CC BY
22
Оригинальная статья
Особенности метаболомики стероидов по данным газовой хромато-масс-спектрометрии у больных адренокортикальным раком и с инциденталомой надпочечников при врожденной дисфункции коры надпочечников
Шафигуллина З.Р.1 • Великанова Л.И.1 • Ворохобина Н.В.1 • Малеваная Е.В.1 • Стрельникова Е.Г.1 • Бохян В.Ю.2 • Бритвин Т.А.3 • Стилиди И.С.2
Обоснование. Установлено, что длительные эпизоды декомпенсации врожденной дисфункции коры надпочечников (ВДКН) приводят к появлению вторичных новообразований в надпочечниках. У пациентов с дефектом 21-гидроксилазы частота выявления инциден-талом надпочечников составляет от 11 до 82%. У больных адренокортикальным раком (АКР) по данным газовой хромато-масс-спектроме-трии (ГХ-МС) установлена повышенная продукция предшественников стероидных гормонов вследствие снижения активности ферментов адреналового стероидогенеза, главным образом, 21-гидроксилазы и 11р-гидроксилазы. Представляется актуальным исследование особенностей метаболизма стероидов методом ГХ-МС у больных АКР и у пациентов с ВДКН вследствие дефекта 21 -гидроксилазы с ИН. Цель - установить общие нарушения метаболизма стероидов и дифференциально-диагностические биомаркеры больных АКР и с ВДКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы с ИН методом ГХ-МС.
Материал и методы. Обследован 41 пациент с новообразованиями коры надпочечников в возрасте от 18 до 65 лет без клинических и лабораторных признаков эндогенного гипер-кортизолизма: 23 больных АКР без метастазов и 18 пациентов с ВДКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы. Группу контроля составили
26 здоровых доноров в возрасте от 20 до 59 лет. Методом ГХ-МС исследовали стероидные профили мочи на газовом хромато-масс-спектро-метре БЫт^и 6СМ$-ОР2020. Результаты. У больных АКР установлено повышение экскреции с мочой тетрагидро-11-де-зоксикортизола, дегидроэпиандростерона, андростендиола-17р, этиохоланолона, прегнан-диола и зр,16,20-прегнентриола (3Р,16,20^Р3), снижение соотношения 3а,16,20^Р3/зр,16,20-dP3 в сравнении с показателями пациентов с ВДКН с дефицитом 21-гидроксилазы; получены признаки уменьшения активности 21-ги-дроксилазы, 11р-гидроксилазы, 5а-редуктазы и 11р-гидроксистероиддегидрогеназы 2-го типа по сравнению со здоровыми донорами. Для больных ВДКН с дефектом 21-гидроксилазы характерно увеличение в сравнении с больными АКР экскреции с мочой 11-оксо-прегнантри-ола (11-охо-Р3), 21-дезокси-тетрагидрокорти-зола и уменьшение соотношения (5р-ТНР+5а-ТНР+ТИЕ)/11-охо-Р3 менее 9,0, определение 11-охо^Р3, признаки увеличения активности 5а-редуктазы и уменьшения активности 11 р-ги-дроксистероиддегидрогеназы 1-го типа. У больных АКР и ВДКН с дефектом 21-гидроксилазы выявлены общие нарушения в метаболизме стероидов: признаки снижения активности 21-ги-дроксилазы, 3р-гидроксистероиддегидроге-назы и 11р-гидроксилазы, отсутствие различий
экскреции с мочой ряда биомаркеров АКР (ан-дрогенов, прегнандиола, 5-епе-прегненов). Заключение. Исследование экскреции с мочой андрогенов, прогестагенов и глюкокортикои-дов методом ГХ-МС дало возможность установить общие нарушения в метаболизме стероидов у больных АКР и ВДКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы, что подтверждает роль нарушений стероидогенеза в процессе формирования опухолей коры надпочечников.
Ключевые слова: адренокортикальный рак, врожденная дисфункция коры надпочечников, дефект 21-гидроксилазы, газовая хрома-то-масс-спектрометрия, метаболомика стероидов
Для цитирования: Шафигуллина ЗР, Великанова ЛИ, Ворохобина НВ, Малеваная ЕВ, Стрельникова ЕГ, Бохян ВЮ, Бритвин ТА, Стилиди ИС. Особенности метаболомики стероидов по данным газовой хромато-масс-спектрометрии у больных адренокортикальным раком и с инциденталомой надпочечников при врожденной дисфункции коры надпочечников. Альманах клинической медицины. 2022;50(1):38-46. ао1: 10.18786/2072-05052022-50-007.
Поступила 16.12.2021; доработана 17.02.2022; принята к публикации 18.03.2022; опубликована онлайн 12.04.2022
Причиной развития опухолей коры надпочечников может быть врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) - генетическое заболевание, чаще всего обусловленное дефицитом 21-гидроксилазы, вызванным мутациями гена CYP21A2, и влияющее на биосинтез кортизола. Ряд авторов показали, что длительные (не менее 5 лет) эпизоды декомпенсации ВДКН с дефицитом 21-гидроксилазы приводят к появлению вторичных новообразований в надпочечниках у 29% больных [1]. Как установили в 2016 г. на основании анализа 36 публикаций H. Falhammar и D.J. Torpy, у пациентов с новообразованиями в надпочечниках ВДКН обнаруживается в 5,9% случаев при проведении биохимического скрининга и в 0,8% при генетическом анализе. У пациентов с ВДКН частота выявления инциденталом надпочечников (ИН) варьирует от 11 до 82%; кроме того, узловые образования надпочечников обнаруживаются у 45% носителей мутантного гена ВДКН [2].
В обзоре 2021 г. H.L. Claahsen-van der Grinten и соавт. констатируют появление в этой области новой разработки - диагностики с использованием хроматографических методов в сочетании со стероидным профилированием, что дает более полное понимание нарушений путей стероидогенеза и способствует улучшению методов генотипирования [3]. Комплексный 24-часовой анализ стероидного метаболома методом газовой хромато-масс-спек-трометрии (ГХ-МС) - самый информативный тест, позволяющий обнаружить различные нарушения в метаболизме андрогенов, прогестагенов и глюко-кортикоидов, а также установить новые пути стеро-идогенеза [4].
