CC BY
25
оригинальные статьи Журнал фундаментальной медицины и биологии
УДК: 616-009.7-097:616.419
В.В. Алексеев, А.С. Авдалян, Л.В. Павленко, Н.С. Алексеева, М.В. Бликян, М.В. Абрамова
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ ИЗМЕНЕНИЙ В КРАСНОМ КОСТНОМ МОЗГЕ И АКТИВНОСТИ ЛИЗОЦИМА У НОВОРОЖДЕННЫХ И МЕСЯЧНЫХ КРЫС ПРИ ОСТРОЙ СОМАТИЧЕСКОЙ БОЛИ
Ростовский государственный медицинский университет, Кафедра патологической физиологии.
Россия, 344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29. E-mail: alexeev911@gmail.com
Цель: изучить особенности взаимосвязи изменений в красном костном мозге (ККМ) и активности лизо-цима (АЛ) у крыс новорожденного и месячного возраста после острой соматической боли(ОСБ).
Материалы и методы: ОСБ моделировали путем электростимуляции. Учет результатов производился на 2 и 60 минуте после ОСБ. Общее количество лейкоцитов (ОКЛ) определяли в камере Горяева, АЛ — по не-фелометрическому методу ДорофейчукаВ.Г., мазки ККМ окрашивали по способу Паппенгейма-Крюкова.
Результаты: у новорожденных крыс —усиление лейкопоэза, ОКЛ - подъем на 2минуте, затем снижение через 60 минут после ОСБ, АЛ - без изменений. У крыс месячного возраста — изменение со стороны эритроцитарного ростка кроветворения на 60 минуте, увеличение ОКЛ, двухфазная реакция активности лизоцима.
Заключение: у новорожденных животных активируется лейкопоэз, что приводит к увеличению ОКЛ, но АЛ не изменяется. У месячных животных реакция ККМ слабо выражена, а увеличение ОКЛ происходит, видимо, за счет выброса депонированных лейкоцитов, вызывая резкое повышение АЛ с его последующим снижением в ходе эксперимента. У новорожденных животных нет зависимости между изменениями в ККМ и АЛ, а у крыс месячного возраста прослеживается взаимосвязь между этими показателями.
Ключевые слова: острая соматическая боль; моделирование боли; лизоцим; общее количество лейкоцитов; миелограмма.
V.V. Alekseev, A.S. Avdalyan, L.V. Pavlenko, N.S. Alekseeva, M.V. Blikyan, M.V. Abramova
RESEARCH THE CORRELATION OF CHANGES IN THE BONE MARROW AND LYSOZYME ACTIVITY IN NEWBORN RATS AND MONTH OLD RATS BYACUTE SOMATIC PAIN
Rostov State Medical University, Department of pathological physiology.
29 Nakhichevansky str., Rostov-on-Don, 344022, Russia. Е-mail: alexeev911@gmail.com
Purpose: status of cell structureof bone marrow and white blood cells can accurately reflect the intensity of the immune system in acute pain and that has clinical and diagnostic value.
Aim: to study the characteristics of the relationship between changes in red bone marrow (RBM) and activity of lysozyme (AL) newborn rats and month old rats after acute somatic pain (ASP).
Materials and methods: ASP was modeled by electrical stimulation, analysis was carried out on 2 and 60 minutes after ASP. The total number of leukocytes (TNL) were determined in the Goryaev's camera, AL -values method of DorofeychukV.G., bone marrow smearswere stained by Pappenheim-Kryukov.
Журнал фундаментальной медицины и биологии оригинальные статьи
Results: in newborn rats - amplification of leucopoiesis, OCP - lifting after 2 minutes, then decrease in 60 minutes after ASP, AL - no changes. Changes from erythrocytes,the increase in the TNL, a second-phase reaction of ALwere found in month old ratsin 60 minutes after ASP.
Summary: leucopoiesisis activatedin newborn animals, which leads to an increase of TNL, but AL does not change. The reaction of RBM poorly expressed inmonth old rats, and the increase in the TNL is probably due to the release of deposited cells, causing a sharp rise of AL and its subsequent decline during the experiment. Newborn animals have no relationship between changes in RBM and AL, and month old rats can be traced to the relationship between these indicators.
Key words: acute somatic pain; modelling pain; lysozyme; the total number of leukocytes; myelogram.
