CC BY
83
форм в кормах и кормовых добавках. Погрешность Авторы благодарят заведующую лабораторией биометодики для селена и его неорганической формы в логически активных веществ Сибирского НИИ сельско-
диапазоне измерений от 0,05 до 80 мг/кг не превышает го хозяйства и торфа Россельхозакадемии кандидата
25 %, для органической формы селена в диапазоне от химических наук Л.В. Касимову за предоставленный
0,05 до 25 мг/кг - 22 %. «Энтеросорбент ЭТС-1».
Литература.
1. СанПиН 2.3.2.1078-01. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Санитарноэпидемиологические правила и нормативы
2. Ермаков В. В., Ковальский В. В. Биологическое значение селена. - М.: Наука, 1974. - 294 с.
3. Тутельян В.А., Княжев В.А., Хотимченко С.А. и др. Селен в организме человека: метаболизм, антиокидантные свойства, роль в канцерогенезе. - М. : Издательство РАМН, 2002. - 224 с.
4. Дерябина В. И., Захарова Э. А., Слепченко Г. Б. Вольтамперометрический контроль растительного сырья и БАД на содержание общего селена с использованием отгонки SeBr[4]//Хранение и перераб. сельхозсырья. - 2009. - № 8. - с. 47-49
5. Определение селена (4+) методом катодной инверсионной вольтамперометрии с применением ртутно-пленочного электрода, модифицированного медью / Зайцев Н. К., Осипова Е. А., Федулов Д. М., Еременко Е. А., Дедов А. Г. //Ж. анал. химии. - 2006. - Т. 61; № 1. - с. 85-91.
6. МУ 08-47/247, ФР.1.31.2011.09196. Зерно и продукты его переработки, силос из зеленых растений, корма, комбикорма, комбикормовое сырье и кормовые добавки. Инверсионно-вольтамперометрическая методика определения содержания железа, йода, кобальта, марганца, мышьяка, никеля, ртути и селена. - Томск.: Изд-во ТПУ, 2010. - 69 с.
7. МУ 08-47/305, ФР.1.31.2012.11866. Вода питьевая, природная и минеральная. Вольтамперометрический метод измерения массовых концентраций йода и селена.
8. Шевелева И.В., Холомейдик А.Н., ВойтА.В, Земнухова Л.А. Сорбенты на основе рисовой шелухи для удаления ионов Fe (III), Си (II), Сб (II), РЬ (II) из растворов. //Химия растительного сырья. - 2009. - №4. - С. 171-176.
VOLTAMMETRIC DETERMINATION OF FORM OF SELENIUM IN THE STERN USING NATURAL SORBENTS V.I. Deryabina, G.B. Slepchenko, Pham Cam Nhung, T.V. Lycheva, L.A. Malinovskaya
Summary. The aim of this research was to develop a new method of separation of selenium forms in natural sorbents and methods of quantitative chemical analysis of the total selenium content and its organic and inorganic forms in feed and feed additives by voltammetry. Researches on the choice of natural sorbent to the separation of organic and inorganic forms of selenium in model solutions carried out. As the absorption capacity sorbents are as follows: «Enterosorbent ECT-1» > «Polyphepan» > activated carbon. On the basis of experimental data for the separation of organic and inorganic selenium forms on the «Enterosorbent ECT-1,» operating conditions selected: exposure time 60 sec, pH 7, 0.3 g sorbent mass, and a method for preparing samples for determination of total selenium content and its organic and inorganic forms by voltammetry method. To determine the total selenium content the acid mineralization was used. For the separation of organic and inorganic selenium forms in analyzing solution the batch of the sorbent was injected, and the organic selenium forms quantitatively adsorbed on the «Enterosorbent EST -1», and the inorganic forms remained in the solution. After filtering of the mixture, a concentration of inorganic selenium forms was determined in the filtrate by the VA, and the residue was subjected to ultrasonic treatment in 1 mol/dm3 sulfuric acid solution, and after centrifugation a concentration of organic selenium forms in the supernatant was determined. On the basis of the proposed method of sample preparation, the voltammetric method for measuring mass concentrations of selenium and its inorganic and organic forms was developed. Validation of this method carried out by the «entered-found» method and by a comparison with the method proposed by the other methods. Error of this method for selenium and its inorganic form does not exceed 25 % in the range from 0.05 to 80 mg / kg and for the organic forms of selenium - 22% in the range of 0.05 to 25 mg / kg.
