Масс-спектрометрический анализ белковых экстрактов крови животных при экспериментальном бруцеллезе Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2019

Д.В.Ульшина, Д.А.Ковалев, Д.Г.Пономаренко, Д.В.Русанова, Т.В.Бердникова, А.Ю.Евченко, О.В.Бобрышева, Ю.В.Сирица, С.В.Писаренко, А.М.Жиров, И.В.Кузнецова, Н.Г.Варфоломеева, А.Н.Куличенко

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ БЕЛКОВЫХ ЭКСТРАКТОВ КРОВИ ЖИВОТНЫХ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ БРУЦЕЛЛЕЗЕ

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Цель. Изучить возможность прямого выявления возбудителя бруцеллеза в биоматериале в условиях эксперимента методом MALDI-TOF MS с использованием ресурсов программы Mass-Up и комплекса пакетов для статистического программного обеспечения с открытым исходным кодом R. Материалы и методы. В качестве моделей использовали лабораторных мышей, зараженных возбудителями бруцеллеза (штаммы B. melitensis 548, B. abortus 544, B. suis 1330). Белковое профилирование проводили на MALDI-TOF масс-спектрометре Microflex «Bruker Daltonics». Результаты. Используемый биоинформационно-статистический подход для анализа MALDI-TOF масс-спектров позволил проводить прямое выявление бруцелл в биоматериале с последующим определением их видовой принадлежности на основании выявления группы биомаркеров. Заключение. Экспериментально подтверждено, что белковые профили экстрактов крови зараженных животных содержат 11 маркеров, в том числе 6 родоспецифичных для микроорганизмов рода Brucella spp., которые могут быть ассоциированы с бруцеллезной инфекцией.

Журн. микробиол., 2019, № 4, С. 11—18

Ключевые слова: Brucella spp., MALDI-TOF MS, белковое профилирование

D.V.Ulshina, D.A.Kovalev, D.G.Ponomarenko, D.V.Rusanova, T.V.Berdnikova, A.Yu.Evchenko, O.V.Bobrysheva, Yu.V.Siritsa, S.V.Pisarenko, A.M.Zhirov, I.V. Kuznetsova, N.G.Varfolomeeva, A.N.Kulichenko

MASS SPECTROMETRY ANALYSIS OF PROTEIN BLOOD EXTRACTS OF ANIMALS WITH EXPERIMENTAL BRUCELLOS

Stavropol Research Institute for Plague Control, Russia

Aim. The aim of the present research was to study the possibility of direct detection of the causative agent of brucellosis in a biomaterial under experimental conditions via the MALDI-TOF MS method using Mass-Up program resources and a set of packages for open-source statistical software R. Materials and methods. We used laboratory mice infected with the causative agents of Brucellosis (strains B. melitensis 548, B. abortus 544, B. suis 1330) as models. Protein profiling was performed on a MALDI-TOF Microflex «Bruker Daltonics» mass spectrometer. Results. The bioinformatic-statistical approach used for analyzing MALDI-TOF mass spectra allows to carry out a direct detection of Brucella in the biomaterial; besides, it is possible to determinate their species via the identification of a group of biomarkers. Conclusion. It was experimentally confirmed that the protein profiles of the blood extracts of infected animals contain 11 markers, including 6 genus specific for Brucella spp., which can be associated with Brucella infection.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2019, No. 4, P. 11—18

Key words: Brucella spp., MALDI-TOF MS, protein profiling

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время в работу бактериологических лабораторий активно внедряется технология MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Lazer Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry — матрично-активированная лазерная десорбция/ ионизация с времяпролетным разделением), характеризующаяся высокоточной экспресс-идентификацией микроорганизмов, возможностью анализировать материал, контаминированный посторонней микрофлорой и низкой стоимостью анализа.

