CC BY
12авирулентных форм Francisella tularensis к диссеминации и пролиферации в организме хозяина. Журн. икробиол. 1996, 2: 10-13.
12. Darveau R.P., Hancock R.E.W. Procedure for isolation of bacterial lipopolysaccharides from both smooth and rough Pseudomonas aeruginosa and Salmonella typhimurium strains. J. Bacteriol. 1983, 155 (2): 831-838.
13. De Pascalis R., Chou A.Y., Bosio C.M. et al. Development of functional and molecular correlates of vaccine-induced protection for a model intracellular pathogen, F. tularensis LVS. PLoS Pathog. 2012, 8 (1):1-14.
14. Isherwood K.E., Titball R.W., Davies D.H. et al. Vaccination strategies for Francisella tularensis. Adv. Drug. Deliv. Rev. 2005, 57 (9): 1403-1414.
15. Khlebnikov V.S., Golovliov I., Kulevatsky D.P. et al. Outer membranes of lipopolysaccharide-protein complex (LPS-17 kDa protein) as chemical tularemia vaccines. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996, 13: 227-235.
16. Oyston P.C., Griffiths R. Francisella virulence: significant advances, ongoing challenges and unmet needs. Expert. Rev. Vaccines. 2009, 8 (11): 1575-1585.
17. Rahhal R.M., Vanden Bush T.J., McLendon M.K. et al. Differential effects of Francisella tularensis lipopolysaccharide on B lymphocytes. J. Leukoc. Biol. 2007, 82: 813-820.
18. Richard K., Mann B. J., Stocker L. et al. Novel catanionic surfactant vesicle vaccines protect against Francisella tularensis LVS and confer significant partial protection against F. tularensis Schu S4 strain. Clin. Vac. Immunol. 2014, 21 (2): 212-226.
19. Sandström G., Tärnvik A., Wolf-Watz H. Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis. J. Clin. Microbial. 1987, 25 (4): 641-644.
20. Sjöstedt A., Sandström G., Tärnvik A. Several membrane polypeptides ofthe live vaccine strain Francisella tularensis LVS stimulate T cells from naturally infected individuals. J. Clin. Microbial. 1990, 28 (1): 43-48.
21. Surcel H.M., Sarvas M., Helander I.M., Herva E. Membrane proteins of Francisella tularensis LVS differ in ability to induce proliferation of lymphocytes from tularemia-vaccinated individuals. Microb. Pathog. 1989, 7 (6): 411-419.
22. Tärnvik A. Nature of protective immunity to Francisella tularensis. Rev. Infect. Dis. 1989, 11 (3): 440-451.
Поступила 20.04.15
Контактная информация: Оноприенко Наталья Николаевна, к.б.н.,
344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40, р.т. (863)240-27-03
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
Д.В.Ульшина, Д.А.Ковалев, А.М.Жиров, Н.В.Жаринова, А.А.Худолеев, О.И.Коготкова, В.И.Ефременко, Н.И.Евченко, А.Н.Куличенко
ОСОБЕННОСТИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИХ БЕЛКОВЫХ ПРОФИЛЕЙ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА ПРИ ПОДГОТОВКЕ КУЛЬТУРЫ НА РАЗНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ
Ставропольский противочумный институт
Цель. С помощью времяпролетной масс-спектрометрии с матричной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS) провести сравнительный анализ белковых профилей штаммов возбудителя бруцеллеза (Brucella melitensis Rev-1 и Brucella abortus 19BA), выращенных на разных питательных средах: агар Альбими, бруцеллагар и эритрит-агар. Материалы и методы. Вакцинные штаммы: Brucella melitensis Rev-1 и Brucella abortus 19BA. Белковое профилирование в линейном режиме на MALDI-TOF масс-спектрометре Microflex «Bruker Daltonics». Результаты. Выявлен ряд характерных особенностей масс-спектров бруцелл: в частности, сохранение общего качественного состава белковых профилей культур и значительные различия в интенсивности отдельных пиков в зависимости от используемой питательной среды. Заключение. На основе анализа полученных данных показано, что применение агара Альбими в качестве питательной среды при подготовке образцов культур бруцелл для масс-спектрометрического анализа является оптимальным.