Key words: voltammetry, method, sample preparation, sorption, organic and inorganic selenium forms, feed, feed additives.
УДК636.012: 575.174.015.3
ХАРАКТЕРИСТИКА АЛЛЕЛОФОНДА ОВЕЦ ЮГА РОССИИ*
Е.А. ГЛАДЫРЬ, кандидат биологических наук, зав. лабораторией
Н.А. ЗИНОВЬЕВА, академик РАСХН, директор ВИЖ Россельхозакадемии С.С. БУРЫЛОВА, аспирант
М.И. СЕЛИОНОВА, доктор биологических наук, зав. кафедрой
Ставропольский ГАУ
Л.Г. МОИСЕЙКИНА, доктор биологических наук, профессор
Калмыцкий ГУ
\Л.К. ЭРНСТ1 академик РАСХН
Г. БРЕМ, доктор ветеринарных наук, иностранный член РАСХН, профессор
Венский ветеринарно-медицинский университет E-mail: elenagladyr@mail.ru
Резюме. С использованием 11 микросателлитных маркеров (HSC, OarAE119, OarCP49, OarFCB11, MAF214, MCM42, TGLA53, MAF65, McM527, INRA49, OarFCB20) в качестве инструмента анализа аллелофонда дана популяционно-генетическая характеристика трех тонкорунных пород овец юга России (ставропольская, грозненская, советский меринос). Исследуемые породыхарактеризуются высоким уровнем генетического разнообразия. Среднее число аллелей на локус микросателлитов составляет 10,4...12,3, при этом эффективное число аллелей на
* Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, шифр 2012-1.4-12-000-1001-
010. В проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВИЖ Россельхозакадемии.
локус варьирует в зависимости от породы от 5,4 в грозненской до 7,7 в ставропольской. Идентифицировано 76 приватных аллелей, в том числе 36 в ставропольской породе, 17 - в грозненской и 23 - в породе советский меринос. Выявлено пять породоспецифичных приватных аллелей: четыре в ставропольской породе - 122 локуса Oar FCB11, 225 локуса MAF214, 138 и 149 локуса TGLA53 и один в породе советский меринос - 87локуса OarCP49. Наблюдаемая степень гетерозиготности варьировала от 0,510±0,041 в ставропольской породе до 0,678±0,035 в породе советский меринос. Установлен различный вклад отдельных локусов в степень гетерозиготности, которая варьировала от
0,281 в локусе HSC до 0,967в локусе TGLA53. Во всех исследованных популяциях отмечен дефицит гетерозигот и положительный Fis - от 0,148 до 0,401. На основе значений Fst показано, что 95,7% всего разнообразия обусловлено внутрипородными различиями и только 4,3 % приходится на межпородные. Выявлена 100,0 %-ная степень консолидированности изучаемых пород овец. Структура генетического дерева согласуется с историческими аспектами создания пород.
Ключевые слова: микросателлиты (МС), генетическое разнообразие, аллелофонд, овцы.
Современное поголовье овец России насчитывает чуть более 20 млн гол. [1]. Калмыкия по их численности (около 2,5 млн гол.) сегодня занимает второе место в Российской Федерации, а по основным продуктивным и хозяйственно-экономическим показателям находится на лидирующих позициях среди субъектов Южного федерального округа и России. Овцеводство региона представлено семью основными породами, которые по численности имеют следующую структуру: грозненская - 63,6 %, ставропольская - 15,5, советский меринос - 8,2, кавказская - 4,3, каракульская - 5,8, эдильбаевская — 1,3, калмыцкая — 1,2 % [2].
