CC BY
139
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 11 2008 Вып. 1
УДК 616-009.7:612.112.3
В. Г. Овсянников, В. В. Алексеев, А. А. Кутузова
ОСОБЕННОСТИ ЛЕЙКОЦИТАРНОЙ РЕАКЦИИ И ФАГОЦИТОЗА У КРЫС РАЗНОГО ВОЗРАСТА ПРИ ОСТРОЙ СОМАТИЧЕСКОЙ БОЛИ
Ростовский государственный медицинский университет
Широко известно, что одна из ключевых позиций в иммунной системе принадлежит фагоцитозу, который рассматривают сегодня не только как инструмент противо-инфекционного иммунитета, но и как универсальный эффектор гомеостаза, реагирующий на многочисленные сигналы о дестабилизации внутренней среды организма [1, 2]. Каждому возрасту присущи свои изменения фагоцитарных сдвигов. Так, известно, что у детей высокий уровень заболеваемости связан в том числе и с нарушением функциональной активности лейкоцитов [3]. Однако до настоящего времени остаются недостаточно изученными процессы онтогенетического становления фагоцитарных реакций как в норме, так и при различных патологических процессах.
Целью нашего исследования явилось изучение возрастных особенностей лейкоцитарного профиля и фагоцитоза как одного из важнейших механизмов защиты организма в постнатальном онтогенезе в условиях физиологической нормы и при острой соматической боли, возникающей при различных патологических процессах.
Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 60 беспородных самцах белых крыс трех возрастных групп: 3-4-дневных, 30-35-дневных и 3-4-месячных. Данные возрастные группы формировались в соответствии с физиологическими критериями периодизации постнатального онтогенеза: 3-4-е сутки—период новорожденности, один месяц жизни—пре-пубертатный период, 3-4-й месяц жизни — зрелый репродуктивный возраст. Животные рождались и содержались в стандартных условиях вивария, при 24-часовом фоторежиме, температуре воздуха 22 ± 2 °С и свободном доступе к воде и корму.
В соответствии с целью проведено 2 серии исследований: контрольная — 3 на интактных животных, по 10 крыс в каждой возрастной группе, и с моделированием острой соматической боли (ОСБ), также по 10 крыс каждого возраста. Острый болевой синдром моделировали путем однократной двухминутной электрокожной стимуляции рецепторной зоны корня хвоста крыс со следующими параметрами, установленными на аппарате ЭСЛ-2 (электростимулятор лабораторный): амплитуда—50 В, частота тока — 100 Гц, длительность импульса —500 мс, задержка импульса—2 мс. Интенсивность болевого воздействия оценивали по характеру поведенческих и вегетативных реакций животного [4]. Через 2 мин после электростимуляции крыс декапитиро-вали и забирали материал для исследования цитологической картины крови и фагоцитоза.
При анализе лейкоцитарного профиля крови экспериментальных животных подсчитывали общее количество лейкоцитов (ОКЛ) в камере Горяева и лейкоцитарную формулу в абсолютном (профиль Машковского) и относительном (процентном—лейкограмма) выражении. Фагоцитарную активность лейкоцитов исследовали in vitro путем инкубации нативной крови с культурой золотистого стафилококка с последующим цитологическим исследованием мазков крови [5]. Изучали следующие показатели фагоцитоза: фагоцитарный индекс (ФИ) — процент лейкоцитов, активно участвующих в фагоцитозе, и фагоцитарное число (ФЧ) — среднее количество поглощенных
© В. Г. Овсянников, В. В. Алексеев, А. А. Кутузова, 2008
микробов в пересчете на один фагоцитирующий лейкоцит. Для более глубокого анализа изменений фагоцитарного звена иммунитета нами были использованы расчетные коэффициенты, которые вычислялись по следующим формулам:
• Фагоцитарный пул (ФП) — сумма фракций фагоцитирующих лейкоцитов по профилю Машковского (С + П + М / мкл).
• Фагоцитарная емкость (ФЕ) — коэффициент, связывающий ФИ, ФЧ и ФП, характеризующий общее количество микроорганизмов, поглощенных всеми фракциями фагоцитов в единице объема крови,— ФП (С + П+М) х (ФИ / 100) хФЧ.
• Моноцитарно-нейтрофильное соотношение (М/Н) — коэффициент, характеризующий изменения между основными клеточными популяциями фагоцитов,—М/(С+П).
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием /-критерия Стьюдента-Фишера при помощи программы «Stadia». Статистически достоверными считали отличия, соответствующие уровню значимости р<0,05.
Результаты исследования. Возрастные и реактивные (при ОСБ) изменения лейкоцитарного профиля крови и фагоцитарной активности лейкоцитов представлены в табл. 1, 2.