Частота встречаемости адренокортикального рака (АКР) среди больных с ИН составляет от 1,2 до 12%. Некоторые авторы отмечают, что больные АКР, не имеющие клинических признаков избыточной секреции стероидов, могут иметь повышенную продукцию предшественников стероидов вследствие ингибирования ферментов адреналового сте-роидогенеза [5-8]. Ранее мы установили признаки недостаточности 21-гидроксилазы и Hß-гидрокси-лазы у 79,3% больных АКР по данным ГХ-МС [8]. Представляется актуальным сравнение стероидных профилей мочи (СПМ) на основе метода ГХ-МС у больных с ИН при ВДКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы и у больных АКР для выявлений различий и общих нарушений в метаболомике стероидов.
Материал и методы
Обследован 41 пациент с новообразованиями коры надпочечников в возрасте от 18 до 65 лет
Шафигуллина Зульфия
Ривгатовна - канд. мед.
наук, доцент кафедры
эндокринологии
им. акад. В.Г. Баранова1;
ORCID: https://orcid.
org/0000-0001-8292-8504
Великанова Людмила Иосифовна - д-р
биол. наук, профессор, заведующая научно-исследовательской лабораторией хроматографии1; ORCID: https://orcid.org/0000-
0002-9352-4035
* 191015, г. Санкт-
Петербург, ул. Кирочная,
41, Российская
Федерация.
Тел.: +7 (921) 379 32 95.
E-mail: velikanova46
@gmail.com
Ворохобина Наталья Владимировна - д-р
мед. наук, профессор, заведующая кафедрой эндокринологии им. акад. В.Г. Баранова1; ORCID: https://orcid. org/0000-0002-9574-105X Малеваная Екатерина Валерьевна - канд. хим. наук, ст. науч. сотр. научно-исследовательской лаборатории хроматографии1; ORCID: https://orcid.org/0000-
0003-0880-0814
Стрельникова Елена Геннадьевна -
канд. хим. наук, ст.
науч. сотр. научно-
исследовательской
лаборатории
хроматографии1; ORCID:
https://orcid.org/0000-
0002-1208-8092
1 ФГБОУ ВО «СевероЗападный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Минздрава России; 191015, г. Санкт-Петербург, ул. Кирочная, 41, Российская Федерация
без клинических и лабораторных признаков эндогенного гиперкортизолизма: 23 пациента с АКР до лечения в возрасте 46 (39-55) лет, 18 пациентов с ВДКН в возрасте 27 (21-46) лет. Группу контроля составили 26 здоровых доноров в возрасте 33 (27-40) лет. Все пациенты проходили обследование и лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России и ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Все обследованные пациенты подписали информированное согласие.
По данным компьютерной томографии размер новообразования коры надпочечника у больных АКР составил 85 (70-120) мм, у больных ВДКН - 31 (8,0-38) мм. Диагноз ВДКН подтвержден молекулярно-генетическим исследованием и уровнем 17-ОН-прогестерона в сыворотке крови, который составил 17,8 (8,720,4) нг/мл по данным иммуноферментного анализа. Три пациента с ВДКН были прооперированы, патоморфологический диагноз - аденома коры надпочечников. Диагноз АКР подтвержден патоморфологическим исследованием удаленной опухоли (более 3 баллов по шкале L.M. Weiss). Уровень кортизола в сыворотке крови у всех обследованных больных составил менее 50 нмоль/л, что было определено методом иммунохемилюминесцентного анализа.
Методом ГХ-МС исследовали СПМ на газовом хромато-масс-спектрометре Shimadzu GCMS-QP2020 с использованием жидкостной экстракции [9]. Все гормональные исследования проводили в научно-исследовательской лаборатории хроматографии ФГБОУ ВО «СЗГМУ им. И.И. Мечникова» Минздрава России. На проведение данного обсервационного исследования было получено разрешение независимого комитета по этике.
Статистическую обработку данных выполняли с использованием программного пакета Statistica for Windows (версия 10). Основные количественные характеристики исследованных показателей больных и здоровых доноров представлены в виде медианы (Me), 25-го и 75-го перцентилей (Q25-Q75). Для сравнения результатов использовали непараметрический критерий Манна - Уитни. Статистически значимым считали критерий р < 0,017 на основании поправки Бонферрони. Чувствительность и специфичность рассчитали по программе Medcak с использованием метода ROC-кривых (англ. receiver operating characteristic curve) и площади под ними (англ. area under the curve, AUC).
Результаты
На основании исследования СПМ методом ГХ-МС у больных АКР и ВДКН получены различия метаболомики андрогенов, глюкокортикоидов и их предшественников, а также общие нарушения адреналового стероидогенеза.
У всех обследованных больных в сравнении с группой контроля установлено увеличение экскреции с мочой андрогенов: дегидроэпиандросте-рона (БИБА) и его метаболитов - андростендио-ла-17в 0А2-17Р), 16-охо-аА2, андростентриола (<!А3), метаболитов андростендиона - андросте-рона (Ап), этиохоланолона (Б1), 11-ОИ-Ап, 11-ОИ-Б1 и 11-охо-Е1 (табл. 1). У больных АКР в сравнении со здоровыми донорами, кроме перечисленных андрогенов, отмечено повышение экскреции с мочой метаболитов БИБА: 16-ОН-БИБА-3а и 16-ОН-БИБА-3в. Для больных АКР характерно значительное увеличение экскреции с мочой БИБА (р = 0,0004), аА2-17^ (р = 0,001), аА3 (р = 0,016) и Е1 (р = 0,011) в сравнении с показателями пациентов с ВДКН (см. табл. 1).