Журн. микробиол., 2016, № 1, С. 29—34
Ключевые слова: масс-спектрометрия, белковое профилирование, возбудитель бруцеллеза
D.V.Ulshina, D.A.Kovalev, A.M.Zhirov, N.V.Zharinova, A.A.Khudoleev, O.I.Kogotkova, V.I.Efremenko, N.I.Evchenko, A.N.Kulichenko
FEATURES OF MASS-SPECTROMETRIC PROTEIN PROFILES OF STRAINS OF BRUCELLOSIS CAUSATIVE AGENT DURING PREPARATION OF CULTURE ON VARIOUS NUTRIENT MEDIA
Stavropol Institute for Plague Control, Russia
Aim. Carry out comparative analysis using time-of-flight mass-spectrometry with matrix laser desorption/ionization (MALDI-TOF MS) of protein profiles of brucellosis causative agents (Brucella melitensis Rev-1 and Brucella abortus 19BA), cultivated in various nutrient media: Albimi agar, brucellagar and erythrit-agar. Materials and methods. Vaccine strains: Brucella melitensis Rev-1 and Brucella abortus 19BA. Protein profiling in linear mode on Microflex «Bruker Daltonics» MALDI-TOF mass-spectrometer. Results. A number of characteristic features of brucella mass-spectra was detected: in particular, preservation of the total qualitative composition of protein profiles of cultures and significant differences in the intensity of separate peaks depending on the nutrient medium used. Conclusion. Based on the analysis of the data obtained, use of Albimi agar as the nutrient medium for preparation of brucella culture samples for mass-spectrometric analysis was shown to be optimal.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2016, No. 1, P. 29—34
Key words: mass-spectrometry, protein profiling, brucellosis causative agent ВВЕДЕНИЕ
Бруцеллез — зоонозное инфекционно-аллергическое заболевание, склонное к хроническому течению, вызываемое микроорганизмом рода Вrucella. По данным Роспотребнадзора в Российской Федерации в 2014 году было зарегистрировано свыше 400 случаев впервые выявленного бруцеллеза среди людей, наиболее часто на территории СКФО, республик Дагестан и Тыва [3].
В схему лабораторной диагностики бруцеллеза входят бактериологические, иммунологические и молекулярно-генетические методы [2], позволяющие идентифицировать и дифференцировать бруцеллы до вида и биовара. В настоящее время наряду с традиционными методами идентификации патогенов получили распространение физико-химические методы анализа, базирующиеся на количественном измерении физических свойств веществ и характеризующиеся высокой автоматизацией, скоростью и простотой исследований [5].
Один из современных методов идентификации бактерий — времяпролетная масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS), основанная на исследовании специфичных белковых профилей отдельных микроорганизмов [11]. Получение специфичных масс-спектров штаммов возбудителя бруцеллеза дает основание для эффективного применения MALDI-TOF в целях быстрой идентификации патогена. Однако, несмотря на широкие потенциальные возможности использования этого подхода для идентификации и ти-пирования микроорганизмов и, в частности, возбудителя бруцеллеза, на данный момент отсутствуют стандартные процедуры выполнения анализа, нет единого протокола подготовки проб при идентификации бруцелл.
При культивировании бруцеллезного микроба клетки высевают на различные питательные среды: печеночный и мясо-печеночный с добавлением глицерина (2%) и глюкозы (1%) агар, сывороточно-декстрозный, картофельно-сывороточный, триптикозно-соевый, триптозный и кровяной агары в аэробных условиях при температуре 37°С в нейтральной среде (рН 6,8 — 7,2). Потребность бруцелл в источнике азота и дополнительных факторах роста обеспечивается при наличии в питательном субстрате аминокислот: глютаминовой, L-аланина, лизина, метио-нина, гистидина, цистеина, а также комплекса витаминов группы В (В1, В2, В6) и никотиновой кислоты [4]. Вследствие того, что бруцеллы характеризуются при культивировании относительно медленным ростом, рекомендовано использовать селективные питательные среды, обеспечивающие ингибирование или уменьшение числа колоний остальных микроорганизмов, особенно в загрязненных образцах или в образцах, содержащих очень небольшое число жизнеспособных клеток возбудителя бруцеллеза.
В ряде научных публикаций сообщается о существенном влиянии условий культивирования микроорганизмов на характеристики полученных масс-спектров [9, 10]. Поэтому одним из актуальных направлений научного поиска остается изучение зависимости результатов идентификации от условий культивирования штаммов возбудителя бруцеллеза, таких как качество питательной среды, время роста и др.