Для новорожденных крыс характерен относительно высокий показатель ОКЛ, однако к месячному возрасту у животных отмечалось уменьшение содержания клеток в 1,6 раза по сравнению с неонатальным периодом. У половозрелых крыс ОКЛ в 1,7 раза выше, чем у месячных животных, и практически равняется показателю у новорожденных крыс. Основной пул лейкоцитов во всех возрастных группах составили лимфоциты, количество которых, так же как и ОКЛ, изменялось фазно: достоверно уменьшалось к препубертатному возрасту и вновь возрастало у взрослых животных. У новорожденных крыс относительно других возрастных групп отмечался сдвиг лейкоцитарной формулы за счет повышенного содержания палочкоядерных нейтрофилов. В этой возрастной группе отмечалось повышенное содержание эозинофилов.
У крыс препубертатного возраста в крови на фоне уменьшения количества практически всех фракций лейкоцитов наиболее выражено снижение ПЯ в 2,5 раза и Мон в 2,9 раза. У взрослых животных в крови отсутствовали базофилы и эозинофилы. По сравнению с предыдущим возрастным периодом достоверно увеличивалось содержание ПЯ в 1,8 раза, ЛФ в 1,7 раза и особенно моноцитов — в 5,3 раза (табл. 1).
Возрастная динамика основных показателей фагоцитоза (ФИ и ФЧ) у интактных самцов крыс имеет однонаправленный взрастающий характер. Но от периода ново-рожденности к одномесячному возрасту эта тенденция выражена слабо и достоверна только по ФЧ (табл. 2).
У новорожденных животных отмечался достаточно высокий ФП, что прежде всего связано с повышенным содержанием нейтрофильных форм фагоцитов (ПЯ и СЯ). К препубертатному возрасту в связи с уменьшением количества лейкоцитов этот показатель уменьшался в 1,7 раза. Однако в связи с ростом показателя поглотительной способности клеток (ФЧ) фагоцитарная емкость крови у крыс второй возрастной группы изменялась незначительно, всего на 7 %. В то же время у месячных самцов величина М/Н была практически вдвое ниже по сравнению с новорожденными животными.
У половозрелых крыс по сравнению с животными препубертатного возраста существенно увеличились все исследуемые показатели фагоцитарной активности: ФИ и ФП — в 1,6 раза, ФЧ — в 3 раза, ФЕ — в 3,7 раза. За счет более выраженного по сравнению с другими клеточными элементами роста моноцитарной фракции вчетверо увеличивалось М/Н соотношение (см. табл. 2).
Таблица 1
Изменение лейкоцитарного профиля крови у крыс разного возраста при острой соматической боли, мкл
Возраст Серия Общ. колич. ПРОФИЛЬ МАШКОВСКОГО
лейкоцитов Б Э Мц Ю ПЯ СЯ ЛФ Мон
ня Контроль 4736±221 0 16 ±6,8 (0,3 %) 0 0 195 ±39,7 (4 %) 679 ±66,9 (14,3 %) 3698 ±158,3 (78,4 %) 143 ±28,3 (3 %)
7 Боль 7288±302+ 0 13 ±8,3 (0,2 %) 0 22 ±11,5+ (0,4 %) 503 ±59,9+ (7 %) 1503 ±51,2+ (21 %) 4845 ±241,5+ (67,8 %) 235 ±48,2+ (3,6 %)
ей дне Контроль 2968±321* 6 ±4,0 (0,2 %) 8 ±4,2 (0,3 %) 0 0 79 ±19,5* (2,5 %) 470 ±135,4 (14,5 %) 2355 ±203,4* (81,5 %) 49 ±9,1* (2 %)
5 т 1 0 т Боль 4474 ± 238+ 0 6 ±4,1 (0,2 %) 0 0 137 ±18,7+ (3,5 %) 663 ±89,4 (15,8 %) 3273 ±197,9+ (78,8 %) 71 ±8,9+ (1,7 %)
а Ё? с е Контроль 5070 ± 490* 0 0 0 0 140 ±20,3* (2,9 %) 580 ±60,2 (11,5 %) 4090 ±410,1* (80,5 %) 260 ±39,8* (5,1 %)
ме 7 т Боль 6110±1130 0 120 ±50,4+ (1,9 %) 0 120 ±50,1 (1,9 %) 140 ±39,9 (2,4 %) 710 ±89,1 (11 %) 4840 ±570,4 (78,6 %) 230 ±50,3 (4,2 %)
* Различия достоверны (р < 0,05) между возрастными группами интактных животных. + Различия достоверны (р < 0,05) между контрольной и опытной группами каждого возрастного периода.