У больных АКР и ВДКН в сравнении с группой контроля получено повышение экскреции с мочой тетрагидрометаболитов глюкокортикоидов: тетрагидро-11-дезоксикортизола (ТШ) и 5а-те-трагидрокортикостерона (5а-ТИВ). У больных АКР в сравнении со здоровыми донорами увеличена экскреция с мочой 5^-ТНВ и 5^-тетраги-дрокортизола (5^-ТНБ) (см. табл. 1). Экскреция с мочой ТШ более 715 мкг/сут с чувствительностью 88,2% и специфичностью 84,6% (АиС = 0,91, р < 0,0001), 5^-ТНВ (р = 0,0007) и 5^-ТНБ (р = 0,004) была выше у больных АКР в сравнении с показателями пациентов с ВДКН (см. табл. 1). Следует отметить, что у 73,9% больных АКР установлено увеличение экскреции с мочой основных биомаркеров АКР - ТШ, БИБА и его метаболитов. Для большинства больных ВДКН (78,9%) характерно повышение экскреции с мочой андрогенов при экскреции с мочой ТШ, находящегося в области референсных значений.
У больных ВДКН установлено 2 признака увеличения активности 5а-редуктазы: повышение соотношений 5а-ТИВ/5^-ТИВ и 11-ОН-Ап/11-ОИ-Б1. У пациентов с АКР получены 2 признака увеличения активности 5^-редуктазы: снижение соотношений 5а-ТИБ/5^-ТИБ и Ап/ Б1 в сравнении с группой контроля, что приводит к повышению экскреции с мочой 5^-ТИБ и этиохоланолона (табл. 2). Следует отметить, что 4 признака активности 5а-редуктазы у больных АКР были ниже, чем у пациентов с ВДКН (р < 0,005) (см. табл. 2).
Бохян Ваган Юрикович - д-р мед. наук, заведующий хирургическим отделением № 5 (эндокринной онкологии)2; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9066-5190 Бритвин Тимур Альбертович - д-р мед. наук, заведующий отделом хирургии3; ORCID: https://orcid. org/0000-0001-6160-1342. E-mail: t.britvin @gmail.com Стилиди Иван Сократович - д-р мед. наук, профессор, академик РАН, директор2; ORCID: https:// orcid.org/0000-0002-0493-1166. E-mail: ronc @list.ru
2 ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 23, Российская Федерация
3 ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского»; 129110,
г. Москва, ул. Щепкина, 61/2, Российская Федерация
Признак уменьшения активности 11^-гидрок-систероиддегидрогеназы (11(3-ГСДГ) 1-го типа (снижение соотношения ТНВ/ТНА) в сравнении со здоровыми донорами получен у больных ВДКН. Повышение соотношения 5^-ТНБ/ТИБ у больных АКР указывает на снижение активности 11р-ГСДГ 2-го типа, что приводит к увеличению ТНБ, метаболита кортизола, наиболее активного глюкокортикоида (см. табл. 1 и 2).
У больных АКР и ВДКН в сравнении с группой контроля выявлен признак уменьшения активности 11^-гидроксилазы - снижение соотношения (5(3-ТНБ+5а-ТИБ+ТИБ)/ТШ (см. табл. 2). Дополнительный признак уменьшения активности 11в-гидроксилазы получен у больных АКР -увеличение экскреции с мочой гексагидро-11-де-зоксикортизола (НШ) в сравнении с группой контроля (см. табл. 1). У больных АКР соотношение (5(3-ТНБ+5а-ТИБ+ТИБ)/ТШ менее 7,7 с чувствительностью 93,7% и специфичностью 71,5% (АиС = 0,83; р = 0,0001) было меньше, чем аналогичные показатели пациентов с ВДКН (см. табл. 1 и 2).
У больных АКР и пациентов с ВДКН в сравнении с группой контроля обнаружено увеличение экскреции с мочой основных биомаркеров дефекта 21-гидроксилазы: 17-ОН-прегнанолона (17-ОНР) и его метаболитов - прегнантриола (Р3) и 11-оксо-прегнентриола (11-охо-Р3). Кроме этих стероидов получено повышение экскреции с мочой прегнанолона (Р), 6-ОН-Р, прегнанди-ола (Р2), 5-епе-прегненов: прегнендиола (<!Р2), 3а,17,20-прегнентриола (<1Р3) и 3а,16,20-аР3 (см. табл. 1). У больных ВДКН установлено увеличение экскреции с мочой 16-ОН-Р2 и 11-ОН-Р3 по сравнению со здоровыми донорами и больными АКР (р = 0,008 и р = 0,011 соответственно). У больных АКР в сравнении с показателями пациентов с ВДКН получено повышение экскреции с мочой аР2 (р = 0,012) (см. табл. 1).