Для подавляющего большинства микроорганизмов: грамположительные, гра-мотрицательные, аэробные и анаэробные бактерии, дрожжи и плесень, сформированы базы масс-спектрометрических данных (БД). С одной стороны, можно с уверенностью утверждать, что имеющиеся коммерческие БД позволяют обеспечить проведение рутинной идентификации патогенов, с другой, количество референ-сных масс-спектров различных видов микроорганизмов составляет лишь малую долю глобального микробного разнообразия, и поэтому имеющиеся базы данных нуждаются в пополнении.

Возможности применения метода MALDI-TOF MS для точной идентификации микроорганизмов на основании анализа их белковых профилей отражены в статье Seng P. с соавторами [7]. По данным авторов диагностическая информативность метода MALDI-TOF MS варьирует в пределах от 90 до 99,9%.

По результатам ранее проведенных нами исследований была доказана эффективность применения MALDI-TOF MS для индикации и межвидовой дифференциации культур бруцелл, выделенных бактериологическим методом из клинического материала [2]. Можно ожидать, что в ближайшие годы MALDI-TOF MS будет использоваться в комплексе с основными методами лабораторной диагностики бруцеллеза благодаря возможности ее применения для экспресс-идентификации и типирования биологических агентов [3; Sali M. et al., 2018].

Известно, что для успешной идентификации культур микроорганизмов необходимого качества масс-спектры могут быть получены при концентрации в исходном образце — не менее 104 м.к./мл [5]. Кроме того, присутствие различных веществ органической и неорганической природы в клиническом материале может также затруднить прямую индикацию бруцелл. В качестве решения указанной проблемы используют различные способы предварительной подготовки проб: фракционирование, удаление мажорных фракций белков, селективное удаление небелковых примесей и др.

Использование MALDI-TOF MS для выявления возбудителей ООИ, в том числе бруцеллеза, в клиническом материале на настоящий момент включает необходимый этап выделения культуры патогена бактериологическим методом, что затрудняет внедрение подобного подхода в практику ввиду увеличения материальных затрат и продолжительности анализа [6]. Дополнительные временные затраты для реализации данного этапа существенно затрудняют возможность раннего назначения адекватного антибиотика и могут приводить к использованию как недостаточно эффективных, так и избыточных режимов терапии. Применительно к рассматриваемой проблеме сокращение времени инкубации высева первичной гемокультуры с применением специальных способов пробоподготовки позволяет проводить прямую идентификацию первичной гемокультуры, минуя этап субкультивирования [8].

Принимая во внимание все достоинства и возможности метода, наиболее актуальной представляется задача по выявлению на белковых профилях исследуемых культур групп специфичных фрагментов — маркеров с целью их дальнейшего поиска в спектрах образцов клинического материала или биоматериала от животных [4].

В ходе проведенных исследований по изучению культур возбудителя бруцеллеза методом MALDI-TOF MS нами были выявлены группы бруцелла-специфичных фрагментов в диапазоне масс 2000 — 20000 Da (m/z, ±5 Da): 2422, 2581, 3025, 3268, 3336, 3523, 3696, 3754, 4545, 4770, 5036, 5170, 5360, 6672, 7048, 9085, 16068 [1].

Для изучения возможности и эффективности применения MALDI-TOF масс-спектрометрии для прямой детекции возбудителя бруцеллеза в биологических образцах необходимо экспериментальное моделирование инфекции на биомоделях.

Цель работы — изучить возможность прямого выявления возбудителя бруцеллеза в биоматериале с использованием MALDI-TOF MS в условиях эксперимента.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве биологических моделей использовали лабораторных мышей (n=20), зараженных возбудителями бруцеллеза (штаммы Brucella melitensis 548, Brucella abortus 544, Brucella suis 1330).

В ходе эксперимента были сформированы четыре группы животных: группу № 1 заражали штаммом B.melitensis 548, № 2 — B. abortus 544, № 3 — B. suis 1330, № 4 — группа сравнения (животные, кровь которых была использована в анализе в качестве отрицательного контроля). Для моделирования инфекции мышам вводили подкожно в паховую область 0,5 мл суспензии соответствующего штамма бруцелл в концентрации 1Х105 м.к./мл в растворе 0,9% хлорида натрия, рН 7,2. Наблюдение за животными проводили в течение 21 сут после заражения.