Таблица 2
Изменения фагоцитоза у крыс разного возраста при острой соматической боли
Возраст Серия ФИ ФЧ Расчетные коэффициенты
ФП ФЕ М/Н
3-4 дня Контроль 50 ± 1,77 2,1 ± 0,14 1017 1084 0,16
Боль 47 ± 0,65+ 2,7 ± 0,10+ 2243 2835 0,12
30-35 дн. Контроль 54 ± 1,19* 3,1 ± 0,12* 599 1004 0,09
Боль 43 ± 1,01+ 2,1 ± 0,07+ 871 791 0,09
3-4 мес. Контроль 92 ± 6,32* 4,1 ± 0,25* 981 3678 0,36
Боль 88 ± 12,93 3,1 ± 0,61 1076 2904 0,27
* Различия достоверны (р <0,05) между возрастными группами интактных животных. + Рразличия достоверны (р <0,05) между контрольной и опытной группами каждого возрастного периода.
При остром ноцицептивном воздействии лейкоцитарная реакция у крыс разного возраста была неоднозначной. У животных младших возрастных групп ОКЛ при ОСБ достоверно увеличивалось, тогда как у взрослых крыс отмечалась лишь тенденция к увеличению этого показателя. В лейкоцитарном профиле у новорожденных при боли регистрировалось появление юных форм нейтрофилов. Достоверно возрастало содержание всех клеточных элементов, кроме эозинофилов и базофилов. Рост ПЯ, СЯ, ЛФ и Мон составил соответственно 158, 121, 31, 64 %. У месячных крыс при боли отмечался рост тех же клеточных элементов, что и у новорожденных животных, но менее выраженный во фракциях ПЯ — 73 %, СЯ — 41 % и Мон — 45 %.
У взрослых животных лейкоцитарная реакция при ОСБ характеризовалась следующими особенностями: регистрировалось появление значительного числа отсутствующих в норме эозинофилов и юных форм нейтрофилов, процентное содержание которых составляло 19,5. Содержание ПЯ форм оставалось неизменным, отмечалась слабая тенденция к росту СЯ нейтрофилов и ЛФ в среднем в 1,2 раза и уменьшение моноцитов (на 12 %), в отличие от младших возрастных групп, у которых количество моноцитов при боли значительно возрастало.
В фагоцитарном звене у новорожденных крыс при боли наблюдалась слабая тенденция к уменьшению ФИ при достоверном увеличении ФЧ в 1,3 раза и ФП более чем вдвое. За счет этих компонентов повышалась ФЕ крови, отмечался сдвиг в сторону нейтрофильных фракций фагоцитов: коэффициент МН уменьшался в 1,3 раза.
У месячных животных болевая реакция сопровождалась достоверным снижением ФИ на 20 %, ФЧ в 1,5 раза и ФЕ в 1,3 раза при росте ФП на 45 % по сравнению с контролем. У взрослых крыс реактивные сдвиги показателей фагоцитоза при ОСБ были менее выраженными, чем у крыс препубертатного возраста: уменьшение ФИ и ФЧ составляло соответственно 4 и 24 %, ФЕ снижалось в 1,3 раза, ФП возрастал на 10 % (см. табл. 2).
Обсуждение. Выявленные в наших исследованиях изменения лейкоцитарного профиля и фагоцитарного звена иммунитета у крыс разного возраста отражают основной принцип развития этих систем в ходе постнатального онтогенеза, согласно которому каждому возрастному периоду соответствуют свои закономерности цитострукту-ры белой крови и ее функциональной активности в осуществлении фагоцитарных реакций. У новорожденных крыс высокие фоновые показатели всех фракций лейкоцитов. Их резко выраженный рост при боли с четким регенеративным сдвигом влево свидетельствует об интенсивности ростовых и дифференцировочных процессов в лей-копоэтической системе и о ее высокой реактивности в неонатальном периоде. Как известно, физиологический и реактивный лейкоцитоз новорожденных является универсальным феноменом, роль которого, на наш взгляд, заключается прежде всего в компенсации низкой функциональной активности незрелой лейкоцитарной системы, что позволяет обеспечить необходимый уровень биологической защиты организма в период адаптации к условиям внеутробного существования. Это подтверждается и характером «неонатальной» фагоцитарной реакции на болевое воздействие, при котором, несмотря на стабильно низкое значение ФИ, существенное повышение «фагоцитарной емкости» крови обеспечивается за счет выраженного роста общего числа фагоцитов (ФП) и усиления их поглотительной способности (ФЧ). Однако эффективность подобной реакции невысока, поскольку известно, что в раннем возрасте нейтрофилы и моноциты не справляются с завершающей фазой фагоцитоза, что объясняет высокий риск возникновения септической патологии у грудных детей [6].
У интактных месячных крыс на фоне «физиологической» лейкопении и уменьшения процентной доли палочкоядерных нейтрофилов и моноцитов (относительно не-онатального периода) отмечается тенденция к повышению активности фагоцитарного звена, в основном за счет увеличения поглотительной способности фагоцитов. Это позволяет стабилизировать фагоцитарную емкость крови, несмотря на значительную редукцию общего фагоцитарного пула и низкий процент фагоцитирующих лейкоцитов.