Боль - это типовой патологический процесс, сопровождающий множество заболеваний, а также являющийся их ведущим симптомом. Острая соматическая боль (ОСБ) оказывает воздействие на организм, сопровождается изменениями со стороны многих функциональных систем [1,2]. При этом происходит мобилизация в кровь клеток костномозгового пула, а также активация фагоцитоза [3]. В ходе научного поиска нами обнаружено крайне мало сведений о влиянии ОСБ на красный костный мозг (ККМ) и активность лизоцима (АЛ) у младшей возрастной группы [4]. Этот вопрос представляет собой интерес, поскольку состояние цитострукту-ры костного мозга и белой крови может достоверно отражать напряженность иммунной системы в посттравматический период, что имеет клиническое и диагностическое значение.
Целью данного исследования явилось изучение особенности взаимосвязи изменений в красном костном мозге и активности лизоцима у крыс новорожденного и месячного возраста при остром болевом воздействии.
Материалы и методы
Исследования были проведены на базе проблемной научной лаборатории кафедры патофизиологии Ростовского государственного медицинского университета. Критерий включения: крысы, новорожденные, животные месячного возраста, самцы, перенесшие моделирование ОСБ. Критерий исключения: самки, наличие воспалительной реакции после моделирования боли. Было выполнено 90 экспериментов на нелинейных белых крысах двух возрастных групп: новорожденные (2-5 дней) и крысы месячного возраста (29-35 дней). Все экспериментальные животные рождались и росли в стационарных условиях вивария в режиме естественной освещенности и вскармливания: новорожденные - на грудном, месячные - на самостоятельном. Каждая возрастная группа делилась на две подгруппы: контрольная (15 животных) и экспериментальная, с моделированием ОСБ 3-4 степени интенсивности по Вальдману А.В. [5], Ва-
сильеву Ю.В. [6],Овсянникову В.Г. [7]. Данные, полученные от контрольной группы, расценивались как исходный фон. ОСБ моделировали путем электрокожного раздражения рецепторной зоны корня хвоста крыс с помощью электростимулятора ЭСУ-2 со следующими параметрами: частота тока - 100 Гц, амплитуда тока - 30 В, длительность импульса - 500 мс, задержка импульса - 2 мс и время стимуляции - 2 минуты. На основании анализа поведенческих и вегетативных реакций опытных животных оценивали интенсивность болевого раздражения в соответствии с общепринятыми критериями [5,6,7]. После болевого воздействия животные декапитировались через 2 и 60 минут.Затем осуществлялся забор материала. Лейкоцитарный состав крови исследовали общепринятыми микроскопическими методами. ОКЛ определяли путем прямого подсчета клеток в камере Горяева. Полученную с помощью центрифугирования сыворотку (20 минут, 1500 оборотов в минуту) использовали для исследования активности лизоцима по нефело-метрическому методу Дорофейчука В.Г. в нашей модификации (Ч 90%, С 55%) [8]. В этом случае об активности лизоцима судили по изменению степени светопропускания опытной микробной взвеси микрококка по сравнению с исходной. Учет изменений показателей осуществлялся на 2-й и 60-й минуте эксперимента. Цитоструктуру ККМ исследовали после приготовления мазков из костномозговой ткани с последующей окраской по Паппенгейму-Крю-кову (фиксатором — красителем Май-Грюнвальда и краской Романовского). При использовании иммерсионной системы светового микроскопа подсчитывали количество костно-мозговых клеток различных ростков кроветворения, в каждом препарате находили 500 клеток (5-6 полей зрения), определяли их процентное содержание, составляли миелограмму. Все манипуляции проводили в соответствии с приказом МЗ РФ №267 «Об утверждении правил лабораторной практики» от 19 июня 2003 г. Статистическую обработку данных по количественным признакам проводили по ^критерию Стьюдента для малых выборок. Результаты считали статистически достоверными при р<0,05.
Журнал фундаментальной медицины и биологии
оригинальные статьи
Результаты
В ответ на алгогенное воздействие у новорожденных крыс через 2 мин. отмечается достоверное увеличение лейкоцитов крови в 1,5 раза (табл. 1). Незначительно снижается АЛ. Через 60 минут происходит омоложение лейкоцитарной формулы за счет нейтрофильного компонента, увеличение
Лейкоцитарная формула у
числа моноцитов в 3,3 раза, снижение ОКЛ, не достигающее исходных значений, увеличение количества лимфоцитов по сравнению со второй минутой в 2,6 раза, и снижение АЛ с 0,434 ед. до 0,428 ед. (р>0.05). На всем протяжении эксперимента отмечается достоверное увеличение количества ми-елобластов и промиелоцитов и уменьшение числа зрелых нейтрофилов (табл. 2).