У больных ВДКН установлено увеличение в сравнении с АКР экскреции с мочой 11-охо-Р3 и 21-аеоху-ТИБ, снижение соотношений (5в-ТНБ+5а-ТИБ+ТИБ)/11-охо-Р3 и (5(3-ТНБ+5а-ТИБ+ТИБ)/Р3 (см. табл. 1 и 2). Экскреция с мочой 11-охо-Р3 более 440 мкг/сут с чувствительностью 85,7% и специфичностью 90% (АиС = 0,95; р < 0,0001), 21-аеоху-ТИБ более 181 мкг/сут с чувствительностью 100% и специфичностью 80% (АиС = 088; р = 0,002), снижение соотношений (5в-ТНБ+5а-ТИБ+ТИБ)/11-охо-Р3 менее 9,0 с чувствительностью 93% и специфичностью 100% (АиС = 0,98; р < 0,0001) и (5р-ТНБ+5а-ТИБ+ТИБ)/ Р3 подтверждают наличие дефекта фермента
Таблица 1. Показатели экскреции стероидов с мочой, полученные методом газовой хромато-масс-спектрометрии, у больных адренокортикальным раком и врожденной дисфункцией коры надпочечников вследствие дефекта 21-гидроксилазы
Стероиды, Ме (Q25-Q75), мкг/сут
Группа контроля (n = 26)
Пациенты с адренокортикальным Пациенты с ВДКН раком (n = 23) с дефектом 21-гидроксилазы (n = 18)
Андрогены Андростерон (An)
898 (637-1162)
1241 (663-4076) p = 0,009
1819 (1085-4158) p = 0,0006
Этиохоланолон (Et)
758 (464-1231)
2159 (1377-6445)* p < 0,0001
1838 (734-2761) p = 0,014
Андростендиол-^ß (dA2-17ß)
100 (72-117)
1233 (670-2292)* p < 0,0001
305 (144-790) p = 0,008
Дегидроэпиандростерон (DHEA)
250(69-391)
5570 (1547-27355)** p < 0,0001
522 (295-2004) p = 0,004
16-OH-DHEA-3a
155 (87-203)
1471 (513-5517)* p = 0,004
199 (93-425) p = 0,29
16-OH-DHEA-3ß Андростентриол (dA3)
185 (112-417)
254 (168-489)
1056 (718-1487) p = 0,0002
1630 (874-4462)* p < 0,0001
823 (292-1997) p = 0,022
625 (303-1154) p = 0,009
16-охо^2
25 (18-53)
596 (183-1943) p = 0,0004
122 (71-274) p = 0,015
11-oxo-Et
190 (150-272)
344 (252-640) p = 0,009
498 (317-1911) p = 0,0001
11-OH-An
434 (331-694)
1241 (563-2846) p = 0,002
1818 (1224-7705) p < 0,0001
11-OH-Et
253 (210-300)
702 (464-1983) p = 0,0007
559 (334-936) p = 0,004
Прогестагены Прегнанолон
25 (20-52)
389 (173-527) p = 0,002
449 (121-1145) p = 0,0009
6-гидроксипрегнанолон (6-ОНР)
13 (11-16)
111 (97-343) p = 0,016
307 (177-434) p = 0,0009
16-гидроксипрегнанолон (16-ОНР)
Не обнаружен
48 (19-76)*
490 (185-2298)
17-гидроксипрегнанолон (17-ОНР)
182 (55-235)
1112 (500-1363) p < 0,0001
3140 (381-7903) p < 0,0001
Прегнандиол (Р2)
591 (323-802)
2805 (1100-4754) p < 0,0001
2660 (1704-4508) p < 0,0001
16-гидроксипрегнандиол (16-ОНР2)
60 (48-78)
240 (107-263)* p = 0,075
749 (318-2010) p = 0,003
Прегнантриол (Р3)
448 (375-612)
1981 (1086-4967) p < 0,0001
4013 (1722-11432) p < 0,0001
11-ОН-прегнантриол
50 (38-139)
68 (52-156)**
319 (268-616) p = 0,008
11-оксо-прегнантриол (11-охо-Р3)
21-дезокси-тетрагидрокортизол Прегнандиол (dP2)
25 (18-31)
Не обнаружен 388 (243-643)
5-прегнен-3а,16а,20а-триол (3а,16,20-dP3) 139 (113-173)
5-прегнен-3а,17,20-триол (3a-dP3) 248 (170-334)
Глюкокортикоиды и минералокортикоиды
Тетрагидро-11-дезоксикортизол (ТИБ) 34 (13-58)
Гексагидро-11-дезоксикортизол (ННБ) 15 (11-38)
Тетрагидрокортизон (ТИЕ)
Тетрагидрокортизол (ТИР)
5а-ТИР
Тетрагидрокортикостерон (ТИВ)
5а-ТИВ
1395 (1192-1836)
508 (362-644)
391 (272-743)
74 (45-103)
99 (35-169)
Тетрагидро-11-дегидрокортикостерон 63 (38-101) (ТНА)
127 (107-227)" р < 0,0001
103 (80-181)*
3131 (2143-4984)* р < 0,0001
1053 (306-1750) р < 0,0001
2026 (1112-3556) р < 0,0001
1441 (1058-3455)* р < 0,0007
443 (132-2079) р < 0,0001
1560 (904-2431) р = 0,18
953 (441-1661)* р = 0,009
361 (212-1043) р = 0,57
235 (119-476)** р = 0,001
227 (100-600) р = 0,013
41 (23-105) р = 0,78
1094 (538-5297) р < 0,0001
741 (310-2865)
1141 (665-2824) р = 0,0003
700 (295-1736) р < 0,0001
1048 (446-3648) р < 0,0001
201 (25-651) р = 0,004
71 (43-313) р = 0,18
1262 (972-1639) р = 0,26
400 (175-741) р = 0,40
450 (314-789) р = 0,91
75 (25-101) р = 0,41
300 (141-400) р = 0,002
100 (45-514) р = 0,14
АКР - адренокортикальный рак, ВДКН - врожденная дисфункция коры надпочечников,
р - статистическая значимость различий показателей пациентов с АКР и ВДКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы в сравнении с показателями группы контроля
* р < 0,017, ** р < 0,001 - статистическая значимость различий показателей пациентов с АКР с аналогичными показателями у пациентов с ВДКН вследствие дефекта
21-гидроксилазы
21-гидроксилазы у больных ВДКН по данным ГХ-МС (см. табл. 1, 2). Соотношение (5^-ТНБ+5а-ТНБ+ТНЕ)/17-ОНР, один из биомаркеров 21-ги-дроксилазы, было уменьшено у больных АКР и ВДКН в сравнении с группой контроля, но не различалось между группами больных (см. табл. 2). Среди больных АКР снижение соотношений (5в-ТНБ+5а-ТНБ+ТНЕ)/11-охо-Р3 и (5^-ТНБ+5а-ТНБ+ТНЕ)/Р3 в сочетании с повышением экскреции с мочой Р3 и 11-охо-Р3 не исключает наличия недостаточности 21-гидрокси-лазы у ряда пациентов (см. табл. 1 и 2).
Экскреция с мочой 11-охо-Р3 обнаружена только у больных с ВДКН (табл. 3). У больных АКР при сравнении с показателями пациентов с ВДКН экскреция с мочой 3^,16,20^Р3 была выше, а соотношение 3а,16,20^Р3/3в,16,20^Р3
менее 2,5 с чувствительностью 88% и специфичностью 85% (ЛИС = 0,88; р = 0,0001), что указывает на информативность данных показателей в диагностике АКР (см. табл. 3).