Через 21 сут после заражения биопробных животных умерщвляли путем хлороформирования. У хлороформированных биомоделей производили взятие крови из сердца в объеме 1,0-1,5 мл. От зараженных животных производили посев паренхиматозных органов и лимфоузлов на агар Альбими, скошенный в пробирках. Посевы культивировали в термостате при температуре 37±1°С в течение 14 сут. От всех зараженных животных бактериологическим методом была выделена культура бруцелл. Биологическая безопасность работ с культурами возбудителя бруцеллеза была обеспечена в полном объеме в соответствии с требованиями СП 1.3.31.18-13 и МУК 3.1.7.3402—16.

Культуры возбудителя бруцеллеза были выращены на агаре Альбими (рН 7,2 — 7,4, прочность 300 — 380 г по Валенту, содержание аминного азота 100 — 120 мг).

Для проведения исследования использовались: вода ультрачистая, тип I по ASTM (система Millipore, США), спирт этиловый 96 % (ГОСТ Р 51723-2001), кислота муравьиная ~ 98% (Sigma-Aldrich, США), ацетонитрил, степень чистоты для ВЭЖХ-МС (Sigma-Aldrich, США), а-циано-4-гидроксикоричная кислота, степень чистоты для масс-спектрометрии (Sigma-Aldrich, США), трифторуксусная кислота > 99% (Sigma-Aldrich, США), бактериальный тест-стандарт MBT для внутренней калибровки масс-спектрометра (Bruker Daltonics, Германия).

Принимая во внимание внутриклеточную локализацию возбудителя бруцеллеза, в качестве образца для белкового профилирования брали экстракт лейкоцитарной фракции крови, для чего осадок, содержащий форменные элементы крови, разбавляли многократно дистиллированной водой с последующей инкубацией (10 мин) и центрифугированием до полного удаления эритроцитов. Освобождение от эритроцитов проводили до полного обесцвечивания, получаемого в ходе промывки супернатанта. Суспензию отмытых лейкоцитов переносили в чистые микроцентрифужные пробирки и центрифугировали с удалением супернатанта при 15500 об/мин 10 мин.

Обеззараживание образцов лейкоцитарной фракции осуществляли путем добавления к пробе 70% этилового спирта с последующей инкубацией при температуре 30оС в течение 90 мин. После проведенной инактивации образцы суспензии центрифугировали и супернатант отбирали. Для полного удаления спирта процедуру центрифугирования повторяли.

После обеззараживания часть осадка высевали на скошенный Бруцеллагар, посевы инкубировали в течение 7 дней при 37°C. Во время проведения контроля на специфическую стерильность образцы белковых экстрактов хранились при температуре минус 18 — 20°С. При отсутствии специфического роста в пробирках с Бруцеллагаром исследуемый материал считали обеззараженным.

Белковую экстракцию лейкоцитарной фракции производили смесью 70 % муравьиной кислоты и ацетонитрила. Масс-спектры получали в линейном режиме на MALDI-TOF масс-спектрометре Microflex (Bruker Daltonics, Германия) в диапазоне масс 2000—20000 Da.

Подготовленные вышеописанным способом пробы в объеме 1 мкл наносили на ячейки стального планшета для MALDI-TOF MS, в течение нескольких минут сушили на открытом воздухе, затем сверху наслаивали раствор матрицы (а-циано-4-гидроксикоричная кислота в растворе, содержащем 500 мкл ацетонитрила, 475 мкл воды I типа и 25 мкл трифторуксусной кислоты). Плашку высушивали на воздухе в течение 5 минут до образования кристаллов.