Изучение генетического полиморфизма различных пород сельскохозяйственных животных - актуальное направление современной популяционной генетики. В России ряд научных коллективов выполняют работы по молекулярно-генетической характеристике пород овец с использованием ДНК-маркеров разных типов [3...6].
Цель нашей работы - оценка биоразнообразия в овцеводстве на основе молекулярно-генетического мониторинга микросателлитов (МС) трех основных тонкорунных пород овец юга России.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили на базе НОЦ по молекулярной генетике и биотехнологии животных ВИЖ Россельхозакадемии. Материалом для исследований служили образцы ушных выщипов 92 гол. овец трех тонкорунных пород юга России (республика Калмыкия): ставропольской (СТАВР, n=26), грозненской (ГРОЗН, n=31) и советский меринос (СОВ_М, n=35). Выделение ДНК проводили с помощью набора реагентов DIAtomTM DNA Prep100, анализ ДНК и постановку ПЦР - согласно «Методическим рекомендациям ...» [7] с использованием методических разработок Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖ Россельхозакадемии. Набор маркеров для анализа состоял из 11 МС: HSC, OarAE119, OarCP49, OarFCB11, MAF214, MCM42, TGLA53, MAF65, McM527, INRA49, OarFCB20. Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам [8] с использованием программного обеспечения GenAlEx v 6.4 [9] и PAST в соответствии с методическими подходами, разработанными ранее [10.13].
Результаты и обсуждение. Анализ общего числа аллелей на локус и числа эффективных аллелей на локус МС показал, что исследуемые породы характеризовались высоким уровнем генетического разнообразия. Так, в среднее на локус микросателлитов приходится
10,4.12,3 аллелей, при этом их эффективное число варьирует от 5,4 в грозненской до 7,7 в ставропольской
Таблица. 1. Среднее число аллелей и число эффективных аллелей на локус МС в исследуемых породах овец юга России
Среднее число 0 § >3 Ф $ 1
Популяция n (11 локусов)
Na I Ne
СТАВР 26 11,9±1,2 7,7±0,9
ГРОЗН З1 10,4±0,8 5,4±0,5
СОВ М З5 12,3±0,9 6,8±0,6
породе (табл. 1).
В аспекте отдельных локусов (рис. 1) у исследованных популяций наименьшее генетическое разнообразие отмечено по локусу OarFCB11 - 6 аллелей, а наибольшим оно было в локусе MAF214 - 19 аллелей. Анализ приватных аллелей показал их наличие во всех исследованных популяциях. Всего было идентифицировано 76 приватных аллелей, в том числе 36 в ставропольской породе, 17 - в грозненской и 23 - в породе советский меринос.
Следует отметить, что все выявленные приватные аллели встречались с относительно низкой частотой - от 1,6 до 7,1 % за исключением пяти аллелей: 122 локуса Oar FCB11, 225 локуса MAF214, 138 и 149 локуса TGLA53, выявленных в ставропольской породе, 87 локуса OarСР49 в породе советский меринос, которые встречались с частотой 9,6, 11,9, 10,7, 14,3 и 11,8 % соответственно. Их можно рассматривать в качестве специфичных для названных пород овец.
Для оценки генетической изменчивости в изучаемых породах овец мы расчитали наблюдаемую и ожидаемую степень гетерозиготности, которая служит отражением мутационных процессов, различных типов отбора, дрейфа генов, неслучайных спариваний и других факторов динамики популяций [14].
Во всех исследованных популяциях отмечен дефицит гетерозигот (табл. 2). Наименьшим он был у овец грозненской породы (11,9 %). Значительно больший дефицит гетерозигот отмечен в ставропольской породе (34,1 %) и породе советский меринос (29,3 %). На дефицит гетерозигот так же указывают положительные значения индекса фиксации Fis - от 0,148 до 0,401.