У больных АКР и ВДКН получены признаки недостаточности 3^-ГСДГ-2 (3в-Ш02): уменьшение соотношений (5(3-ТНБ+5а-ТНБ+ТНЕ)ДОНЕА и (5^-ТНБ+5а-ТНБ+ТНЕ)МР3 в сравнении с группой контроля (см. табл. 2). У пациентов с АКР по сравнению со здоровыми донорами установлен дополнительный признак недостаточности 3в~Ш02 - увеличение соотношения dP3/11-охо-Р3 (см. табл. 2).
У больных АКР и ВДКН получены общие нарушения в метаболизме андрогенов, прогестагенов и глюкокортикоидов. У больных АКР в сравнении с показателями пациентов с ВДКН не различались
Таблица 2. Признаки нарушений метаболомики стероидов больных с врожденной дисфункцией коры надпочечников вследствие дефекта 21-гидроксилазы и пациентов с адренокортикальным раком по данным газовой хромато-масс-спектрометрии
Соотношение «продукт/субстрат», Группа контроля (п = 26) Пациенты с ВДКН с дефектом Пациенты с АКР (п = 23)
Ме (025-075) 21-гидроксилазы (п = 18)
Признаки дефекта 5а-редуктазы
An/Et 1,2 (0,8-1,4)
11-ОН-Ап / 11-OH-Et 1,5 (1,4-2,2)
5a-THB / 5ß-THB 1,3 (0,8-1,9)
5a-THF / 5ß-THF 1,0 (0,7-1,2)
Признаки дефекта 21-гидроксилазы
(5ß-THF+5a-THF+THE) / 11-охо- 162 (108-210) прегнентриол
(5ß-THF+5a-THF+THE) / прегнентриол 5,3 (3,9-6,9)
(5ß-THF+5a-THF+THE) / 17-гидроксипрегненолон
20,1 (10,2-40,1)
Признаки дефекта Hß-гидроксистероиддегидрогеназы THF/THE 0,35 (0,29-0,38)
ТНВ/ТНА
1,01 (0,85-1,47)
Признак дефекта Hß-гидроксилазы (THF+allo-THF+THE)/THS 111 (46-144)
Признаки дефекта 3ß-гидроксистероиддегидрогеназы-2 Прегнентриол / 11-охо-прегнентриол 10,2 (8,3-19,7)
(5ß-THF+5a-THF+THE) / дегидроэпиандростерон
13,7 (9,0-24,6)
(5ß-THF+5a-THF+THE) / прегнентриол 11,6 (8,2-16,3)
1,3 (1,1-1,8) p = 0,35
4,5 (3,0-5,6) p < 0,0001
4,0 (2,0-12,4) p < 0,0001
1,3 (0,8-2,0) p = 0,17
2,6 (0,5-4,3) p < 0,0001
0,41 (0,12-1,14) p < 0,0001
1,0 (0,2-4,6) p < 0,0001
0,34 (0,17-0,51) p = 0,81
0,64 (0,19-0,74) p = 0,0003
9,7 (3,8-55,6) p = 0,004
0,66 (0,33-1,63) p < 0,0001
3,4 (1,4-6,8) p = 0,001
1,6 (0,8-4,1) p < 0,0001
0,55 (0,37-0,79)* p < 0,0001
1,1 (0,4-2,6)" p = 0,25
0,8 (0,4-2,5)"' p = 0,39
0,5 (0,2-1,1)" p = 0,016
25,9 (17,1-40,9)' p = 0,0001
1,7 (0,6-3,6)'' p < 0,0001
4,7 (1,4-7,6)
0,60 (0,34-1,03) p = 0,011
2,16 (1,0-4,46)'*' p = 0,12
2,8 (1,2-6,9)'' p < 0,0001
20,3 (16,2-29,7)' p = 0,011
0,58 (0,23-4,07)'' p < 0,0001
1,5 (1,4-3,1) p < 0,0001
An - андростерон, Et - этиохоланолон, THA - тетрагидро-11-дегидрокортикостерон, THB - тетрагидрокортикостерон, THE - тетрагидрокортизон, THF - тетрагидрокортизол, THS - тетрагидро-11-дезоксикортизол, АКР - адренокортикальный рак, ВДКН - врожденная дисфункция коры надпочечников
p - статистическая значимость различий показателей пациентов с АКР и ВДКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы в сравнении с показателями группы контроля
* р < 0,0001, " р < 0,017, "" p < 0,001 - статистическая значимость различий показателей пациентов с АКР c показателями пациентов с ВДКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы
экскреция с мочой метаболитов DHEA (16-ОН-DHEA-3ß, р = 0,29; 16-oxo-dA2, p = 0,031), метаболитов андростендиона (An, p = 0,55; 11-OH-An, p = 0,04; 11-OH-Et, p = 0,35; 11-oxo-Et, p = 0,27), HHS
(р = 0,036), показатель дефекта 11(3-гидроксилазы; биомаркеры дефекта 21-гидроксилазы: экскреция с мочой Р3 (р = 0,06) и 17-ОНР (р = 0,12), соотношение (5в-ТНБ+5а-ТИБ+ТИБ)/17-ОНР (р = 0,02);
Таблица 3. Экскреция с мочой 5-ene-прегненов у больных с врожденной дисфункцией коры надпочечников вследствие дефекта 21-гидроксилазы и у пациентов с адренокортикальным раком, не обнаруженных у здоровых доноров, по данным газовой хромато-масс-спектрометрии
Стероид, Ме (Q25-Q75), мкг/сут Пациенты с ВДКН c дефектом 21-гидроксилазы (n = 18) Пациенты с АКР (n = 23) Значение p
Прегненолон 105 (77-1067) 354 (194-1312) 0,36
17-гидроксипрегненолон 300 (107-381) 535 (191-1100) 0,17
16-гидроксипрегненолон 228 (61-977) 221 (70-581) 0,95
21-гидроксипрегненолон 418 (134-940) 201 (70-309) 0,40
21-гидроксипрегнендиол 4088 (1229-6948) 971 (329-2195) 0,39
3ß,16,20-прегнентриол 176 (94-500) 750 (362-1224) 0,016
3ß,17,20-прегнентриол 482 (149-1750) 405 (253-11385) 0,79
11-гидроксипрегнентриол 124 (60-294) 255 (74-879) 0,40
11-охо-прегнентриол 140 (94-247) Не обнаружен
Соотношение 3а,16,20-прегнентриола / 3ß,16,20-прегнентриола 4,3 (2,5-13,1) 1,4 (1,2-2,1) 0,013
АКР - адренокортикальный рак, ВДКН - врожденная дисфункция коры надпочечников
р - статистическая значимость различий показателей пациентов с ВДКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы с показателями больных АКР
показатель дефекта 3в~Ш02 - соотношение (5р-ТНБ+5а-ТНБ+ТНЕ)МР3 (р = 0,63) (см. табл.1 и 2). Кроме этого, у больных АКР экскреция с мочой 5-епе-прегненов, не определяемых у здоровых людей - прегненолон 0Р), 16-ОН^Р, 17-ОН^Р, 21-ОН^Р, 11-ОН^Р3, 21-ОН^Р2 и 3р,17,20^Р3 -также не отличалась от показателей пациентов с ВДКН (см. табл. 3).