Таблица 1
новорожденных крыс, (%)
Б Эоз Мц Ю ПЯ СЯ Лф Мон
Контроль - 0,36+0,15 - - 4,0+0,5 14,27+1,05 78,36+1,64 3,0+0,47
2 минуты - 0,3+0,15 - 0,3+0,15 6,9+0,61 21,3+0,781 67,8+1,011 3,4+0,751
60 минут - 0,5+0,171 - 1+0,211 11,5+0,751 22,8+0,65 54,4+0,961 9,8+0,511
1 - р<0.005
Таблица 2
Миелограмма новорожденных крыс при острой соматической боли сильной интенсивности, %
Вид клеток Группа
Исходный фон Острое болевое воздействие
через 2 мин через 60 мин
Кол-во опытов 10 10 11
Миелобласты 4,32+0,18 5,81+0,141 6,28+0,21
Промиелоциты 3,43+0,11 4,36+0,131 4,86+0,151
Миелоциты 4,79+0,72 5,87+0,35 6,05+0,58
Метамиелоциты 4,96+0,29 6,43+0,68 4,52+0,21
Палочкоядерные лейкоциты 18,91+1,41 16,22+1,02 13,05+1,321
Сегментоядерные лейкоциты 4,99+0,35 4,03+0,58 2,72+0,111
В том числе эозинофилы 2,82+0,24 3,54+0,26 3,85+0,7
Эритробласты, пронормоциты 19,6+1,13 21,4+1,08 23,45+1,221
Нормоцитыбазофильные 7,68+0,72 6,09+0,53 8,42+1,01
Нормоцитыполихроматофильные 7,78+0,63 6,41+0,18 8,58+1,11
Нормоцитыоксифильные 1,19+0,24 1,03+0,32 2,02+0,21
Лимфоциты и их бласты 14,06+1,13 16,55+0,94 18,07+0,79
Моноциты и их бласты 4,46+0,42 4,51+0,5 3,28+0,47
Плазматические клетки, бласты 0 0,65+0,24 0,78+0,46
Мегакариоциты 0,37+0,03 0,43+0,1 0,41+0,08
Ретикулярные клетки стромы 0,21+0,09 0,32+0,07 0,27+0,05
Макрофаги 0,29+0,08 0,35+0,05 0,39+0,09
Тучные клетки 0 0 0
1 - р<0.005
Журнал фундаментальной медицины и биологии
оригинальные статьи
У крыс месячного возраста через 2 минуты после ОСБОКЛ увеличивается в 1,4 раза за счет ней-трофильного компонента. Продолжается рост к 60-й минуте по сравнению с контролем, лимфоциты снижаются в 1,03 раза (табл. 3). Цитоструктура костного мозга изменяется через час, после начала эксперимента, в частности, происходят изменения эритроцитарного ростка кроветворения и увеличе-
ние содержания макрофагов, в то время как ответной реакции со стороны клеток белой крови не наблюдается (табл. 4). АЛ уже на 2-й минуте возрастает в 2 раза с 0,191ед. до 0,378 ед.(р<005), но по истечению 1 часа резко снижается до 0,047 ед.(р<0.05). Через 60 мин. наблюдается сдвиглей-коцитарной формулы влево до юных форм нейтро-филов.