Масс-спектры получали в линейном режиме на MALDI-TOF масс-спектрометре Microflex при следующих параметрах: частота лазера 60 Гц, интенсивность лазера 10—50%, время задержки экстракции 110 нс PIE, напряжение первого источника ионов 19,4 kV, второго — 17,3 kV, напряжение фокусирующей линзы 8 kV, напряжение линейного детектора 2,500 kV, диапазон масс m/Z 2000—20000 Da. Внутреннюю калибровку диапазона m/Z проводили с использованием точных значений масс бактериального тест-стандарта MBT (Bruker Daltonics, Германия) в автоматическом режиме.

Для управления масс-спектрометром, включая установку режимов работы и регистрации масс-спектров, использовали программный пакет Daltonics flexControl v.3.3.64 (Bruker Daltonics, Германия), для предварительной оценки интенсивности и разрешения пиков в спектре — flexAnalysis v 3.3.65. Формирование промежуточных таблиц проводили с использованием программных ресурсов пакета Microsoft Office 2010. Статистический анализ и визуализацию полученных данных осуществляли с помощью интегрированных пакетов «MALDIquant», «MALDIquantForeign», «sda» (https://cran.r-project.org/web/packages/rgl/index.html), (http://strimmerlab.org/ software/maldiquant/) языка программирования R (https://cran.r-project.org/) и Mass-Up (http://sing.ei.uvigo.es).

Полученные в ходе работы масс-спектры для каждого анализируемого образца использовали для построения дендрограммы средствами программного пакета «MALDIquant», реализованного в среде R, представляющего альтернативу для интерпретации данных MALDI-TOF MS. Представление полученных масс-спектров в виде иерархической структуры позволило определить положение каждого отдельного спектра на основании величины сходства характеристик его пиков от средних значений характеристик в группе спектров. Результативность кластерного анализа достигается использованием метрики дистанций d (х, у), при этом расстояние между объектами одной группы в целом будет меньше «e», а между объектами из разных групп больше «e», где «e» > 0 — задаваемый уровень сходства.

Построение собственного дерева для каждой повторной выборки с вычислением частоты встречаемости всех фрагментов в сформированной последовательности производили с использованием бутстреп-вероятности BP. Гипотезу о существовании кластера считали достоверной, если с ветвями бутстрепного дерева связывалась вероятность, превышающая 70%. Построение дендрограммы проводили в евклидовом пространстве на основании данных матрицы признаков «featureMatrix».

В качестве метода для создания классификаций масс-спектров использовали анализ главных компонентов (principal component analysis, РСА), основное преимущество которого заключается в том, что из совокупности характеристик объекта наблюдения (в данном случае — масс-спектр образца) выбирают наиболее вариабельные величины (с точки зрения исследователя), значения которых откладывают по осям трехмерной системы координат (главные компоненты) и на пересечении перпендикуляров из этих осей ставят точку. Используемое программное обеспечение позволило представить РСА-кластер в трехмерном пространстве.

В качестве маркеров использовали сигналы, p-значение которых было меньше 0,05 (https://www.sing-group.org/mass-up/manual). Частоту встречаемости каждого потенциального маркера рассчитывали с использованием пакета прикладных программ Statistica v 10.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценку особенностей белковых профилей экстрактов крови мышей, зараженных бруцеллами, проводили при сравнении с масс-спектрами отрицательного контроля (кровь мышей из контрольной группы). Каждый образец анализировали в четырех повторах.

По результатам качественного и количественного анализа данных наименьшее количество пиков (40±2) содержали масс-спектры экстрактов крови животных, зараженных B. suis 1330. Наиболее представительные спектры (79±3 и 69±3) были получены для образцов крови мышей, которым вводили B. abortus 544 и B. melitensis 548, соответственно.