Обсуждение
По мнению многих авторов, исследование СПМ методом ГХ-МС наиболее информативно для изучения особенностей метаболизма стероидов при различных заболеваниях надпочечников [5, 10]. Ряд исследователей отмечают, что больные АКР, не имеющие клинических признаков избыточной секреции стероидов, могут иметь повышенную продукцию предшественников стероидов вследствие ингибирования ферментов адреналового стероидогенеза [5-8]. Опухоли надпочечников у пациентов с ВДКН с дефектом 21-гидроксилазы диагностируют с частотой от 11 до 82% [2]. Ранее увеличение экскреции с мочой БНЕА, 17-ОНР и его метаболитов, 5-епе-прегненов установлено у пациентов и с АКР, и с ВДКН с дефектом 21-ги-дроксилазы [5, 8, 11].
В представленном нами исследовании проведен сравнительный анализ метаболомики стероидов методом ГХ-МС у больных АКР без
клинических и лабораторных признаков гипер-кортизолизма и у пациентов с инциденталомой надпочечников при ВДКН. Установлены как различия, так и общие нарушения в метаболизме стероидов при данных заболеваниях надпочечников. Различия в метаболомике андрогенов, прогестагенов и глюкокортикоидов у больных АКР и ВДКН дали возможность выявить наиболее информативные биомаркеры этих заболеваний. У больных АКР и ВДКН отсутствовали различия в экскреции с мочой ряда биомаркеров АКР (андрогенов, прогестагенов, неклассических 5-епе-прегненов). Кроме этого, ряд показателей дефекта 21-гидроксилазы - экскреция с мочой Р3, 17-ОНР и соотношение (5^-ТНБ+5а-ТНБ+ТНЕ)/17-ОНР, дефекта 3Р-Ш02 - соотношение (5в-ТНБ+5а-ТНБ+ТНЕ)МР3 также не различались у больных АКР и ВДКН. Полученные данные указывают на наличие общих нарушений в метаболизме стероидов у данных пациентов и подтверждают роль нарушений стероидогенеза в процессе формирования опухолей коры надпочечников у больных с ВДКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы.
Заключение
У больных АКР повышение экскреции с мочой ТШ (более 715 мкг/сут), БНЕА,17в-андростендиола, этиохоланолона, прегнендиола,
3^,16,20-прегнентриола, снижение соотношения 3а,16,20-аР3/3^,16,20-аР3 (менее 2,5) в сравнении с показателями пациентов с ВДКН, а также признаки снижения активности 5а-редуктазы и 11р-ГСДГ 2-го типа служат биомаркерами лабораторной диагностики АКР. У больных ВДКН увеличение в сравнении с показателями здоровых доноров и больных АКР экскреции с мочой 11-охо-Р3 (более 440 мкг/сут), 21-аеоху-ТИБ (более 180 мкг/сут), 16-ОНР2, снижение соотношения (5(3-ТНБ+5а-ТИБ+ТИБ)/11-охо-Р3 менее 9,0, определение 11-охо-прегнентриола, не детектируемого у больных АКР, признаки увеличения активности 5а-редуктазы и уменьшения активности 11^-ГСДГ
1-го типа служат биомаркерами, подтверждающими диагноз ВДКН с дефектом 21-гидроксилазы по данным ГХ-МС. У больных АКР и ВДКН с дефектом 21-гидроксилазы установлены общие нарушения в метаболизме стероидов: признаки недостаточности 21-гидроксилазы, 11^-гидроксилазы, 3в~Ш02, отсутствие различий в экскреции с мочой ряда биомаркеров АКР (метаболитов БИБА и андростендиона, 6-ОН-прегнанолона, прег-нандиола, прегнантриола, 17-ОН-прегнанолона и 5-епе-прегненов), ряда показателей дефектов 21-гидроксилазы и 3в~Ш02, что подтверждает роль нарушений стероидогенеза в процессе формирования опухолей коры надпочечников. <$>
Дополнительная информация
Финансирование
Работа проведена в рамках выполнения Госзадания Минздрава России, рег. № НИОКТР АААА-А19-119053190034-0.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи. Участие авторов
З.Р. Шафигуллина - разработка дизайна клинической части исследования, сбор клинического материала, анализ полученных данных, написание текста; Л.И. Великанова - анализ полученных результатов, статистическая обработка данных, написание текста;
Н.В. Ворохобина - анализ клинико-экспериментальных результатов исследования, редактирование текста, утверждение итогового варианта текста рукописи; Е.В. Малеваная и Е.Г. Стрельникова - проведение исследований методом газовой хромато-масс-спектрометрии, анализ полученных результатов; В.Ю. Бохян и T.A. Бритвин - сбор клинического материала, анализ полученных данных; И.С. Стилиди -редактирование текста, утверждение итогового варианта текста рукописи. Все авторы прочли и одобрили финальную версию статьи перед публикацией, согласны нести ответственность за все аспекты работы и гарантируют, что ими надлежащим образом были рассмотрены и решены вопросы, связанные с точностью и добросовестностью всех частей работы.