Анализ показал различный вклад локусов в средний уровень гетерозиготности изучаемых пород овец. Наблюдаемая ее степень варьировала от 0,281 в локусе HSC в породе советский меринос до 0,967 в локусе TGLA53 в грозненской породе.
Дефицит гетерозигот в исследованных породах овец также различался в зависимости от локуса. На-
Рис. 1. Число аллелей в локусах микросателлитов в исследованных породах овец: ось Х - локус микросателлитов; ось Y - число аллелей: □ - СТАВР, □ - ГРОЗН, □ - СОВ_М.
Таблица 2. Фактическая и ожидаемая степени гетерозиготности у иссле дованных пород овец
Степень гете розиготности Разница (Ho-He)
Порода фактическая (Ho) ожидаемая (He) Fis
СТАВР ГРОЗН СОВ М 0,510±0,041 0,678±0,035 0,546±0,045 0,851±0,017 0,797±0,021 0,839±0,017 -0,341 -0,119 -0,293 0,401±0,047 0,148±0,037 0,344±0,057
пример, в ставропольской породе и породе советский меринос он наблюдался во всех 11 локусах микросателлитов и варьировал соответственно от 14,9 % в локусе ОагСР49 до 52,3 % в локусе НБС и от 8,3 % в локусе МСМ42 до 62,4 % в локусе НБС. В грозненской
Рис. 2. Дефицит (избыток) гетерозигот в локусах МС: ось Х - локус МС; ось Y - дефицит (-) / избыток (+) гетерозигот; О - СТАВР, □ - ГРОЗН, д - СОВ_М.
Дисган ция
Рис. 3. Дендограмма филогенетического родства изученных пород овец построенная по Ые1 М. [15] методом попарного внутригруппового невзвешенного среднего (иРвМА) на основании микросателлитного анализа по 11 локусам микросателлитов.
породе дефицит отмечен в десяти из 11 исследованных локусов - от 0,7 % в локусе MAF65 до 26,3 % в локусе OarAE119 (рис. 2).
Расчет индекса фиксации Fst показал, что 95,7 % всего генетического разнообразия в изучаемых породах обусловлено внутри-породными различиями и только 4,3 % приходится на межпородные. При этом наименьшие межпородные различия отмечены для локуса HSC (3,0 %), а самые высокие - для локуса McM527 (6,0 %).
Результаты анализа, основанного на генотипе каждой особи по МС, а также на числе и частотах встречаемости аллелей, общих для каждой из групп (по Paetkau), показали высокую степень генетической консолидированности изучаемых пород овец: 100,0 % животных каждой из пород были отнесены к собственной популяции.
Историческая общность создания овец грозненской породы и советского мериноса, несущих в своем генотипе кровь мериносов мазаевского и новокавказского типов, а также грубошерстных овец юга России нашла свое отражение в формировании ветвей генетического древа (рис. 3), что выразилось в их наибольшей близости (0,256). Ставропольская порода отличалась более высокой степенью дифференциации и была приблизительно равноудалена от пород советский меринос (0,496) и грозненская (0,459).
Выводы. Таким образом, изученные породы характеризуются высоким уровнем генетического разнообразия. Среднее число аллелей на локус микросателлитов составляет 10,4.12,3, их эффективное число варьирует от 5,4 в грозненской до 7,7 в ставропольской породе. Выявлено 76 приватных аллелей, в том числе 36 в ставропольской породе, 17 - в грозненской и 23 - в породе советский меринос и пять породоспецифичных приватных аллелей: четыре в ставропольской породе - 122 локуса Oar FCB11, 225 локуса MAF214, 138 и 149 локуса TGLA53 и один в породе советский меринос - 87 локуса OarCP49. Степень гетерозиготности варьировала от 0,510±0,041 в ставропольской породе до 0,678±0,035 в породе советский меринос и от 0,281 в локусе HSC до 0,967 в локусе TGLA53. Во всех исследованных популяциях отмечен дефицит гетерозигот и положительный Fis (от 0,148 до 0,401), 95,7 % всего разнообразия обусловлено внутрипородными различиями и только
4,3 % приходится на межпородные. Степень консо-лидированности изучаемых пород овец составляет 100 %. Структура генетического древа согласуется с историческими аспектами создания пород.