При острой боли у крыс препубертатного возраста гиперреактивны все компоненты лейкоцитарного профиля, сочетающиеся с четко выраженной депрессией фагоцитарного звена: уменьшается процент участвующих в фагоцитозе лейкоцитов, их поглотительная способность и фагоцитарная емкость крови. Данная реакция отражает
экстенсивный вариант функционирования, когда возрастает число «рабочих» элементов, но эффективность их снижается [7].
У взрослых половозрелых крыс при повышении фоновых показателей всех ком -понентов лейкоцитарного профиля значительно «усиливается» фагоцитарное звено за счет роста общего пула фагоцитов, повышения в нем процентной доли моноцитов, увеличения фагоцитирующих лейкоцитов и их поглотительной способности. Реакция белой крови на ОСБ у животных данной возрастной группы — с резким регенеративным сдвигом, тенденцией к лейкоцитозу со слабо выраженными сдвигами зрелых форм лейкоцитов и ослаблению фагоцитарной активности.
Сравнительный анализ структурно-функциональных показателей белой крови у крыс разных возрастных групп в норме и при ОСБ выявил ряд закономерностей ее постнатального развития:
1) фазные изменения количественных показателей лейкоцитарного пула с физиологическим лейкоцитозом неонатального периода, уменьшением лейкоцитов в препубертатном возрасте и новым подъемом у взрослых животных;
2) изменение цитоструктуры лейкоцитарного профиля со снижением процентной доли ПЯ и ростом моноцитарного компонента;
3) поэтапный рост активности фагоцитарного звена к препубертатному возрасту
за счет усиления поглотительной способности фагоцитов, к зрелому возрасту также за счет увеличения процента фагоцитирующих лейкоцитов;
4) прогрессивное снижение к зрелому возрасту амплитуды стресс-реактивных сдвигов компонентов лейкоцитарного профиля и фагоцитарной активности с усилением тенденции к омоложению крови (рисунок).
Выявленные в работе особенности лейкоцитарной реакции у крыс разных возрастных групп при ОСБ отражают различный уровень адаптивных возможностей системы белой крови: нестабильность и низкую эффективность на ранних этапах постнатального онтогенеза; устойчивость цитостатических и функциональных параметров с высоким резервным потенциалом у взрослого организма.
М/Н
Контроль ^ Месячные
* — -I
j Новорожденные - - 1
\ ■ Взрослые
ФЧ
ФЕ
ФП
Реактивные сдвиги показателей расчетных коэффициентов фагоцитоза у крыс разных возрастных групп при острой боли (в % от контроля).
Summary
Ovsjannikov V. G., Alekseev V. V., Kutuzova A. A. Peculiarities of leucocytic reaction and phagocytosis at rats of different age under acute somatic pain.
To study the age-specific peculiarities of white blood and phagocytosis indices under acute somatic pain (ASP) the total quantity of leucocytes (TQL), leukocytic formula (LF) and phagocytic activity (PhA) of leucocytes of white male rats, which had been distributed into three age-specific groups: 3-4 days, 30-35 days and 3-4 months was investigated. Physiological leukocytosis of neonatal period (NP), tendency to leucopenia of prepubertal period (PP) and raising in adult animals (AA) were found in the control group of ASP Age-specific decrease of stab neutrophils and growth of monocytes were found in LF.
The increase of PhA in PP and mature age were discovered. Leukocytosis with regenerative shift and phagocytic reaction (PR) with low value of phagocytic index and increase of phagocytic number were found in NP by ASP The activation of all components of LF with depression of PhA was found in PP under the influence of ASP. Tendency to leukocytosis, regenerative shift of LF and inhibition of phagocytic activity occurred in AA by ASP. The investigation discovers the different level of adaptive possibilities of the body. Key words: ontogenesis, acute somatic pain, leukocytes, phagocytosis.
Литература
1. Пикуза О. И., Петрова Г. К., Адо Е. И. // Казан. мед. журн. 1990. № 4. С. 293-296.
2. Пикуза О. И., Маянский А. Н. // Там же. 1994. № 3. С.193-196.
3. ОсинА.Я., Маковецкая И.В. // Гигиена и санитария. 1990. № 12. С. 88-90.
4. Васильев Ю. Н., Игнатов Ю. Д., Качан А. Г., Богданов Н. Н. // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1979. № 11. С. 566-569.
5. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник // Под ред. В. В. Меньшикова. М., 1987. С. 310-311.
6. МазингЮ. А. // Арх. патол. 1991. Т. 53. Вып. 9. С. 70-73.
7. КузникБ. И. Физиология и патология системы крови. М., 2004. 296 с.
Статья принята к печати 19 декабря 2007 г.