Литература / References
1. Mallappa A, Merke DP. Congenital Adrenal Hyperplasia. In: Kebebew E, editor. Management of Adrenal Masses in Children and Adults. Springer, Cham; 2017. p. 207-224.
2. Falhammar H, Torpy DJ. Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency presenting as adrenal incidentaloma: a systematic review and meta-analysis. En-docr Pract. 2016;22(6):736-752. doi: 10.4158/ EP151085.RA.
3. Claahsen-van der Grinten HL, Speiser PW, Ahmed SF, Arlt W, Auchus RJ, Falhammar H, Flück CE, Guasti L, Huebner A, Kortmann BBM, Krone N, Merke DP, Miller WL, Nordenström A, Reisch N, Sandberg DE, Stikkelbroeck NMML, Touraine P, Utari A, Wudy SA, White PC. Congenital Adrenal Hyperplasia - Current Insights in Pathophysiology, Diagnostics, and Management. Endocr Rev. 2022;43(1):91-159. doi: 10.1210/endrev/bnab016.
4. Storbeck KH, Schiffer L, Baranowski ES, Chor-tis V, Prete A, Barnard L, Gilligan LC, Taylor AE, Idkowiak J, Arlt W, Shackleton CHL. Steroid Metabolome Analysis in Disorders of Adrenal Steroid Biosynthesis and Metabolism. Endocr Rev. 2019;40(6):1605-1625. doi: 10.1210/er.2018-00262.
5. Arlt W, Biehl M, Taylor AE, Hahner S, Libé R, Hughes BA, Schneider P, Smith DJ, Stiekema H,
Krone N, Porfiri E, Opocher G, Bertherat J, Mantero F, Allolio B, Terzolo M, Nightingale P, Shackleton CH, Bertagna X, Fassnacht M, Stewart PM. Urine steroid metabolomics as a biomarker tool for detecting malignancy in adrenal tumors. J Clin Endocrinol Metab. 2011;96(12):3775-3784. doi: 10.1210/jc.2011-1565.
6. Stigliano A, Chiodini I, Giordano R, Faggiano A, Canu L, Della Casa S, Loli P, Luconi M, Mantero F, Terzolo M. Management of adrenocortical carcinoma: a consensus statement of the Italian Society of Endocrinology (SIE). J Endocri-nol Invest. 2016;39(1 ):103-121. doi: 10.1007/ s40618-015-0349-9.
7. Kerkhofs TM, Kerstens MN, Kema IP, Willems TP, Haak HR. Diagnostic Value of Urinary Steroid Profiling in the Evaluation of Adrenal Tumors. Horm Cancer. 2015;6(4):168-175. doi: 10.1007/ s12672-015-0224-3.
8. Velikanova LI, Shafigullina ZR, Lisitsin AA, Vo-rokhobina NV, Grigoryan K, Kukhianidze EA, Strelnikova EG, Krivokhizhina NS, Krasnov LM, Fedorov EA, Sablin IV, Moskvin AL, Besso-nova EA. Different Types of Urinary Steroid Profiling Obtained by High-Performance Liquid Chromatography and Gas Chromatog-raphy-Mass Spectrometry in Patients with Adrenocortical Carcinoma. Horm Cancer.
2016;7(5-6):327-335. doi: 10.1007/s12672-016-0267-0.
9. Великанова ЛИ, Стрельникова ЕГ, Объед-кова ЕВ, Кривохижина НС, Шафигуллина ЗР, Григорян К, Поваров ВГ, Москвин АЛ. Получение стероидных профилей мочи больных с инциденталомой надпочечников методом газовой хромато-масс-спектрометрии. Журнал аналитической химии. 2016;71(7):775-781. doi: 10.7868/S0044450216070161. [Velikanova LI, Strel'nikova EG, Obedkova EV, Krivokhizhina NS, Shafigullina ZR, Grigoryan K, Povarov VG, Moskvin AL. Generation of urinary steroid profiles in patients with adrenal incidentaloma using gas chromatography-mass spectrometry. J Anal Chem. 2016;71(7):748-754. doi: 10.7868/S0044450216070161.]
10. Krone N, Hughes BA, Lavery GG, Stewart PM, Arlt W, Shackleton CH. Gas chromatography/ mass spectrometry (GC/MS) remains a pre-eminent discovery tool in clinical steroid investigations even in the era of fast liquid chroma-tography tandem mass spectrometry (LC/MS/ MS). J Steroid Biochem Mol Biol. 2010;121(3-5):496-504. doi: 10.1016/j.jsbmb.2010.04.010.
11. Miller WL, Auchus RJ. The molecular biology, biochemistry, and physiology of human steroidogenesis and its disorders. Endocr Rev. 2011;32(1):81-151. doi: 10.1210/er.2010-0013.