Литература.
1. Интернет ресурс. Режим доступа: http://www.tuvaonline.ru/2012/08/13/pogolove-ovec-i-koz-v-2011 -доби-у-говвИ-uvelichilos-na-51.html /(Дата обращения 13.08.2012).
2. Интернет ресурс. Режим доступа: http://agroobzor.ru/ovcy/a-120.html (Дата обращения 08.11.2012).
3. Зиновьева Н.А., Гладырь Е.А., Эрнст Л.К., Брем Т. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных. - ВИЖ, 2002. - с. 53-54.
4. Яковлев А.Ф., Н.В. Дементьева Использование метода фингерпринтинга ДНК для изучения генетической дивергенции в популяциях сельскохозяйственных животных/Соавт.: и др. // Вестн. РАСХН. - 2003. - № 1. - С. 79-80.
5. Озеров М.Ю., Тапио М., Марзанов Н.С., Насибов М.Г., Шайдуллин И.Н., Кантанен Ю. Микросателлитный анализ эволюционно-генетических связей у различных пород овец // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. -2006. - № 2. - С. 30-33.
6. Глазко В.И., Феофилов А.В., Столповский Ю.А., Глазко Т.Т. Структурно-функциональные особенности микросателлитов в геномах крупного рогатого скота и овец // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2011. - № 1. -С. 41-44.
7. Зиновьева Н.А., ПоповА.Н., ЭрнстЛ.К., Марзанов Н.С., Бочкарев В.В., Стрекозов Н.И., Брем Г. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. - Дубровицы: ВИЖ, 1998. - 47 с.
8. Вейр Б. Анализ генетических данных. - М.: Мир, 1995. - 319 с.
9. Peakall, R., Smouse P.E. GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. //. Molecular Ecology Notes, 2006, 6, 288-295. V. GENALEX 6.4 UTR: http://appliedpopulationgenetics2010.wikispaces.com/file/view/ GENALEX6.4_documntation.pdf, (дата обращения 19.12.2010).
10. Зиновьева, Н.А., Гладырь Е.А. Генетическая экспертиза сельскохозяйственных животных: применение тест-систем на основе микросателлитов //Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 9. - с. 19-20.
11. Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Брем Г. Характеристика генофонда и выявление генеалогических связей между породами овец России с использованием ДНК-микросателлитов // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2004. - № 2. - С. 26.
12. Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., ЭрнстЛ.К., Брем Г. Генотипирование российских пород овец по микросателлитным маркерам и PRNP (гену прионового белка) // Ветеринарная патология. - 2005. - № 1. - С. 26-32.
13. Гладырь Е.А., Селионова М.И., Зиновьева Н.А. Характеристика генофонда и выявление генеалогических связей между породами овец с использованием групп крови и ДНК-микросателлитов // Овцы, козы, шерстяное дело. - 2007. - № 4. -С. 19-24.
14. Левонтин Р. Генетические основы эволюции. - М.: Мир, 1978. - 352 С.
15. Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals // Genetics. - 1978. -89: 583-590.