На масс-спектрах белковых экстрактов крови мышей из групп сравнения основное число сигналов было локализовано в двух областях значений масс рабочей области: 2,6—8,5 и 13,5—16,0 kDa. В результате сравнительного анализа белковых профилей образцов отрицательного контроля были установлены общие фрагменты, значения абсолютной интенсивности которых варьировало в диапазоне от 250 до 2,0 х 104 a.i. (m/z ± 5 Da): 2683, 2739, 2925, 3140, 3327, 4195, 4286, 5005, 5660, 6908, 7228, 7506, 11682, 14992, 15001. Разрешение для перечисленных сигналов находилось в диапазоне от 205 до 436, отношение сигнал/шум — от 6/1 до 19/1, ширина пика на полувысоте — от 11 до 52, частота регистрации составляла >0,99. Указанные значения параметров полученных масс-спектров являются приемлемыми для дифференциации аналитически значимых фрагментов из всего массива сигналов. При этом, области m/Z, содержащие сигналы с высоким значением абсолютной интенсивности, перекрывались с областями значений масс, в которых регистрировались специфичные для представителей рода Brucella пики, что затрудняло выявление бруцелла-специфичных сигналов на масс-спектрах экстрактов крови мышей, зараженных возбудителем бруцеллеза.

Основное количество зарегистрированных пиков на масс-спектрах белковых экстрактов лейкоцитарной фракции крови мышей, зараженных возбудителем бруцеллеза, было расположено в интервале значений масс 2,0 — 8,3 и 14,5-1,6 kDa рабочей области. Анализ MALDI-TOF масс-спектров белковых экстрактов лейкоцитов крови инфицированных животных всех групп позволил выявить общие пики (m/z ± 5 Da): 2250, 2581, 3025, 3640, 3696, 3754, 4545, 6672, 7905, 8351, 14504 (курсивом отмечены родоспецифичные маркеры возбудителя бруцеллеза). Интенсивность указанных фрагментов находилась в диапазоне от 300 до 6000 a.i., разрешение — от 269 до 534, отношение сигнал/шум — от 8/1 до 24/1, ширина пика на полувысоте — от 6 до 59. Указанные параметры общих сигналов позволяют достоверно их дифференцировать от совокупности всех пиков. Частота регистрации шести родоспецифичных сигналов бруцелл, отличающихся по абсолютной интенсивности, составляла 0,98.

В ходе сравнительного анализа белковых профилей экстрактов лейкоцитов крови мышей, инфицированных культурой B. abortus 544, были установлены специфичные для этой группы сигналы (m/z ± 5 Da): 2322, 2334, 4941, 6257, 10781, 10798, 11000, 12117, 13609. На масс-спектрах белковых экстрактов лейкоцитов крови животных, зараженных B. melitensis 548, было выявлено 2 общих сигнала (m/z ± 5 Da): 2264, 8378. Наибольшее количество уникальных фрагментов отмечено на белковых профилях экстрактов крови мышей 3 группы (B. suis 1330) (m/z ± 5 Da): 2133, 2422, 2455,2545, 2754, 3050, 3107, 3268, 3842, 3885, 3902, 3927, 3970, 4067, 4796, 4856, 4871, 4896,5114,5219, 5235,5250,6621,6640,7106, 7155, 7172, 7336, 7360, 7386, 7550, 7777, 7854, 7992,8917,10289,10332,12699, 14256,14346,14362,14468, 14698, 14864, 15858, 15904. Очевидно, что заражение модельных животных возбудителем бруцеллеза сопровождается появлением специфичных сигналов на соответствующих белковых профилях экстрактов крови.

Визуализация данных, построенная методом PCA с использованием ресурсов статистического программного обеспечения Mass-Up (рис. 1) отражает распределение проб крови искусственно инфицированных животных компактно и дискретно от крови мышей из группы сравнения в виде совокупности точек в пространстве (РСА-кластер).