Specific characteristics of metabolomics as assessed by gas chromatography-mass spectrometry in patients with adrenocortical cancer and with adrenal incidentalomas in congenital adrenal hyperplasia
Z.R. Shafigullina1 E.V. Malevanaya1 I.S. Stilidi2
L.I. Velikanova1 • N.V. Vorokhobina1 •
E.G. Strelnikova1 • V.Yu. Bokhian2 • T.A. Britvin3
Background: Prolonged episodes of uncontrolled congenital adrenal hyperplasia (CAH) have been shown to result in the occurrence of secondary adrenal neoplasms. Prevalence of adrenal incidentalomas in the patients with 21-hydroxylase deficiency ranges from 11% to 82%. As assessed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), patients with adrenocortical cancer (ACC) have increased level of steroid hormone precursors due to decreased activity of adrenal steroidogen-esis enzymes, mainly that of 21-hydroxylase and 11 (-hydroxylase. It seems relevant to compare the specific characteristics of steroid metabolism by GC-MS in ACC patients and in patients with adrenal incidentalomas and CAH associated with 21-hydroxylase deficiency (21-OHD). Aim: To identify (by GC-MS) common abnormalities in steroid metabolism and differential diagnostic biomarkers in ACC patients and CAH patients with 21-OHD and adrenal masses. Materials and methods: The study included 41 patients with adrenal cortex neoplasms aged 18 to 65 years without clinical and laboratory signs of endogenous hypercortisolism. Twenty three (23) patients had non-metastatic ACC and 18 patients had CAH due to 21-OHD. The control group included 26 healthy blood donors aged 20 to 59 years. Urine steroid profiles were measured by GC-MS with a gas chromatograph-mass spectrometer (Shimadzu GCMS-QP2020). Results: In the ACC patients, there was an increase in urinary excretion of tetrahydro-11-deoxy-cortisol, dehydroepiandrosterone, androstene-diol-17(, etiocholanolone, pregnenediol, and 3(,16,20-pregnenetriol (3(,16,20-dP3), as well as a decrease in the 3a,16,20-dP3/3(,16,20-dP3 ratio, compared to the values in the patients with CAH due to 21-OHD. Compared to the healthy control, 21-hydroxylase, 11(-hydroxylase, 5a-re-ductase and 11(-hydroxysteroid-dehydrogenase
(11 (3-HSDH) type 2 activities were lower. Compared to the ACC patients, those with CAH due to 21-OHD had higher urinary excretion of 11-oxo-pregnane-triol (11-oxo-P3) and 21-deoxy-tetrahydrocortisol and lower 50-THF+5a-THF+THE)/11-oxo-P3 ratio of < 9.0, determination of 11-oxo-dP3, signs higher 5a-reductase activity and lower 11(3-HSDH type 1 activity. The ACC patients and the patients with CAH due to 21-OHD had common abnormalities of steroid metabolism, such as lower activities of 21-hydroxylase, 3p-hydroxysteroid-dehydroge-nase and 1 ^-hydroxylase, and no differences in urinary excretion of a number of ACC biomarkers (androgens, pregnanediol, and 5-ene-pregnenes). Conclusion: The assessment of urinary excretion of androgens, progestagens, and glucocorticoids by GC-MS made it possible to identify common abnormalities in steroid metabolism in the patients with ACC and CAH due to 21-OHD, which confirms the role of disordered steroidogenesis in the formation of adrenocortical tumors.
Key words: adrenocortical cancer, congenital adrenal hyperplasia, 21-hydroxylase deficiency, gas chromatography-mass spectrometry, steroid me-tabolomics
For citation: Shafigullina ZR, Velikanova LI, Vorokhobina NV, Malevanaya EV, Strelnikova EG, Bokhian VYu, Britvin TA, Stilidi IS. Specific characteristics of metabolomics as assessed by gas chromatog-raphy-mass spectrometry in patients with adrenocortical cancer and with adrenal incidentalomas in congenital adrenal hyperplasia. Almanac of Clinical Medicine. 2022;50(1):38-46. doi: 10.18786/2072-05052022-50-007.
Received 16 December 2021; revised 17 February 2022; accepted 18 March 2022; published online 12 April 2022
Zulfiya R. Shafigullina - MD, PhD, Associate Professor, Chair of Endocrinology named after V.G. Baranov1; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8292-8504
Ludmila I. Velikanova - Doctor of Biol. Sci., Professor, Head of Scientific Laboratory of Chromatography1; ORCID: https://orcid.org/0000-
0002-9352-4035
* 41 Kirochnaya ul., Saint Petersburg, 191015, Russian Federation. Tel.: +7 (921) 379 32 95. E-mail: velikanova46@gmail.com
Natalia V. Vorokhobina - MD, PhD, Professor, Head of Chair of Endocrinology named after V.G. Baranov1; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9574-105X Ekaterina V. Malevanaya - PhD (in Chem.), Senior Research Fellow, Scientific Laboratory of Chromatography1; ORCID: https://orcid.org/0000-
0003-0880-0814
Elena G. Strelnikova - PhD (in Chem.), Senior Research Fellow, Scientific Laboratory of Chromatography1; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1208-8092
Vagan Yu. Bokhian - MD, PhD, Head of Surgical Department No. 5 (Endocrine Oncology)2; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9066-5190
Timur A. Britvin - MD, PhD, Head of Department of Surgery3; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-6160-1342. E-mail: t.britvin@gmail.com Ivan S. Stilidi - MD, PhD, Professor, Member of Russ. Acad. Sci., Director2; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-0493-1166. E-mail: ronc@list.ru
Funding
The study was conducted as a part of the State task from the Russian Ministry of Health, registration # NIOCTR
AAAA-A19-119053190034-0.
Conflict of interests
The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article. Authors' contributions
Z.R. Shafigullina, design of the clinical part of the study, clinical data collection and analysis, text writing; L.I. Velikanova, analysis of the results, statistical analysis, text writing; N.V. Vorokhobina, analysis of clinical and experimental study results, text editing, approval of the final version of the manuscript; E.V. Malevanaya and E.G. Strelnikova, gaschromatography-mass spectrometry studies, analysis of the results, V.Yu. Bokhian and T.A. Britvin, clinical data collection and analysis; I.S. Stilidi, text editing, approval of the final version of the manuscript. All the authors have read and approved the final version of the manuscript before submission, agreed to be accountable for all aspects of the work in ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work have been appropriately investigated and resolved.
1 North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov; 41 Kirochnaya ul., Saint Petersburg, 191015, Russian Federation
2 N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology; 24 Kashirskoe shosse, Moscow, 115478, Russian Federation
3 Moscow Regional Research and Clinical Institute (MONIKI); 61/2 Shchepkina ul., Moscow, 129110, Russian Federation