Цель работы — оценить влияния культивирования бруцелл на различных средах на MALDI-TOF масс-спектрометрические профили экстрактов выращенных штаммов, полученных с использованием стандартизированной процедуры про-боподготовки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы вакцинные штаммы бруцелл: Brucella melitensis Rev-1 и Brucella abortus 19BA из коллекции Ставропольского противочумного института. Вода ультрачистая (тип I по ASTM) (система Millipore, США); спирт этиловый 96% (ГОСТ Р 51723-2001); кислота муравьиная, ~ 98% (Sigma-Aldrich, США); ацетонитрил (степень чистоты «для ВЭЖХ-МС») (Sigma-Aldrich, США); а-циано-4-гидроксикоричная кислота (степень чистоты для масс-спектрометрии) (Sigma-Aldrich, США); трифторуксусная кислота, >99% (Sigma-Aldrich, США); бактериальный тест-стандарт MBT (Bruker Daltonics, Германия). Коммерческие стандартизированные питательные среды: бруцеллагар (ГНЦ ПМБ), показатели качества: рН 7,0 — 7,2, прочность 310 — 390 г по Валенту, содержание аминного азота 120 — 130 мг %; эритрит-агар (НПО «Микроген»), показатели качества: рН 7,0 — 7,4, прочность 310 — 390 г по Валенту, содержание аминного азота 90 — 100 мг%; агар Альбими (Ставропольский противочумный институт), изготовлен из коммерчески доступных стандартных компонентов, показатели качества: рН 7,2 — 7,4, прочность 300 — 380 г по Валенту, содержание аминного азота 100 — 120 мг %).
Вследствие нестабильности свойств плотных питательных сред разных серий, приготовленных по одному и тому же рецепту, большое значение имеет их контроль по физико-химическим показателям: прозрачность и цветность, кислотность, содержание хлоридов и аминного азота, стерильность, температура плавления студня среды, температура застудневания среды, плотность студня среды. Кроме того, стандартность питательных сред обеспечивается комплексом контрольных процедур, включающих использование контрольных штаммов микроорганизмов, позволяющих сделать заключение о пригодности испытуемых сред для проведения бактериологических исследований.
Процедура предварительной проверки питательной среды: из 2-суточных культур В. melitensis и В. abortus готовили по 20 мкл суспензии в концентрации
200 м.к./мл (по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича) для посева на 4 чашки. Через 5 суток культивирования при 37°С на 1 чашке Петри в среднем вырастало 10 — 100 колоний бруцелл, что свидетельствовало о кондиционности тестируемых сред. Для скашивания агар располагали в наклонном положении, после его застывания выдерживали в течение 5 — 7 суток при комнатной температуре и использовали для выращивания бруцелл.
При I пассаже вносили в ампулу с лиофилизированной культурой пастеровской пипеткой 0,4 мл питательного бульона, перемешивали до получения однородной микробной взвеси и этой же пипеткой засевали на чашку Петри с питательным агаром (толщина слоя 6±0,5 мм), посевы инкубировали при температуре 37°С в течение 24 ч. Затем, культуру I пассажа высевали в пробирки со скошенным агаром, инкубировали при 37°С 48 ч. В качестве инокулята использовали одну бактериологическую петлю (d=2 мм) из суспензии культуры первой генерации, приготовленной 10-кратным разведением путем последовательного переноса 0,5 мл взвеси культуры в пробирки с 4,5 мл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида. Взвесь культуры второй генерации доводили, используя стерильный 0,9% раствор натрия хлорида, до оптической плотности, соответствовавшей 1,0х109 м.к./мл (по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича), затем десятикратными разведениями — до 1х106 м.к./мл.
Обеззараживание проб культур возбудителя бруцеллеза проводили путем обработки раствором 70% этилового спирта по ранее описанной методике [7], в которую в ходе исследования были внесены незначительные модификации. Белковые экстракты для MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа получали посредством обработки обеззараженных проб 70% раствором муравьиной кислоты.