На диаграмме можно отметить четкое разделение белковых профилей экстрактов крови мышей при остром бруцеллезе на две группы: первую образуют животные, зараженные культурами B. abortus 544 и B. melitensis 548, во вторую вошли животные, инфицированные B. suis 1330. Распределение образцов на основании MS данных полностью совпадает с видовой принадлежностью используемых при заражении штаммов бруцелл. Формирование отдельного кластера образцами лейкоцитарной фракции крови животных, зараженных B. abortus 544 и B. melitensis 548, на дендрограмме (рис. 2) в полной мере согласуется с общеизвестными данными о генетической близости представителей указанных двух видов бруцелл и с результатами на основании анализа сходства белковых профилей их культур. Образцы отрицательного контроля

Рис. 1. Диаграмма распределения масс-спектров экстрактов лейкоцитов крови мышей, зараженных культурами B. abortus 544, B. melitensis 548 и B. suis 1330, а также из группы сравнения на основании результатов анализа MS профилей методом PCA

Рис. 2. Дендрограмма масс-спектров проб крови мышей из групп сравнения

формировали отдельную группу. Пробы крови животных, зараженных культурами B. suis 1330, также формировали компактную группу, по сравнению с образцами крови мышей, зараженных культурами B. abortus 544 и B. melitensis 548. Возможно, подобное расположение является следствием того, что белковые профили проб лейкоцитов крови животных, зараженных культурами B. suis 1330, характеризовались наименьшей представительностью (количество и интенсивность сигналов) по сравнению с образцами от животных, зараженных B. abortus 544, B. melitensis 548.

Таким образом, в ходе работы была подтверждена возможность прямого выявления специфичных маркеров возбудителя бруцеллеза в биоматериале методом MALDI-TOF MS без этапа выделения чистой культуры или накопления возбудителя в образце на стадии подроста гемокультур на питательных средах. В результате сравнительного анализа белковых профилей экстрактов лейкоцитов крови животных при остром бруцеллезе описано 6 общих родоспецифичных сигналов Brucella spp. (m/z ± 5 Da): 2581, 3025, 3696, 3754, 4545, 6672, позволяющих достоверно определить образцы инфицированных бруцеллезом животных.

Результаты MALDI-TOF MS исследования культур возбудителя бруцеллеза подтверждают сложность проведения межвидовой дифференциации близкородственных видов бруцелл на основе данных белкового профилирования. Вместе с тем, на основании полученных данных, распределение спектров проб лейкоцитарной фракции крови животных, инфицированных разными видами бруцелл, на построенной дендрограмме полностью согласуется с видовой принадлежностью исследуемых штаммов. Присутствие различий на белковых профилях экстрактов лейкоцитов крови мышей, инфицированных культурами возбудителя бруцеллеза, очевидно, обусловлено не только индивидуальными особенностями используемых культур бруцелл разных видов, но и их адаптивными изменениями в организме животных в условиях персистенции возбудителя. Следовательно, при нахождении в организме хозяина возбудитель инфекции подвергается воздействию иммунной системы, что, вероятно, обусловливает синтез патогеном определенных белков, экспрессия которых вне организма хозяина отсутствует.

Описанные родо- и видоспецифичные для бруцелл особенности масс-спектров экстрактов лейкоцитов крови при остром бруцеллезе могут быть использованы при разработке эффективного методического подхода для индикации и идентификации возбудителя бруцеллеза в клиническом материале и биоматериале от сельскохозяйственных животных с использованием MALDI-TOF MS.

Таким образом, результаты экспериментального исследования позволяют говорить о высокой диагностической информативности метода MALDI-TOF MS для прямого выявления белковых маркеров бруцелл в биоматериале и последующего определения их видовой принадлежности, что требует дальнейших исследований. Впервые охарактеризованы ассоциированные с бруцеллезной инфекцией 11 белковых маркеров, в том числе 6 родоспецифичные для микроорганизмов рода Brucella spp., которые могут быть использованы при разработке эффективного методического подхода для диагностики бруцеллеза методом MALDI-TOF MS.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ульшина Д.В., Ковалев Д.А., Бобрышева О.В., Лямкин Г.И., Худолеев А.А., Сирица Ю.В., Куличенко А.Н. Разработка алгоритма идентификации культур возбудителя бруцеллеза методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Проблемы особо опасных инфекций. 2015, 4: 96-99.

2. Ульшина Д.В., Ковалев Д.А., Бобрышева О.В., Пономаренко Д.Г., Русанова Д.В., Ковалева Н.И., Куличенко А.Н. Применение времяпролетной масс-спектрометрии для диагностики бруцеллеза и межвидовой дифференциации штаммов Brucella spp. Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2018, 7 (4): 15-24.

