский Ю.А., Глазко Т.Т., Феофилов А.В. Структурно-функциональные особенности микросателлитов в геномах КРС и овец //Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2011. №1. С. 41-45.
4. Денискова Т.Е., Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А. Характеристика некоторых российских пород овец по микросателлитным маркерам //Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. 2016. 9(1). С. 24-29.
5. Денискова Т.Е., Селионова М.И., Гладырь Е.А., Доцев А.В., Бобрышова Г.Т., Костюнина О.В., Брем Г., Зиновьева Н.А. Изменчивость микросателлитов в породах овец, разводимых в России //Сельскохозяйственная биология. 2016. Том 51. №6. С. 801-810
(doi: 10.15389 /agrobiology. 2016.6.801rus).
6. Peakall R., Smouse P.E. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research-an update. //Bioinformatics, 2012, 28: 2537 - 2539
(doi: 10.1111/j. 1471-8286.2005. 01155.x).
7. Weir B.S., Cockerham C.C. Estimating F-Statistics for the analysis of population structure //Evolution, 1984, 38 (6): 1358-1370.
8. Nei M. Genetic distance between populations //American Naturalist, 1972, 106: 283-392.
9. Hartl D.L., Clark A.G. Principles of population genetics, 3rd edition. Sunderland, MA: Sinaur, 1997.
Селионова Марина Ивановна, профессор РАН, доктор биологических наук, директор Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства - филиал «Северо-Кавказский ФНАЦ», 355017, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический, 15. тел. (8652) 37-10-39, E-mail: m_selin@mail.ru
Лущихина Евгения Михайловна, доктор биологических наук, профессор, Институт биотехнологии НАН, Кыргызская Республика, тел. 810996312392028, E-mail: Lushihina.merinos-kg@yandex.ru
Чижова Людмила Николаевна, доктор сельскохозяйственных наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории иммуногенетики и ДНК-технологий Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства - филиал «Северо-Кавказский ФНАЦ», 355017, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический, 15. E-mail: immunogenetika@yandex.ru
Selionova Marina Ivanovna, Professor of the RAS, Doctor of Biological Sciences, Director of the All - Russian Research Institute of Sheep and Goat Breeding, branch of the FSBSI "North Caucasus FARC", Stavropol tеl, (8652) 37-10-39, E-mail: m_selin@mail.ru
Lushchikhina Elena Mikhilovna, Doctor of Biological Sciences, Professor, Institute of Biotechnology, NAS of the Kyrgyz Republic, tel. 8 109 96312392028, E-mail: Lushihina.merinos-kg@yandex.ru
Chizhova Lyudmila Nikolaevna, Doctor of Agricultural Sciences, Professor, chief researcher of the laboratory of immunogenetics and DNA technology, All - Russian Research Institute of Sheep and Goat Breeding, branch of the FSBSI "North Caucasus FARC", Stavropol, Tel. (8652) 71-72-18, E-mail: immunogenetika@yandex.ru