THE ALLELE POOL CHARACTERISTICS OF THE SHEEP BREEDS FROM THE SOUTH OF RUSSIA E.A. Gladyr, N.A. Zinovieva, S.S. Burylova, M.I. Selionova, L.G. Moiseykina, L.K. Ernst, G. Brem
Summary. Using 11 microsatellite markers (HSC, OarAE119, OarCP49, OarFCB11, MAF214, MCM42, TGLA53, MAF65, McM527, INRA49, OarFCB20) as the instrument the allele pool characteristic of three fine-wooled sheep breeds of the South of Russia (Stav-ropolskaja, Groznenskaja, Soviet Merinos) was done. The studied sheep breeds were characterized by high degree of genetic diversity: the average number of alleles per microsatellite loci was 10.4-12.3. The average number of effective allele per loci is varied of 5.4 in Groznenskaja breed to 7.7 in Stavropolskaja breed. In total seventy six privet alleles were identified including 36 alleles in Stavropolskaja breed, 17 - in Groznenskaja breed and 23 - in Soviet Merinos. Five breed specific alleles were identified including four in Stavropolskaja breed - 122 allele of Oar FCB11 loci, 225 allele of MAF214 loci, 138 and 149 alleles of TGLA53 loci and one in Soviet Merinos - 87 allele of Oa^P49 loci. The observed heterozygote degree is varied of 0.510±0.041 in Stavropolskaja breed to 0.678±0.035 in Soviet Merinos. The different contribution of loci into heterozygote degree was observed which varied of 0.281 for HSC loci to 0.967 for TGLA53 loci. The heterozygote deficiency and positive Fis value (from 0.148 to 0.401) were detected in all breeds analyzed. The calculation of Fst value showed that 95.7 per cent of diversity was due to within breed differences and only 4.3 per cent was due to intra breed differences. The analysis of genetic consolidation degree showed that 100 per cent animals were assigned to own population. The structure of phylogenetic tree was in accordance with the historical aspects of breeds’ origins.
Key words: sheep, microsatellites, genetic diversity, allele pool.
УДК 575.174.015.3:636.082.2
РОЛЬ ДНК-ДИАГНОСТИКИ В КОНТРОЛЕ И ЭЛИМИНАЦИИ РЕЦЕССИВНЫХ НАСЛЕДСТВЕННЫХ АНОМАЛИЙ У СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ*
НЛ. ЗИНОВЬЕВA, академик РAСXН, директор E.A. ГЛAДЫРЬ, кандидат биологических наук, зав. лабораторией
О.В. KОСTЮНИНA, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
В.Р. XAРЗИНОВA, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
М.В. ПОКРОВС^Я, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник ВИЖ Россельхозакадемии
Н.Г. ДРУШЛЯК, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Орловский ^У
Я.A. ^БИЦ^Я, младший научный сотрудник
Тюменская ГСXA
E-mail: n_zinovieva@mail.ru
Резюме. Проанализирована база данных наследственных аномалий OMIA. Из 79 наследственных дефектов крупно-
го рогатого скота и 18 наследственных дефектов свиней, охарактеризованных на молекулярном уровне, определены селекционно-значимые генетические аномалии, требующие проведения мониторинга в популяциях племенного скота России. Приведены результаты многолетних исследований (2005-2012 гг.) по идентификации мутантных аллелей в генах SLC35A3, ^В2, ЕХІ и SLC39A4 крупного рогатого скота, обусловливающих соответственно такие наследственные заболевания, как комплексный порок позвоночника, дефицит лейкоцитарной адгезии, дефицит фактора свертывания крови XI и дефицит цинка, а также в генах RYR1, PRKAG3 и SPEF2 свиней, обусловливающих злокачественную гипертермию, синдром «кислое мясо» и ISTS-синдром. При проведении исследований использовали собственные молекулярно-генетические тест-системы, основанные на методах ПЦР, ПЦР-ПДРФ анализа и пиросеквенирования. Определены частоты встречаемости животных - носителей мутантных аллелей названных генов в популяциях крупного рогатого скота голштинской и чернопестрой пород и свиней различных пород в организациях по племенному животноводству России, которые составили для SLC35A3 - 2,06 %, ^В2 - 1,81 %, ЕХІ - 0,00 %, SLC39A4 -0,00 %, RYR1 - 2,11 %, PRKAG3 - 0,00 % и SPEF2 - 1,17 %.
*Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, шифр 2012-1.4-12-000-1001-010 и 2012-1.4-12-000-1016-008. В проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.