3. Цимбалистова М.В., Павлович Н.В., Аронова Н.В., Чайка И.А., Чайка С.О., Водопьянов А.С. Масс-спектрометрический анализ природных и антиген-измененных штаммов туляремийного микроба. Проблемы особо опасных инфекций. 2017, 4: 92-96.

4. Cheng D., Qiao L., Horvatovich P. Toward Spectral Library-Free Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Bacterial Identification. Journal of proteome research. 2018, 17 (6): 2124-2130.

5. Hsieh S.Y, Tseng C.L., Lee Y.S. et al. Highly efficient classification and identification of human pathogenic bacteria by MALDI-TOF MS. Mol. Cell Proteomics. 2008, 7: 448-456.

6. Kock R., Wfillenweber J., Horn D. et al. Implementation of short incubation MALDI-TOF MS identification from positive blood cultures in routine diagnostics and effects on empiric antimicrobial therapy. Antimicrobial Resistance and Infection Control. 2017, 6 (1): 12-18.

7. Seng P., Abat C., Rolain J.M. et al. Identification of rare pathogenic bacteria in a clinical microbiology laboratory: impact of MALDI-TOF mass spectrometry. Journal of clinical microbiology. 2013, 51: 21822194.

8. van Belkum A., Welker M., Pincus D. et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical microbiology: what are the current issues? Annals of laboratory medicine. 2017, 37 (6): 475-483.

Поступила 26.02.19

Контактная информация: Ульшина Д.В.,

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15, р. т. (8652)26-03-12

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2019

Е.А.Котенева, Е.С.Котенев, А.В.Калинин, Н.С.Царева, Л.А.Кот, Н.В.Жаринова, А.А.Зайцев, Г.А.Печковский

ПРОТЕОМНОЕ ПРОФИЛИРОВАНИЕ ШТАММОВ YERSINIA PESTIS, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ ЧУМЫ СЕВЕРНОГО КАВКАЗА И ЗАКАВКАЗЬЯ

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Цель. Создание базы данных масс-спектров штаммов Yersinia pestis, позволяющей дифференцировать штаммы основного и кавказского подвидов возбудителя чумы методом MALDI-TOF MS. Материалы и методы. Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии было исследовано 50 штаммов Yersinia pestis, выделенных на территории 7 природных очагов чумы Кавказа и Закавказья в период 1950-2012 г. Снятие масс-спектров экстрактов клеток Y pestis проводили с использованием масс-спектрометра Microflex LT «Bruker Daltonics». Результаты обрабатывали и анализировали в программах «FlexAnalysis» и MALDI Biotyper v. 3.0. Результаты. Показано, что масс-спектры имеют характерные особенности, позволяющие дифференцировать штаммы основного (pestis) и неосновного подвидов. Выявлены пики, характерные для каждого подвида, наличие у Y. pestis подвида caucasica пиков, характерных для предковой формы — Y. pseudotuberculosis указывает на древнее происхождение этой группы, что согласуется в данными молекулярно-генетического и WGS анализа, приведенными в публикациях отечественных и зарубежных авторов. Заключение. Показана возможность применения метода MALDI-TOF масс-спектрометрии для быстрой дифференциации штаммов чумы основного и неосновного подвида, имеющих разное значение в развитии и поддержании эпизоотического процесса в природных очагах чумы, а также разную вирулентность для человека. Идентификация штамма до уровня подвида требует проведения культуральных и биохимических тестов, которые могут занять несколько суток. Предлагаемый метод позволяет провести дифференциацию и получить результат уже через полчаса после получения чистой культуры.

Журн. микробиол., 2019, № 4, С. 18—25

Ключевые слова: Yersinia pestis, MALDI-TOF масс-спектрометрия, внутривидовое типирование штаммов, природные очаги чумы, идентификация штаммов, специфические пики