Регистрацию масс-спектров осуществляли в линейном режиме на MALDI-TOF масс-спектрометре Microflex (Bruker Daltonics, Германия) при следующих параметрах: частота лазера 60 Hz, интенсивность лазера 10 — 50%, 110 нс PIE, напряжение 1 источника ионов 19,4 kV, 2 — 17,3 kV, напряжение линзы 8 kV, напряжение линейного детектора 2,500 kV, рабочий диапазон масс 2000 — 20000 Da. При подборе условий получения каждого одиночного спектра использовали 40 импульсов лазера (частота 60 Hz) для обеспечения оптимальной чувствительности детектирования компонентов образцов. Суммарный масс-спектр генерировали из 10 случайно выбранных позиций каждой капли мишени (всего по 4000 выстрелов лазера). Каждая серия анализов сопровождалась внутренней калибровкой с использованием бактериального тест-стандарта MBT. Формирование масс-спектров проводили в программах Daltonics flexControl Я3.3.64 (Bruker Daltonics, Германия), визуализацию и предварительный анализ полученных масс-спектров проводили в программе flexAnalysis v 3.3.65 (Bruker Daltonics, Германия).
Для математико-статистической обработки данных использовали пакет прикладных программ Statistica v 10.0 (Statsoft Inc., США). Экспериментальные данные представлены в виде среднего значение (M) ± стандартное отклонение (SD). Анализ групповых различий оценивали по t-критерию Стьюдента для несвязанных выборок при 95% уровне значимости. Различия между выборками считали достоверными при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе исследования проведен MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ белковых экстрактов вакцинных штаммов бруцелл B. melitensis Rev-1 и B. abortus 19BA, полученных на агаре Альбими, бруцеллагаре и эритрит-агаре. Всего было зарегистрировано 630 масс-спектров (по 20 масс-спектров каждого белкового экстракта), наиболее репрезентативные из полученной коллекции были отобраны для проведения сравнительного анализа полученных данных.
Воспроизводимость результатов анализа была подтверждена путем исследования пяти культур каждого штамма, выращенных в стандартных условиях на каждой из выбранных питательных сред. При проведении сравнительного анализа соответствующих белковых экстрактов, полученных в одинаковых условиях, изменений качественного состава масс-спектров не выявлено. Данные белкового профилирования штаммов возбудителя бруцеллеза в целом согласуются с результатами более ранних работ [6]. Необходимо отметить, что рибосомальные белки, относящиеся к белкам домашнего хозяйства, присутствуют в большом количестве в цитоплазме клетки, их набор остается неизменным вне зависимости от внешних условий и стадии роста [1]. Вероятность присутствия экзогенных белков, в том числе из питательной среды, в исследованных образцах не оказывает влияния на результаты белкового профилирования, вследствие особенностей пробоподготов-ки (экстракция фракции основных белков, анализ сигналов в диапазоне масс 2 — 20 kDa).
Сравнительный анализ пиков на спектрах бруцелл позволил выявить ряд особенностей. Общее число идентифицированных пиков на масс-спектрах для штамма B. melitensis Rev-1, культивированных на агаре Альбими, бруцеллагаре и эритрит-агаре, составило 77±3; 65±5 и 41±4 соответственно. Для штамма B. abortus 19BA при использовании вышеуказанных питательных сред суммарное количество сигналов составило 96±5; 89+4 и 52±4 соответственно.
Наиболее представительные по числу сигналов масс-спектры был отмечены для белковых экстрактов бруцелл, полученных на агаре Альбими, что обусловлено, на наш взгляд, оптимальным количественным соотношением азота и углерода, обеспечивающих максимальный ростостимулирующий эффект клеток бактерий.
Анализ масс-спектров белковых экстрактов штаммов возбудителя бруцеллеза, выращенных в течение 12, 48, и 72 ч на каждой из тестируемых питательных сред, позволил установить влияние времени инкубации на характер получаемых данных. Интенсивность мажорных сигналов на масс-спектрах штаммов бруцелл, собранных спустя 48 ч (окончание экспоненциальной фазы роста [8]), была максимальной. При сравнительном анализе спектров экстрактов культур после 12 ч инкубации (латентная фаза) наблюдалось снижение интенсивности (на 40±5%) анализируемых пиков. Однако на масс-спектрах бруцелл, отобранных через 72 ч (завершение стационарной фазы роста), интенсивность сигналов не изменялась, что, возможно, вызвано переходом популяции в фазу замедления роста, сопровождающуюся истощением питательных веществ с характерным сокращением метаболической активности.