Таблица 3
Лейкоцитарная формула у месячных крыс,(%)
Б Эоз Мц Ю ПЯ СЯ Лф Мон
Контроль - 0,27+0,14 - - 2,55+0,43 14,55+1,73 81,0+1,83 1,64+0,2
2 минуты - - - - 3,5+0,471 15,8+1,551 78,92+1,811 1,75+0,22
60 минут - 0,4+0,15 - 0,6+0,2 3,5+0,471 20,3+2,231 72,0+2,811 2,9+0,641
1 - р<0.005
Таблица 4
Миелограмма крыс месячного возраста при острой соматической боли сильной интенсивности, %
Вид клеток Группа
Исходный фон Острое болевое воздействие
через 2 мин через 60 мин
Кол-во опытов 10 10 11
Миелобласты 2,16+0,16 2,98+0,8 2,11+0,20
Промиелоциты 2,42+0,14 2,93+0,16 2,22+0,19
Миелоциты 6,08+0,65 6,61+0,71 4,85+0,60
Метамиелоциты 4,45+0,42 4,48+0,35 2,42+0,111
Палочкоядерные лейкоциты 14,02+1,28 13,78+1,02 13,13+1,04
Сегментоядерные лейкоциты 14,39+1,35 13,45+0,98 11,56+0,67
В том числе эозинофилы 1,93+0,15 2,31+0,1 1,13+0,071
Эритробласты, пронормоциты 3,13+0,14 2,66+0,24 3,06+0,21
Нормоцитыбазофильные 6,65+0,62 7,43+0,51 8,98+0,361
Нормоцитыполихроматофильные 10,47+1,23 11,92+1,04 14,00+0,771
Нормоцитыоксифильные 4,03+0,44 5,36+0,62 6,01+0,431
Лимфоциты и их бласты 24,63+1,43 20,03+0,81 21,43+1,11
Моноциты и их бласты 4,05+0,47 4,11+0,37 4,03+0,23
Плазматические клетки, бласты 0 0,14+0,08 0,45+0,19
Мегакариоциты 0,46+0,03 0,45+0,04 0,70+0,03
Ретикулярные клетки стромы 0,57+0,12 0,92+0,08 3,34+0,201
Макрофаги 0,56+0,08 0,44+0,09 1,35+0,101
Тучные клетки 0 0 0,36+0,07
1 - р<0.005
оригинальные статьи
Журнал фундаментальной медицины и биологии
Вывод
В ответ на болевое воздействие организм новорожденных крыс уже через 2 минуты реагирует достоверным увеличением в крови числа лейкоцитов и активацией лейкопоэза в красном костном мозге. Данные изменения могут говорить о повышенной чувствительности иммунной системы новорожденных животных к неспецифическим воздействиям. АЛ у новорожденных животныхне изменилась в ходе эксперимента, видимо, это связано с низкой синтетической активностью лейкоцитов новорожденных и восполнением лизоцима с помощью материнского молока.
У животных месячного возраста уже через час мы видим значительный рост количества сегменто-ядерных лейкоцитов и моноцитов. Это объясняется тем, что нервная и иммунная системы месячных крыс уже практически в полной мере сформирована и как следствие этого, организм животных отвечает изменениями, соответствующими алгогенному воздействию, а именно, не происходит активации системы лейкопоэза, а необходимое количество лейкоцитов обеспечивается за счет их выброса из депо. АЛ увеличивается на первых минутах, но быстро истощается к 60 минуте, так как нет поддерживающих воспалительных стимулов для усиления синтеза лизоцима.
ЛИТЕРАТУРА
1. Стивен Б. Мак-Магон. Учебник боли, 6 изд.. 2013г, глава 46, стр. 629-644.
https://www.clinicalkey.c0m/#l/C0ntentPlayerCtrl/ аоР1ауСопГепГ/3-82.0-Б9780702040597000462/ (дата обращения: 10.09.2014 г.)
2. Овсянников В.Г. Общая патология. г. Ростов-на-Дону: РостГМУ, 2013. 288 с.
3. Абрамов Ю.Б. Иммунные аспекты центральных механизмов боли // Боль. - 2009. - №4(25) - С. 2-8.
4. Дж. П. Мор, Филип А. Вольф/Ход патофизиологии, диагностика и управление, 5 изд., 2011г. https://www.clinicalkey.eom/#l/ContentPlayerCtrl/ аоР!ауСо^еп^3^2.0-Б9781416054788100806/ (дата обращения: 10.09.2014 г.)
5. Вальдман А.В., Игнатов Ю.Д. Центральные механизмы боли. Л.: Наука, 1976. 191с.
6. Васильев Ю.Н. Анальгетические эффекты акупунктуры у крыс в свободном поведении и его изменение под алия-нием морфина и налоксона / Ю.В.Васильев, Ю.Д.Игнатов, А.Г.Кочан и др. // Бюлл.экспер.биол.и мед. - 1979. №11. -с.566-569.
7. Овсянников В.Г. Очерки патофизиологии боли. Ростов-н/Д.: «Цветная печать», 2003. 159с.
8. Овсянников В.Г., Шлык С.В., Алексеев В.В. и тд. Изменение уровня лизоцима при острой соматической боли у взрослых крыс // Медицинский вестник Юга России - 2013. -№3. - С.66-68.