Абсолютная интенсивность мажорных пиков на полученных масс-спектрах в случае использования агара Альбими составила: (a.i.) 35 187+530; 48 698± 435; 54 751+560, что существенно превосходит аналогичные сигналы для исследуемых образцов белковых экстрактов с использованием бруцеллагара (13 810+240; 15 035+310; 13 845+295 соответственно) и эритрит-агара (11 281+150; 11 692+220; 12 877+200 соответственно). Таким образом, белковые профили экстрактов культур бруцелл, выращенных на агаре Альбими, характеризовались максимальной интенсивностью специфичных пиков.
Исследуемые спектры возбудителя бруцеллеза содержали общий набор из 17 сигналов в интервале масс 2000 — 20000 Da, отличающихся по интенсивности (m/z+5 Da): 2422, 2581, 3025, 3268, 3336, 3523, 3696, 3754, 4545, 4770, 5036, 5170, 5360, 6672, 7048,9085,16 068.
Сравнительный анализ групп специфичных пиков на полученных масс-спектрах позволил установить стабильность их состава в белковых портретах бруцелл независимо от используемой питательной среды, что, в свою очередь, подтверждает предположение о консервативности состава основных белков воз-
3. ЖМЭИ 1 № 22-2016
33
будителя в исследуемом диапазоне. При этом экспериментально было установлено, что относительная интенсивность отдельных сигналов белковых профилей штаммов возбудителя бруцеллеза напрямую зависит от свойств питательной среды.
Полученные в ходе исследования результаты в целом позволяют сделать вывод о том, что применение агара Альбими в качестве питательной среды при культивировании бруцелл для масс-спектрометрического анализа является оптимальным.
Необходимо отметить, что использование регламентированных методик обеззараживания и подготовки проб культур патогенных микроорганизмов, в том числе стандартизованных питательных сред, позволит обеспечить необходимый уровень достоверности и воспроизводимости результатов масс-спектрометриче-ского анализа, что имеет большое значение, учитывая широкое внедрение технологии MALDI-TOF MS в лабораторную практику.
Л ИТЕРАТУРА
1. Демидов Е.А., Старостин К.В., Попок В.М., Пельтек С.Е. Применение малди время-пролетной масс-спектрометрии для идентификации микроорганизмов. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2013, 17 (4/1): 758-764.
2. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: Практическое руководство. Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. М., Шико, 2013.
3. Лямкин Г.И., Худолеев А.А., Хачатурова А.А., Куличенко А.Н. Обзор эпидемиологической ситуации по бруцеллезу в Российской Федерации в 2014 г. и прогноз на 2015 г. Пробл. особо опасных инфекций. 2015, 2: 22-24.
4. Методические указания МУ 3.3.2.2124-06 «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза».
5. Charnot-Katsikas A., Tesic V., Boonlayangoor S. et al. Prospective evaluation of the VITEK MS for the routine identification of bacteria and yeast in the clinical microbiology laboratory: assessment of accuracy of identification and turnaround time. J. Med. Microbiol. 2014, 63 (2): 235-241.
6. Ferreira L., Castaño S. V., Sánchez-Juanes F. et al. Identification of Brucella by MALDI-TOF mass spectrometry. Fast and reliable identification from agar plates and blood cultures. PLoS One. 2010, 5 (12): 1-8.
7. Lista F., Reubsaet F., De Santis R. et al. Reliable identification at the species level of Brucella isolates with MALDI-TOF-MS. BMC Microbiol. 2011, 11: 267.
8. Murthy R.V., Arora J.S., Kumar B.V.S. Comparative proteome analysis of Brucella abortus under different growth conditions by two dimensional electrophoresis. IJAR. 2015, 3 (2): 795800.
9. Ruelle V., El Moualij B., Zorzi W et al. Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004, 18 (18): 2013-2019.
10. Valentine N., Wunschel S., Wunschel D. et al. Effect of culture conditions on microorganism identification by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71 (1): 58-64.
11. Van Veen S.Q., Claas E.C.J., Kuijper Ed J. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J. Clin. Microbiol. 2010, 48 (3): 900-907.
Поступила 15.08.15
Контактная информация: Ульшина Диана Васильевна, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15, р.т. (8652)26-03-12
